BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam kefarmasian dalam memisahkan

suatu campuran senyawa. Dalam kromatografi, koponen-komponen terdistribusi dala dua fase.

Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila

molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap di dalam pori-

pori partikel atau terbagi kedalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau didalam

pori.

Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan

dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi.

Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang

lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali

dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan

Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000 p.s.i). Dalam metode ini

digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30

μm dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1).

Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada

dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini

agak mahal.

Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan yang dapat memisahkan setiap

komponen dalam suatu campuran. Pemisahan ini didasarkan pada perbedaan migrasi setiap

komponen yang disebabkan karena perbedaan sifat interaksi dari setiap komponen pada fase

diam dan fase gerak. Berdasarkan fase geraknya metodee kromatografi terbagi menjadi

kromatografi cair dan kromatografi gas. Salah satu contoh dari pengembangan metode

kromatografi cair adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) atau kromatografi

Cair Kinerja Tinggi.

1

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi

kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui

tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan

penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang

mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-

molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-

komponen dalam campuran. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom

mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat

otomatis dan sangat peka.

Kromatografi Cair Tekanan Tinggi, HPLC merupakan bentuk kromatografi kolom yang

sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi,

mengukur dan memanjang. HPLC memanfaatkan kolom yang memegang chromatographic

bahan kemasan (tahap tak berubah), sebuah pompa yang bergerak selular fase (s) melalui kolom,

dan detektor yang menunjukkan ingatan waktu Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung

pada interaksi antara keadilan tahap, yang Molecules yang dianalisis, dan larutan (s) yang

digunakan. Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan

tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung mode

kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan.

HPLC yang dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada

penyangga halus yang distribusi ukurannya sempit (kolom) dan fase gerak yang dipaksa

mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga

menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relatif singkat. Resolusi adalah

pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat ditingkatkan dengan mengoptimasi

parameter-parameter HPLC yaitu retensi,selektifitas, dan efisiensi. Secara praktis parameter-

parameter HPLC tersebt dapat dioptimalkan dengan mengubah:

Komposisi dari fase gerak

Laju alir

Sifat kimia dari fase gerak

Jenis kolom

2

Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kualitatif dan kuantitatif. Untuk analisa kualitatif

dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram baku pembanding

berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan untuk analisa kuantitatif dapat ditentukan ddengan

menggunakan persamaan:

Cx = Ax/(Ap ×Cp)

Keterangan :

A = Peak Area = luas puncak

C = Konsentrasi

X = Sampel

P = Pembanding

Atau jika ingin memperoleh data yang lebih valid dapat pula ditentukan dengan menggunakan

kurva kalibrasi larutan standar.

Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka

HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara

termal tidak stabil.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa pengertian dari HPLC?

2. Bagaimana rangkaian alat HPLC dan fungsi dari masing-masing alat tersebut?

3. Apa yang menjadi prinsip dasar HPLC?

4. Apa saja Fase yang digunakan dalam HPLC?A

5. pa saja keunggulan dan Kelemahan dari HPLC?

6. Apa saja manfaat dari HPLC?

7. Bagaimana aplikasi penggunaan HPLC dalam kehidupan Sehari-hari?

1.3 Tujuan Penulisan Makalah

Tujuan penulisan makalah adalah untuk:

1. Memenuhi Tugas mata kuliah kimia analisis instrument

3

2. Menjelaskan pengertian,prinsip dasar,Fase,keunggulan,kelemahan,manfaat,serta aplikasi

dari HPLC

3. Menggambarkan Rangkaian alat HPLC dan menjelaskan bagian-bagian alat beserta

fungsinya

1.4 Manfaat Penulisan Makalah

Dapat mengetahui dan memperdalam segala hal yang berhubungan dalam HPLC

1.5 Metodologi Penulisan

Penulisan makalah ini disusun berdasarkan telaah pustaka dari literatur-literatur yang

sesuai dengan topik penulisan. Literatur-literatur yang digunakan merupakan literatur-literatur

yang bersifat primer (journal) dan sekunder (text book). Berdasarkan penelusuran literatur ini

kemudian diperoleh data yang bersifat primer dan sekunder.

Tulisan ini juga menggunakan metode kualitatif dengan menghasilkan data yang deskriptif

yang berupa kata-kata yang secara rasional. Prosedur pemecahan masalah dilakukan berdasarkan

pada permasalahan yang ada di dalam proses pembelajaran. Permasalahan yang menjadi dasar

dalam penulisan karya tulis ini timbul setelah diketahui bahwa sebagian mahasiswa kurang

memahami tentang HPLC (High Performance Liquid Chromatografi)

Meskipun didalam buku – buku telah banyak ditulis berkenaan dengan tentang HPLC

(High Performance Liquid Chromatografi) tetapi mahasiswa masih banyak yang belum

memahami materi tersebut, maka dari itu melalui makalah ini diharapkan dapat membantu

pemahaman mahasiswa tentang materi HPLC (High Performance Liquid Chromatografi)

Usaha pemecahan masalah dilakukan dengan cara mempelajari teori-teori yang

berhubungan dengan pokok permasalahan. Melalui telaah pustaka kemudian setelah itu

dijabarkan dalam bentuk makalah yang logis, dinamis, objektif dan realistis yang merupakan

pemikiran kritis mahasiswa berdasarkan pandangan kritis terhadap situasi dan kondisi yang

berkembang saat ini sehingga diperoleh kesimpulan tentang pemecahan masalah yang terjadi

secara keseluruhan.

4

BAB II

ISI

2.1 Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid chromatography,

HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan

tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan

molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan

dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini

sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa

mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan

detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu

tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007, HPLC adalah alat untuk

mengalisa kandungan bahan kimia, baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif. HPLC

sendiri singkatan dari High Performance Liquid Chromatography. Mulanya HPLC digunakan

untuk mengidentifikasi kandungan antibiotik pada susu dan daging udang, terutama

kroramfenikol. Tetapi HPLC kini digunakan pula untuk kegiatan perikanan lainnya. 

Kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)

Metode pemisahannya didasarkan pada perbedaan keseimbangan distribusi komponen sampel

antara dua fasa: diam (kolom) dan gerak (sistem pelarut yang mengalir). Tekanan tinggi

diperoleh dari pompa, meningkatkan mobilitas eluant. Tipe-tipenya adalah absorpsi, partisi,

pertukaran ion dan permeasi gel. Deteksi yang digunakan al. spektrofotometrik (absorpsi sinar

UV atau "tampak", fluorometri, penggunaan senyawa pendar/fluoresen, senyawa elektrokhemis

yang dapat teroksidasi atau tereduksi).

5

2.2 Rangkaian Alat HPLC

A. Kolom

Sebuah kolom sederhana memiliki

diameter internal 4.6 mm (dan

mungkin kurang dari nilai ini)

dengan panjang 150 sampai 250

mm. Kolom yang biasa digunakan

untuk analisa adalah bentuk kolom

fase balik. Kolom diisi dengan

partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon

panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai

contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar

dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-

rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam

larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya

untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan

gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan

kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana

halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya.

Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan

bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat

melalui kolom.

6

Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang

dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga

kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat

(Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida).

Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Kolom Yang Baik :

Kolom kuat dan tidak mudah berkarat

Pertikel isi kolom berdiameter Cecil dan seragam, bulat dan berpori

Efisiensi tinggi

Tahan terhadap tekanan tinggi

Menghasilkan puncak simetri dan sempit

Jenis Kolom :

Kolom polar

Kolom non polar

Pemeliharan Kolom :

Saring eluen dengan saringan membrane

Hindari pengaliran eluen dari arah sebaliknya

Gunakan kolom penagman

Simpan kolom pada pelarut yang sesuai

Cuci kolom sesudah digunakan

B. Komposisi Eluen

Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam

eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase

balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol.

7

Tempat Eluen. Botol yang tidak bereaksi dengan pelarut, dilengkapi penyaring. Eluen

harus disaring dengan saringan membran

C. Volume Injeksi

Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual

melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel

volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan

jarum suntik), step-flow injection, dan sampling value.

Injektor :

Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin

Mudah digunakan

Keberulangn tinggi

Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

D. Detektor

Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair

yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai

banyak pilihan detektor yang dapat digunakan.

Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :

a. Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul sampel

maupun fase gerak (bulk property detector).

Detektor dapat dibedakan menjadi :

Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah

detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak

murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga

dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang

8

sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan

suhu.

Detektor konduktivitas

Detektor tetapan dielektrika

b. Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut solute

property detector). Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :

Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,

Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)

Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada

absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak (untuk

detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang paling luas

digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang tinggi serta mudah

operasinya. Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-

senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang

sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih disesuaikan

dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang

gelombang UV yang digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa

organic menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut.

Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan

detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel

sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.

Detektor Polarografi dan radioaktif

Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran. Memerlukan pemisahan

Fase ferak terlebih dahulu. Termasuk didalamnya FID dan ECD.

Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu:

1. Detektor spektrofotometrik

Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya,

spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan

memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan

9

sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk

melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut.

Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detector yang sangat mahal,

sehingga dibutuhkan suatu kompromi. Dibandingkan dengan ribuan dollar yang harus

dikeluarkan untuk spektrofotometer yang hanya bahkan tergolong kelas dua saja, maka $2500

atau sekitar itu akan mendapatkan sebuah detector untuk memonitor larutan eluen kolom pada

254 atau 280 nm (harga-harga tahun 1989). Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan

spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinyu dan monokromator,

penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum

merkuri.

Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi, tetapi detektor-detektor

sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak kasus. Contohnya, protein yang menyerap semua

pada 280 nm akibat adanya rantai samping asam amino aromatik, dan hampir semua senyawa

aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi (yakni: purin, pirimidin, nukleosida,

nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada 254 nm.

Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat terlarut dan panjang

gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita dan panjang jalan yang melewati sel

detektor, tetapi sebagai pedoman kasar, detektor ultraviolet akan dapat “melihat” kuantitas

nanogram, bisa kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih sensitiv daripada detektor indeks

bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak sensitif terhadap temperatur.

2. Detektor Fluorometrik

Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling

serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu

jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan

monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan

emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah

menggunakan penyaring pada sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan

panjang gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan

fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik

polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan

10

neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana

komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu

contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram

setelah reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin).

3. Detektor Elektrokimia

Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan

polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solut

yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organic maupun anorganik.

Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut

mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga, dimana

komponen-komponen smpel mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah

digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular dari

jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan

asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial

+0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya

melewati semacam jembatan garam.

4. Desain detector

Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan kolom,

harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa

pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa

mikroliter.

5. Pemilihan detektor

Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada

persyaratan sebagai berikut :

cukup sensitive

stabilitas dan keterulangan tinggi

respon linear terhadap solute

11

waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir

relibilitas tinggi dan mudah digunakan

tidak merusak cuplikan

Dari berbagai macam detector yang ada detektor indeks bias merupakan

Satu-satunya detektor pada HPLC yang universal, tetapi kurang sensitiv dan sangat peka tehadap

perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan panjang gelombang yang variabel merupakan

pilihan yang paling baik bagi sekelompok besar obat-obatan. Dalam hal-hal yang sangat spesifik

dapat digunakan detektor-detektor fluorometer dan elektrokimia.

6. Analisis Kuantitatif

Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu menghasilkan sinyal yang mempunyai

korelasi linier dengan konsentrasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut,

konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitas sinyal yang ditunjukkan dalam

kromatogram.

Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitu dengan mengukur peak height dan peak

area. Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak height atau peak area dari suatu

kromatogram menjadi konsentrasi dari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan membuat

kurva baku dengan cara-cara external standard, internal standard dan standard addition.

Kromatografi Cair Tekanan Tinggi, HPLC merupakan bentuk kromatografi kolom yang sering

digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur

dan memanjang. Ada dua tahap dalam analisis dengan menggunakan HPLC yaitu proses

separasi/pemisahan dan identifikasi. Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kuantitatif

dan penentuan kualitatif. Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis

HPLC adalah jenis kolom, komposisi eluen (jenis dan perbandingan), volume injeksi (volume

sampel loop), detektor, dan chart speed (bila manual).

HPLC memberikan peranan yang besar dalam kehidupan, antara lain: banyak digunakan pada

industri farmasi dan pestisida ; zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar

sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair ; asam-asam nukleat

dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis

12

zat berpori; morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX ;

dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air ; digunakan untuk menentukan berat

molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

Aplikasi analisis dari HPLC dalam kehidupan antara lain : analisis anion nitrat (NO3-),

analisis vitamin C, analisis ekstrak etanol rimpang tanaman Zingiberaceae, pengukuran tingkat

kematangan buah manggis, dan pendugaan kandungan senyawa bioaktif atau senyawa penciri

beberapa tanaman obat.

Syarat Detektor :

Tahan noise dan drift rendah

Sensitivitas tinggi

Respon cepat

Tidak sensitif terhadap perubahan pelarut

Mudah pengoperasiannya dan tahan lama

E. Chart Speed

Diagram kecepatan dapat diketahui bila sampel diinjeksikan secara manual.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( High Performance Liquid Chromatography) (HPLC)

13

2.3 Prinsip Dasar HPLC

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah

memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan

dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya

hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah

proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor

yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

Menurut JULIA K., 1996 dalam ISMAIL HENDRA, 2007, prinsip kerja dari HPLC

adalah pemisahan absoprsi dan desorpsi yang berulang kali dari komponen yang dipisahkan.

Pada saat komponen tersebut dibawa oleh fase gerak mengalir sepanjang kolom. Pemisahan ini

terjadi karena adanya perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing komponen yang

didasarkan oleh adanya perbedaan koofisien distribusi dari komponen tersebut antara kedua fasa.

Prinsip dari HPLC ini adalah dinamika dan migrasi dengan meggunakan dua fasa. HPLC

biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul tinggi dan tidak

menguap,dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga

pemisahan semakin baik.

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi

kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui

tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material

terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar

berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan

pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode

pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka.

HPLC berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan

diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50µm sedangkan laju aliran

14

dipertinggi dengan tekanan yang tinggi. Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan

kualitatif dan penentuan kuantitatif.

Penentuan Kualitatif

HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi.

Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.

Penentuan Kuantitatif

Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara

kuantitatif adalah:

o Parameter percobaan sama antara standar dan sampel

o Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama

o Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan

standar seri pada waktu retensi tertentu.

- Berdasarkan area kromatogram

- Berdasarkan tinggi puncak kromatogram

Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram

akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram

dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan

menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk

sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap

diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih

mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya

melalui proses pelarutan saja.

15

2.4 Fase HPLC

HPLC adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair, dapat

digunakan untuk pemisahan sekaligus untuk analisis.

Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya KCKT dibagi menjadi:

Fasa normal : Fasa gerak kurang polar dibandingkan fasa diam

Fasa Terbalik : Fasa gerak lebih polar dibandingkan fasa diam

Fase normal HPLC

Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya

heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari

nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada

silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang

non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar

melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik

berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan

alkohol seperti metanol.

Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar

dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-

rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam

larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya

untuk bergerak bersama dengan pelarut.

16

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan

gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan

kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana

halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya.

Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan

bergerak lambat dalam kolom.

Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

Proses Fase balik HPLC

Diagram alir HPLC

Injeksi sampel

Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui

apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya

dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut

sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan

sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.

17

Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa,

waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran

partikel)

komposisi yang tepat dari pelarut

temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi

sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang

mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika

anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada

sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang

diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati

melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak

mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan

menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

18

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang

dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya

menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan

yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak

mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.

Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk

membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah

mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa

yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui

jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa

tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari

senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area

ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang

berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan

sama. Misalnya,

19

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu

berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam

sebuah campuran (X dan Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat

mengatakannya jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X.

Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y

mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin

ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak

yang kecil.

2.5 Keunggulan dan Kerugian HPLC

KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan koefisien kolom dan kecepatan analisis.

KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak

cairan dan fasa diam cairan atau padat. Kelebihan KCKT antara lain adalah :

1. Dapat dilaksanakan pada suhu kamar

2. Cepat dan mudah melaksanakannya.

3. Peka, detector KCKT dapat divariasi dan unik

4. Pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya.

5. Ideal untuk molekul besar dan ion

6. Mudah memperoleh cuplikan

7. Daya pisahnya baik

20

8. Waktu analisa cukup singkat

9. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/ kerusakan bahan yang dianalisis

10. Kemampuan pemisahan cukup tinggi

Beberapa keunggulan HPLC dibanding alat lain:

• HPLC dilengkapi dengan adanya pompa. Pompa ini menghasilkan tekanan sekitar 400 atm

untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan sehingga memperingan kerja kolom

dan juga pemisahansehingga waktu lebih sedikit. pada pompa dikenal dua system dalam teknik

pemisahan yaitu isokratik dan gradient,namun gradient lebih berisifat akurat karena masing-

masing pompa mengatur laju alir larutan yang berbeda.

• HPLC memiliki keunggulan kolom. Dimana kolom HPLC ini lebih pendek dan lebih kecil

dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom HPLC ≤ 4.6 mm sehingga dapat

memberikan permukaan kontak yang lebih luas diman mempengaruhi sempurnanya pemisahan

yang semakin baik. Dan panjang kolom HPLC adalah 150-250 mm. dan yang perlu diingat

adalah kolom HPLC dapat digunakan kembali dengan cara direnerasi dengan mencucinya hingga

bersih dengan pelarut yang sesuai.

• HPLC mempunyai detector yang amat sangat sensitive dan peka. HPLC memiliki beberapa

detector misalnya:

Detector ultraviolet

Detector fluorometrik

Detector elektrokimia

• Waktu retensi

Waktu yang dibutuhkan senyawa untuk melalui kolom hingga ke detector disebut waktu retensi

yang diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan

ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.biasanya dipengaruhi oleh :

21

Tekanan yang digunakan

Kondisi dari fase diam

Komposisi pelarut yang tepat

Temperature kolom

• Kromatogram

Kromatogram menunjukkan hasil yang didapat. Kromatogram yang diinginkan adalah

kromatogram yang lurus tinggi dengan lebar sekecil mungkin. Bukan dengan bentuk

lainnya,karena bentuk tersebut menandakan pemisahan dilakukan dengan sangat baik. Namun

dalam kromatogram kita menemukan beberapa puncak kecil atau yang mengganggu dan disebut

denga noise. Noise muncul jika sampel kita ataupun pelarut yang kita gunakan belum pure,belum

murni dari pengotor-pengotor yang mungkin tidak sengaja masuk kedalamnya.

Fasa gerak dalam HPLC memegang peranan penting karena sangat akan mempengaruhi kepada

pemisahan,jadi ada beberapa criteria yang harus dipenuhi fasa gerak :

Murni,tidak ada pengotor

Sesuai dengan detector dan sampel

Tidak bereaksi dengan wadah

Harga murah dan mudah mendapatkannya

Sedangkan kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :

1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu

2. Hanya bisa digunakan untuk asam organic

3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi

4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

5. Sering ada larutan yang tertinggal di injektor

2.6 Manfaat HPLC

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis, untuk pemurnian (misalnya untuk

keperluan sintesis.HPLC digunakan untuk analisis senyawa non-volatile termasuk sampel ionik

22

dan polimerik.HPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan pada industri

farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar

dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat

dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapiskan

zat berpori.Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia dan penukar ion klasik. Asam-

asam nukleat telah terpisahkan pada PLB, waktu analisisnya lebih pendek. Morfin, heroin dan

semacamnya telah dapat dipisahkan pada resin Zipax-SAX. Penukar ion gel silica yang

dimodifikasi secara kimia mempunyai kapsitas tukar tinggi, vitamin-vitamin yang larut dalam air

misalkan telah dapat dipisahkan.Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan

kolom panjang, tujuan utama kerjanya tetap sama yaitu penentuan berat molekul polimer dan

masalah-masalah biokimia. Pada umumnya teknik ini dapat digunakan pada setiap metode kolom

kromatografi. Selain itu HPLC juga digunakan Untuk menentukan konsentrasi suatu sampel dan

Untuk menganalisa zat cair seperti glukosa, vitamin dan air limbah

HPLC digunakan untuk memisahkan golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala

jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC berhasil paling baik untuk senyawa yang

dapat dideteksi di daerah spectrum UV atau spectrum sinar tampak(Harbone, 1987 :19).

HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas

campuran yang sangat rumit dan oleh jarena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran

rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi

komponen-komponennya (hostettmann, dkk, 1995:77).

HPLC juga digunakan untuk asam organik, seperti asam formiat dan asam asetat. Jika sampel

mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa

larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat

dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

23

2.7 Aplikasi HPLC dalam Kehidupan Sehari-hari

Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :

1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan

pestisida.

2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat

dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan

dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

5. Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.

6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel diinjeksi dengan

syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja

HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi.

Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam yaitu biasanya H2SO4

0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan

matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan

berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak untuk mengetahui kadar analit.

Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang diplotkan dengan least square.

Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum menggunakan HPLC untuk analit, kita

harus membuat kurva standar terlebih dahulu dengan menggunakan larutan standar.

Gradien elusi memisahkan analit bergantung pada afinitas elektron sesuai fungsi dari afinitas

elektron analit sebagai fase bergerak relatif terhadap fase diam. Hal ini sesuai dengan ekstraksi

liquid-liquid, namun berjalan secara kontinu. Sesuai dengan prinsip tersebut maka komponen

yang hidrofob dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol tinggi, sedangkan

komponen yang hidrofil dari analit akan keluar dari kolom pada kondisi metanol rendah.

Setelah itu sampel dikeluarkan dari HPLC dan ruangan pembuangan dari HPLC ini dicuci

dengan asam asetat.

24

2.7.1 Analisis Anion Nitrat (NO3-)

Nitrat sebagai hasil proses alami atau industri akan bisa memasuki bahan alam atau bahan

industri seperti air yang sangat dibutuhkan manusia atau untuk kebutuhan industri. Kandungan

dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi kualitas air tersebut. Untuk itu diperlukan

suatu metode analisis yang teruji untuk mengukur kandungan nitrtat tersebut. Dengan

menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dan dengan pengembangan metode dapat

diketahui validitas penggunaan HPLC untuk analisis anion nitrat. Dari beberapa model

pemutakhiran HPLC diketahui metode analisis HPLC dengan kolom IC Pak Anion serta eluen

campuran Na-Borat glukonat : Butanol : Asetonitril (1:1:10) dan detektor Konduktivitas dapat

menganalisis ion nitrat dalam air tangki reaktor, dengan batas deteksi 3,661 ppm dan sensitivitas

0,01 ppm serta uji recovery 110,41+ 1,59%.

2.7.2 Analisis Vitamin C

Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin C, yakni dalam

menentukan susunan kimianya.Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933 oleh

ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari USA dan

Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk oksidasi (bentuk

dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai aktivitas biologi. Dalam makanan

bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat terus teroksidasi menjadi diketogulonic

acid yang inaktif.

2.7.3 Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae

Rimpang tanaman Zingiberaceae pada umumnya mengandung metabolit sekunder golongan

minyak atsiri sebagai zat kandungan yang menguap dan golongan lain berupa zat yang tidak

menguap dan bahkan pada beberapa Curcuma spp. dan Kaempferia spp. terdapat komponen

utama yang terkristalkan dari ekstrak total yang diuapkan pelarutnya (etanol, heksan) sebagai

komponen utama. Banyaknya komponen kandungan dalam rimpang dengan berbagai polaritas

menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi instrumental dengan selektifitas (resolusi)

yang tinggi, kromatografi cari kinerja tinggi (HPLC) untuk komponen yang termolabil, seperti

25

dilakukan untuk stabilitas kandungan gingerol dari rimpang Jahe dan andrografolid dari

Sambiloto.

Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi dibutuhkan cara eluasi gradient,

dengan program menurun polaritasnya, yaitu mulai dari 10% metanol sampai metanol 100% dan

pada umumnya ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan ionisasi senyawa metabolit

sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti prinsip pasangan ion.

Sampel analisis HPLC dibuat dari simplisia rimpang bentuk serbuk dimaserasi-perkolasi dengan

pelarut bahan sampai diperoleh perkolat 10 kali berat bahan. Perkolat diuapkan dengan rotavapor

sampai diperoleh kepekatan 1 ml ekstrak = 1 gram serbuk simplisia, diperoleh suatu ekstrak

total. Sebelum ekstrak dianalisis HPLC, dilarutkan kembali dalam metanol ( 10X), kemudian

dilakukan filtrasi melalui " Sepak " (SPE C18 1 X 1 cm) untuk selanjutnya diinjeksikan sejumlah

20 ul ke HPLC.

Kondisi HPLC dalam penelitian adalah sbb.: Eluasi dilakukan gradien pada kondisi awal

Solvent-A (As-fosfat 0,1 N dalam aquabidestillata) : Solvent B (Metanol pro HPLC) = 90 10;

kemudian program gradien linear selamn 35 menit menuju 100% Metanol, dilanjutkan 15 menit

Metanol 100%, dilanjutkan program pencucian kolom dengan 40% MetOH selama 10menit, dan

diakhiri kembali kekondisi awal (10% MetOH) dalam waktu 5 menit. Kromatogram direkam

selama total waktu 60 menit. Setiap kali injeksi bahan uji (ekstrak) memerlukan waktu 75 menit,

kemudian dapat langsung diinjeksikan bahan uji berikutnya. Analisis HPLC dilakukan pada

setiap sampel ekstrak dengan kondisi eluasi dan deteksi pada panjang gelombang 254 nm 365

nm. Analisis data : Sidik jari HPLC masing-masing ekstrak dianalisis dan dibedakan berdasarkan

jumlah puncak komponen dan waktu retensinya untuk dicari karakterisasinya jika ada dalam

campuran atau dalam produk.

Dari hasil pengamatan kromatogram, dapat disimpulkan bawah pada ekstrak

C.domestica, C.xanthorrhiza dan C.zedoaria, jumlah puncak pada 254nm sama dengan jumlah

puncak yang muncul pada 365nm juga dan jumlah puncak pada 365nm lebih besar dari pada

jumlah puncak 254nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC terbaik

digunakan deteksi pada 365nm. Pada ekstrak Alpinia galanga, Z.cassumunar, Z.zerumbet dan

26

K.galanga, jumlah puncak pada 365nm sama dengan jumlah puncak yang muncul pada 254nm

juga dan jumlah puncak pada 254nm lebih besar dari pada jumlah puncak 365nm, sehingga

untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC terbaik digunakan deteksi pada 254nm. C

heyneana, C aeroginosa, Z offinalis, K pandurata, K angustifolia dan K rotunda jumlah puncak

yang muncul sama pada 254nm dan 365nm lebih kecil dari jumlah puncak pada 254nm dan pada

365nm, sehirigga untuk pembuatan sidik jari kromatogram HPLC harus digunakan kombinasi

deteksi pada 254nm clan 365nm.

2.7.4 Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis

Mutu buah-buahan segar saat ini umumnva masih dievalusi secara manual yang menggunakan

tanda-tanda visual seperti warna kulit. Hasil evaluasi visual yang hanya menilai sifat fisik bagian

luar ini tidak selalu mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah. Bila

ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus digunakan cara kimia basah (HPLC) yang

bersifat merusak. Dalam menanggulangi masalah ini perlu dilakukan suatu penelitian mengenai

teknologi tertentu yang dapat dimanfaatkan untuk menentukan mutu bagian dalam buah-buahan

secara tidak merusak.

Hasil penelitian tugas akhir yang telah dilakukan menunjukkan bahwa metode ultrasonik

dapat dipakai untuk menentukan tingkat kematangan buah manggis secara tidak merusak.

Berdasarkan basil kalibrasi 80 buah manggis, kecepatan gelombang ultrasonik yang merambat

melalui buah manggis untuk tiap tingkat kematangan mempunvai nilai yang berbeda-beda. Buah

manggis yang masih mentah mempunyai kecepatan gelombang ultrasonik rata-rata 337.4 m/s,

untuk buah setengah matang 369.1 m/s, buah matang 397.4 mis, serta untuk buah Iewat matang

mempunyai nilai kecepatan rata-rata 449.6 mis. Nilai kecepatan rata-rata gelombang ultrasonik

yang merambat pada tiap tingkat kematangan buah digunakan untuk membuat suatu persamaan

empiris. Persamaan ini menghubungkan tingkat kematangan terhadap kecepatan gelombang

ultrasonik untuk memperkirakan tingkat kematangan berdasarkan ultrasonik. diperoleh Tk =

0.0268 V 7.9258.

Persamaan empiris yang diperoleh diuji dengan pengukuran kecepatan pada berbagai

kondisi buah dengan warna visual yang beraneka ragam. Berdasarkan basil uji coba 100 buah

27

manggis diperoleh perbedaan perkiraan kematangan antara ultrasonik dan warna kulit. Perbedaan

tersebut mencapai 21%, hal ini menunjukkan bahwa warna kulit belum tentu mencerminkan

tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah.

2.7.5 Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa Tanaman

Obat

Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui antara lain melalui metode

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan FTIR (Fourier Trasfrorm Infrared).

Penentuan kandungan senyawa aktif atau senyawa penciri dilakukan melalui proses yang

panjang meliputi penghancuran bahan, pelarutan, dan pengukuran dengan HPLC dan FTIR.

Proses ini memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal. Untuk itu sangat diperlukan metode

yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan. Alternatif cara penentuan lain yang

menyatakan hubungan antara kandungan senyawa aktif atau penciri hasil pengukuran HPLC

dengan data hasil pengukuran FTIR (absorban).

Ketersediaan model ini akan menghemat waktu dan biaya. Pada tahun pertama dilakukan

penentuan metode ekstraksi terbaik untuk senyawa aktif Gingerol dan Kurkumin yang berasal

dari hasil pengamatan contoh petani jahe dan temulawak daerah Kulonproggo dan Karanganyar.

Pada tahun pertama penyusunan model kalibrasi menggunakan dua sumber yaitu data simulasi

dan data pengamatan petani jahe dan temulawak daerah Kulonprogo dan Karanganyar.

Pendekatan terbaik untuk kalibrasi yang diperoleh pada tahun pertama digunakan untuk

penyusunan model kalibrasi data persentase transmitan Gingerol dan Kurkumin tanaman hasil

percobaan pada tahun kedua. Model kalibrasi yang diperoleh pada tahun kedua merupakan

model terbaik berdasarkan data simulasi, data hasil pengamatan (Karanganyar dan Kulonprogo)

serta data hasil percobaan. Pada tahun ketiga dilakukan validasi model kalibrasi yang diperoleh

apda tahun sebelumnya dengan cara menerapkannya pada data konsentrasi dan persentase

transmitan Gingerol dan Kurkumin yang berasal dari hasil pengamatan jahe dan temulawak yang

diambil dari contoh Bogor, Cianjur, Kuningan, Majalengka dan Sukabumi.

28

2.7.6 Penetapan kadar Curcuminoid dengan metode HPLC-fluoresensi

Curcuminoid terdiri dari curcumin (C), demethoxycurcumin (DMC), dan

bisdemethoxycurcumin (BDMC). Nama lain curcumin adalah [(1E,6E)-1,7-

bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)hepta-1,6-diene]. Senyawa-senyawa ini

terdapat dalam tanaman kunyit (Curcuma longa L.). Senyawa mempunyai

pigmen  kuning yang terdapat pada rizoma. Kunyit biasanya dipakai

sebagai bumbu dan pewarna alami di daerah Asia selatan dan Asia

tenggara. Ternyata curcumin dilaporkan memiliki banyak aktivitas seperti antiinflamasi,

antikanker, antioksidan, antiangiogenik dan imunomodulator. Penelitian juga menunjukkan

curcumin sebagai agen chemotherapeutic potensial sebagus untuk pengobatan dan pencegahan

Alzheimer’s.

Begitu luas manfaat curcuminoid, padahal kualitasnya ditentukan oleh kandungan curcuminoid,

so diperlukan metode analisa yang reliable untuk penetapan curcuminoid dalam produk kunyit.

Metode yang sudah digunakan antara lain dengan HPLC deteksi UV/VIS pada panjang

gelombang sekitar 260 or 450 nm. Kelebihan metode ini yaitu instrumennya simpel, cukup

sensitif untuk penentuan curcuminoid pada rhizoma Curcuma, produk kunyit atau sediaan herbal.

Namun ada kelemahannya yaitu metode tidak selektif, sehingga menyita waktu untuk preparasai

sampelnya, juga memerlukan elusi gradien yang ruwet. Sebenarnya ada metode yang selektif

yaitu HPLC-MS, tapi alatnya mahal.

Padahal ternyata curcuminoid itu sendiri berfluoresens, sehingga bisa digunkan detektor

fluoresens (FL) yang lebih sensitif dan selektif dibanding detektor UV (bisa mencapai 10 x lebih

sensitif).

2.7.7 Skala Scoville, Mengukur Kepedasan Cabai

Cabai sendiri ada berbagai macam, kalau di kita mungkin mengenal cabai rawit, cabai merah,

cabai hijau, ada juga cabai yang keriting dan kalau di belahan bumi lain ada paprika, ada

pimento, jalapeño, habañero dan lain sebagainya semuanya dengan kadar kepedasan yang

berbeda2.

29

Namun tahukah anda bahwa di dunia ini ada satuan guna mengukur kepedasan sebuah cabai??

Ya, satuan tersebut dinamakan satuan scoville yang diambil dari nama seorang farmakolog

Amerika Serikat bernama Wilbur L. Scoville (1865 – 1942).

Skala scoville ini mengukur konsenstrasi sebuah zat dalam sebuah cabai yang bernama

capsaicin, zat inilah yang bertanggungjawab memberikan rasa pedas pada sebuah cabai.

Sekarang kita mempunyai satuan scoville untuk mengukur kepedasan suatu cabai seperti halnya

kita mempunyai satuan kilometer untuk mengukur panjang atau kilogram untuk mengukur berat,

lantas bagaimana caranya mengukur kepedasan cabai? Apakah cabai dimakan begitu saja lalu

dinilai kepedasannya?? Tentu tidak sepenuhnya begitu, karena panca indera manusia adalah alat

pengukur yang buruk dan kurang presisi. Namun walaupun begitu pengukuran kepedasan cabai

pada awalnya masih melibatkan panca indera manusia.

Pada tahun 1912 ketika Wilbur Scoville menemukan skala ini, ia melakukan pengukuran

kepedasan suatu cabai dengan cara sebagai berikut:

Larutan ekstrak/sari cabai dilarutkan ke dalam air yang diberi gula sampai pedasnya tidak terasa

lagi, sudah pedas tidaknya sebuah cabai yang diuji ini biasanya dilakukan oleh lima orang

penguji. Jadi satuan scoville menunjukkan berapa kali sebuah cabai harus dilarutkan dalam air

gula (dalam jumlah tertentu yang standard) sampai zat capsaicin-nya semua larut yang membuat

cabai tersebut menjadi tidak pedas lagi.

Nah, karena dengan metode pengukuran seperti di atas masih melibatkan panca indera manusia,

tentu saja pengukuran masih dapat terjadi bias dan kurang obyektif (selain pengukuran cara di

atas kurang praktis) untuk itu pengukuran kepedasan cabai pada saat ini menggunakan metode

yang canggih yang dinamakan High Pressure Liquid Chromatography atau High Performance

Liquid Chromatography (HPLC) yang menihilkan keterlibatan panca indera manusia dalam

pengukuran kepedasan cabai. Metode ini cukup kompleks untuk dijabarkan sehingga tidak akan

dijelaskan secara detail dalam makalah ini.

Dari eksperiment menunjukan bahwa bell pepper (termasuk juga paprika) mempunyai skala

scoville 0 (nol), ini berarti bell pepper tidak pedas sama sekali karena tidak mempunyai zat

capsaicin. 

30

Sedangkan cabai rawait (Thai pepper atau bird’s eye pepper) atau kalau di Malaysia sering

disebut ‘chili padi’ mempunyai skala scoville 50.000 hingga 100.000. Nah ternyata dari tabel di

atas cabai rawit hanyalah cabai ‘kelas menengah’ dalam dunia cabai.

Sedangkan cabai Amerika habañero mempunyai kepedasan sekitar 2 sampai 7 kali dari cabai

rawit. Bahkan salah satu jenis atau spesies habañero yaitu Red Savina habañero bisa 10 kali lebih

pedas dari cabai rawit.

Namun cabai alami yang memegang rekor dunia kepedasan datang dari daerah Assam di India

yaitu Naga Jolokia (semua gambar cabai2 tersebut ada di atas) yang skala scoville-nya sampai di

atas satu juta!

2.8 Penerapan Penelitian HPCL

Penelitian berjudul penentuan kadar glukosa dan fruktosa pada madu randu dan madu

kelengkeng dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: air deionisasi, larutan standar

glukosa 5% dan larutan standar fruktosa 5%. Sampel penelitian adalah madu randu dan madu

kelengkeng yang telah memenuhi standar SII dari merk yang sama. Tiap jenis madu digunakan

dua buah sampel dan tiap sampel dilakukan pengukuran sebanyak dua kali.

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: seperangkat alat KCKT (buatan ICI

Instruments) yang dilengkapi dengan detektor indeks bias (Shodex RI SE-61) serta integrator

merek (Shimadzu CR6A Chromatopac; labu ukur 20 mL, 25 mL; pipet volume 1,0 mL, 2,5 mL,

5 mL, 10 mL, 25 mL; alat sentrifugasi; kertas saring 0,45 mikrometer.

Cara kerja pembuatan larutan standar. Larutan standar glukosa dan fruktosa dibuat dengan

konsentrasi masing-masing 5% b/v. Adapun cara pembuatannya adalah sebagai berikut:

1. masing-masing senyawa (glukosa dan fruktosa) ditimbang sebanyak 1 g.

2. Senyawa-senyawa tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 20 mL, kemudian ditambah

aquades sampai tanda batas (kadar glukosa dan fruktosa masing-masing 5% b/v).

31

Dari konsentrasi tersebut dapat dibuat campuran dengan konsentrasi masing-masing 1%, o,5%,

0,25%, dan 0,125% dengan cara:

1. campurkan glukosa dan fruktosa 1% ke dalam labu ukur 50 mL, dipipet masing-masing

10,0 mL larutan fruktosa 5%, ditambah 10,0 mL larutan glukosa 5%. Ditambah dengan

aquades sampai tanda batas.

2. campurkan glukosa dan fruktosa 0,5% ke dalam labu ukur 50 mL, dipipet masing-masing

5,0 mL larutan fruktosa 5%, ditambah 5,0 mL larutan glukosa 5%. Ditambah dengan

aquades sampai tanda batas.

3. campurkan glukosa dan fruktosa 0,25% ke dalam labu ukur 50 mL, dipipet masing-

masing 2,5 mL larutan fruktosa 5%, ditambah 5,0 mL larutan glukosa 5%. Ditambah

dengan aquades sampai tanda batas.

4. campurkan glukosa dan fruktosa 0,125%. Campuran glukosa dan fruktosa 0,25% pada(c)

dipipet 25,0% mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL. Campuran tersebut ditambah

dengan aquades sampai tanda batas.

Masing-masing campuran glukosa dan fruktosa tersebut disaring dengan kertas saring 0,45

mikrometer.

Penentuan kondisi HPCL untuk pemisahan glukosa dan fruktosa. Kondisi analisis untuk

penentuan kandungan gglukosa dan fruktosa pada sampel madu adalah pada kondisi pemisahan

yang terbaik. Kondisi tersebut tercapai jika hasil kromatogram masing-masing komponen tidak

tumpang tindih satu dengan yang lainnya. Hal ini dapat dicapai dengan mengatur suhu kolom

dan laju alir dari eluen. Kondisi pemisahan dapat ditentukan pada saat pengukuran larutan

standar, di mana eluen yang digunakanadalah air deionisasi pada kolom metacarb 87 C dan

dideteksi dengan mengunakan detektor indeks bias.

Pembuatan kurva standar. Larutan standar glukosa dan fruktosa 0,125% diinjeksikan sebanyak

20 mikroliter dengan menggunakan auto syringe injector. Biarkan sampai semua komponen

keluar dan terpisah dari kolom. Waktu retensi untuk masing-masing komponen (glukosa dan

fruktosa) dicatat. Langkah tersebut diulangi dengan menginjeksikan 20 mikroliter larutan standar

32

glukosa da fruktosa 0,25% kemudian dengan larutan standar 0,5% dan 1%. Plot hubungan antara

konsentrasi larutan standar dengan luas puncak dari masing-masing komponen.

Tumpang tindih satu dengan yang lainnya. Hal ini dapat dicapai dengan mengatur suhu kolom

dan laju alir dari eluen. Kondisi pemisahan dapat ditentukan pada saat pengukuran larutan

standar, di mana eluen yang digunakanadalah air deionisasi pada kolom metacarb 87 C dan

dideteksi dengan mengunakan detektor indeks bias.

Pembuatan kurva standar. Larutan standar glukosa dan fruktosa 0,125% diinjeksikan sebanyak

20 mikroliter dengan menggunakan auto syringe injector. Biarkan sampai semua komponen

keluar dan terpisah dari kolom. Waktu retensi untuk masing-masing komponen (glukosa dan

fruktosa) dicatat. Langkah tersebut diulangi dengan menginjeksikan 20 mikroliter larutan standar

glukosa da fruktosa 0,25% kemudian dengan larutan standar 0,5% dan 1%. Plot hubungan antara

konsentrasi larutan standar dengan luas puncak dari masing-masing komponen.

33

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

1.Kromatografi Cair Tekanan Tinggi, HPLC merupakan bentuk kromatografi kolom yang sering

digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur

dan memanjang.

2.Ada dua tahap dalam analisis dengan menggunakan HPLC yaitu proses separasi/pemisahan

dan identifikasi.

3.Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kuantitatif dan penentuan kualitatif. Beberapa

parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah jenis kolom,

komposisi eluen (jenis dan perbandingan), volume injeksi (volume sampel loop), detektor, dan

chart speed (bila manual).

4.HPLC memberikan peranan yang besar dalam kehidupan, antara lain: banyak digunakan pada

industri farmasi dan pestisida ; zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar

sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair ; asam-asam nukleat

dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis

zat berpori; morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX ;

dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air ; digunakan untuk menentukan berat

molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

5.Aplikasi analisis dari HPLC dalam kehidupan antara lain : analisis anion nitrat (NO3-), analisis

vitamin C, analisis ekstrak etanol rimpang tanaman Zingiberaceae, pengukuran tingkat

kematangan buah manggis, dan pendugaan kandungan senyawa bioaktif atau senyawa penciri

beberapa tanaman obat.

6. Beberapa poin positive dari alat kinerja tinggi kromatografi (HPLC) adalah :

Tingkat resolusi yang amat tinggi

34

Waktu yang digunakan sedikit

Detector amat peka

Kolom dapat digunakan kembali dengan cara diregenerasi

Ideal untuk zat berberat molekul tinggi dan memiliki titik didih tinggi.

7. Beberapa sampel yang dapat dianalisis dengan HPLC :

Asam amino

Asam organic

Hidrokarbon aromatic

Protein

Karbohidrat

Vitamin

Seyawa lain berberat molekul tinggi dan titik didih tinggi.

3.2 Saran

Setelah mengetahui dan mempelajari tentang HPLC ini diharapkan dapat mengaplikasikannya

dalam kehidupan sehari-hari.

35

DAFTAR PUSTAKA

A-hong. 2009. Kromatografi HPLC. http://ahongincoment.blogspot.com/2009/06/kromatografi-hplc.html. (online) diakses pada tanggal 10 April 2010.

Anonim. 2007. Analisis Protein. http://barifbrave.wordpress.com/2009/05/23/analisa-protein/.(online) diakses pada tanggal 10 April 2010.

Anonim. 2010. Kromatografi Ferporma tinggi. http://www.google.co.id/search?hl=id&q=pengertian+dari+kromatografi+cair+kinerja+tinggi&start=10&sa=N (online) diakses pada tanggal 10 April 2010.

Clark, jim. 2009. Kromatografi cair tingkat tinggi. http://www.chem-is- try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_gas_cair/.(online) diakses pada tanggal 10 April 2010.

Fygy’s. 2009. Alat-alat dilaboratorium Instrument. http://fygy.wordpress.com/2009/04/11/alat-alat-di-laboratorium-instruments/. (online) diakses pada tanggal 10 april 2010.

Liliksetiono. 2009. Kromatografi. http://liliksetiono.wordpress.com/2009/05/05/kromatografi/. (online) diakses pada tanggal 10 April 2010.

Net,Cephy. 2008. Kromatografi cair kinerja tinggi. http://cephy-net.blogspot.com/2008/11/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-hplc_27.html. (online) diakses pada tanggal 10 April 2010

Rafizanisa. 2009. Analisis HPLC dan Aplikasinya. http://rafizanisa.blogspot.com/2009/12/analisis-hplc-dan-aplikasinya.html.(online) diakses pada tanggal 10 April 2019.

Wandi,setia. 2010. Kromatografi dan HPLC. http://setiawandi3052.blogspot.com/2010/04/kromatografi-dan-hplc.html. (Online) diakses pada tanggal 10 April 2010.

Widanengsih,niknik. 2008. Kromatografi cair kinerja tinggi. http://niknikwidanengsih.blogpot.com/2008/12/kromatografi-cair-tingkat-tinggi.html. (online) diakses pada tanggal 10 April 2010.

36