LABORATORIUM ANALITIKSEMESTER GENAP TAHUN AJARAN 2014/2015

PRAKTIKUM KROMATORAFI

MODUL : HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

PEMBIMBING : Drs. Edi Wahyu Sri Mulyono, M.Si..

Oleh :Kelompok : II

Nama : 1. Citra Pranata Niaga 131431005

2. Dina Heryani 131431006

3. Dini Heryani 131431007

4. Febby Elsa Nabila 131431008

Kelas : 2A

PROGRAM STUDI DIPLOMA III ANALIS KIMIA

JURUSAN TEKNIK KIMIA

POLITEKNIK NEGERI BANDUNG

2015

Praktikum : 22 Mei 2015

Penyerahan (Laporan) : 29Mei 2015

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam

teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang

bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu

padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba

memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi

kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-

daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir

bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-

fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang

menjelaskan tentang proses kromatografi.

Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan

suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir

tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar

kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan

Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang

baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan

Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat

umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada

tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai

kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas

dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar,

pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur

biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha

dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi

kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau

Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja

Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil

dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan

pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan

suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam

keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan

cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

I.2 Tujuan

Dapat mengetahui komponen-komponen instrumentasi HPLC

Dapat mengetahui prinsip kerja HPLC

Dapat mengoprasikan HPLC sesuai SOP

Dapat melakukan analisa sampel dengan menggunakan alat HPLC

BAB II

LANDASAN TEORI

2.1 Karakteristik Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak

destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Yang

paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada KCKT

digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah

berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu

retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-

puncaknya terpisah.

Prinsip dasar dari KCKT, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap

komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung

berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya

hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode KCKT. Yang

pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi.

Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

Kromatografi merupakan pemisahan fisiko kimiawi. Pemisahan ini dapat terjadi kalau

interaksinya berulang. Kita dapat mengetahuinya dengan kuantitas ulangan yang

dinyatakan dengan teori plate (terjadi pada setiap lempeng, banyaknya lempeng

dinyatakan dengan N).

2.2 Prinsip Kerja KCKT

Kerja KCKT pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan

kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu

sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya

adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran

analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke

detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang

puncak-puncaknya terpisah.

Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa

terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol

< golongan asam.

KCKT dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara

yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time

(RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah

sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah

spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D

yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat

tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis

di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah

kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18

yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya.

Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti

kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa

karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat

dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses

identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam

kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis

komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai

kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk

(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.

Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample

yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari

impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung

komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja

Seleksi Tipe KCKT

Analisis (pengguna KCKT) sebelum mengoperasikan KCKT, harus membuat

keputusan tipe yang mana yan gharus dipilih yang dapat memberikan informasi yang

diinginkan.

Skema I : Seleksi tipe KCKT adalah suatu petunjuk umum untuk seleksi tipe KCKT .

Informasi ini akan memudahkan para analis untuk memutuskan pemelihan tipe KCKT

yang memberikan para analis untuk memutuskan pemilihan tipe KCKT yang

memberikan kemungkinan terbaik pada pemisahaan yang diinginkan. Namun, sampel

yang tidak dikenal (unknown) akan menyulitkan pemilihannya tipe KCKT.

Informasi seperti kelarutan, gugus fungsi yang ada, besarnya Berat Molekul dapat

diperoleh dari pembuat informasi, pemberi sampel, atau data spektroskopik seperti

nucleic magnetic resonance Spectrosphotometer, infra red spectrophotometer, ultra

violet spectrumeter, dan mass

Spectrophotometer. Semua data-data ini dapat digunakan sebagai petunjuk bagi analis

memilih tipe HPLC yang tepat untuk digunakan.

2.3 Instrumentasi KCKT

Komponen-komponen penting dari KCKT dapat dilihat pada Gambar dibawah ini :

Fase gerak d

Gambar 1. Komponen penting KCKT

Pompa (Pump)

Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua

tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan

konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua,

yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan

suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam

pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor

yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah

ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak

berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

Injektor (injector)

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang

minimum dari material kolom. Ada dua model umum :

a. Stopped Flow

b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem

tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam

cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b. Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada

Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir.

Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi

Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat

menyebabkan penyumbatan.

c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih

besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor

yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi

LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan,

maka sampel akan masuK ke dalam kolom.

Kolom

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung

pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi

menjadi dua kelompok :

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis

material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50

-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5

cm.

b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang

kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur

kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk

kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung

pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid

Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution

Chromatography, EC)

Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam

kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor

yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar

respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu

kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan,

tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang

gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang

lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada

kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan

detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:

- Detektor Fluorometer - Detektor Spektrofotometer Massa

- Detektor lonisasi nyala - Detektor Refraksi lndeks

- Detektor Elektrokimia - Detektor Reaksi Kimia

Sistem penyuntik

Teknik penyuntikan harus dilakukan dengan cepat untuk mencapai ketelitian

maksimum analisis kuantitatif. Yang terpenting sistem harus dapat mengatasi tekanan

balik yang tinggi tanpa kehilangan terokan. Pada saat pengisian terokan, terokan

dialirkan melewati lekuk dan kelebihanya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat

penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati lekuk ke kolom.

Tendon pelarut

Tendon pelarut atau fase gerak mempunyai ciri yaitu bahan tendon harus lembam

terhadap berbagai fase gerak berair dan tak berair. Sehingga baja anti karat jangan

dipakai pada pelarut yang mengandung ion halida dan jika harus bertekanan, hindari

menggunakan gelas. Daya tampung tendon harus lebih besar dari 500 ml yang dapat

digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir yang umumnya 1 – 2 ml/menit.

Elusi Gradien

Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis

kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu

retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi

gradien dijelaskan oleh Snyder.

Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :

a. Total waktu analisis dapat direduksi

b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih

dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari

bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam praktek,

gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.

Tabel. Mode Kompatibilitas dengan Gradien

Gradien Mode Solven Gradien

Kromatografi Cair padat (LSC) Ya

Kromatografi ekslusi Tidak

Kromatografi Penukar Ion (IEC) Ya

Kromatografi Cair Cair (LLC) Tidak

Kromatografi Fasa Terikat (BPC) Ya

Pengolahan Data (Data Handling)

Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram

pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3. 2 berikut ini

Gambar 2. Kromatogram dari senyawa 5’ Nukleotida

Dari Gambar di atas waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni

bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi

kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional

dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.

3.9 Fasa gerak

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu

dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada

solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat

disukai, yaitu rasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah

BAB III

METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

HPLC

Syringe

Aquadest

Metanol p.a

0,5% toluene dalam metanol

3.2 Prosedur Kerja

3.2.1 Analisis dengan HPLC

3.2.2 Mengaktifkan HPLC

3.2.3 Conditioning HPLC

3.2.4 Mematikan HPLC

BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

Tabel 1. Hasil Pengukuran Sampel Toluena 0,5% dalam Methanol

No. Komposisi fasa gerak(Metanol : Aquades)

Volume sampel yang diinjeksikan (uL)

Ret Time[min]

Width[min]

Area Height

1 99 : 1 10 1.341 0.0435 2644.70752 970.16730

2 99 : 1 20 1.344 0.0448 4909.58594 1729.23853

3 99 : 1 30 1.350 0.0451 5391.94141 1879.35938

4 90 : 10 40 1.645 0.0492 2937.82031 948.24231

5 90 : 10 50 1.646 0.0515 4880.93506 1481.17737

6 90 : 10 60 1.656 0.0525 5597.80273 1658.60327

4.2 Pembahasan

Kromatografi merupakan suatu metoda pemisahan campuran komponen (senyawa)

dalam komponen penyusunnya dengan cara komponen penyusunnya tersebut terdistribusi

diantara fasa diam atau fasa gerak. HPLC merupakan salah satu metode kromatografi Cair

dimana HPLC juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dengan menentukan berapa

banyak senyawa dalam komponen tersebut. Berdasarkan prinsip kerjanya HPLC dapat

memisahkan senyawa sesuai kepolarannya. Fasa diam yang digunakan yaitu kolom yang

berisi silica yang telah dimodifikasi, sedangkan fasa gerak yang digunakan yaitu terdapat 2

komponen yaitu air dan methanol yang divariasikan. HPLC dapat digunakan untuk analisa

kualitatif maupun kuantitatif. Namun pada praktikum kali ini yaitu analisa kualitatif dengan

melihat pengaruh komposisi fasa gerak dan volume sampel yang diinjeksikan terhadap peak

kromatogram.

Pada kromatografi terdapat empat bagian yang tersusun secara bertingkat. Pada

tingkat paling atas merupakan Degasser yang berfungsi untuk mengeluarkan udara yang

terjebak pada selang larutan fasa gerak, setelah itu ada pompa yang berfungsi memompa atau

mengalirkan fasa gerak yang digunakan, kemudian ada tempat kolom sebagai tempat

menyimpan kolom atau fasa diam, dan pada tingkat paling bawah ada detektor. Karena pada

HPLC yang digunakan adalah detector UV-Vis, maka yang diukur adalah serapan cahaya

oleh larutan yang keluar dari dalam sampel. Pada detektor ini digunakan sinar UV pada

panjang gelombang 254 nm atau 366 nm.

Sampel yang digunakan yaitu toluene standar dengan konsentrasi 0,5% dalam

methanol. Pengukuran dilakukan dengan panjang gelombang 254 nm, karna identifikasi

sampel menggunakan sinar UV pada panjang gelombang tersebut. Pada praktikum dilakukan

variasi pada komposisi fasa gerak, yaitu dengan komposisi methanol:air sebesar 99:1 dan

dengan komposisi fasa gerak dengan perbandingan methanol:air 90:10. Pada perbandingan

methanol:air = 90:10 menghasilkan waktu retensi yang lebih lama dibandingkan dengan

perbandingan methanol:air = 99:1. Hal tersebut terjadi karena sampel yang digunakan adalah

0,5% toluene di dalam methanol, sehingga semakin banyak komposisi methanol di dalam

fasa gerak akan menyebabkan sampel akan semakin cepat keluar. Hal tersebut yang

menyebabkan waktu retensi perbandingan 99:1 memiliki waktu retensi yang lebih kecil

dibandingkan dengan perbandingan 90:10.

Selain itu, volume sampel yang diinjeksikan akan mempengaruhi waktu retensi. Pada

saat praktikum sampel yang diinjeksikan, divariasikan dengan volume 10-30 μL. Terlihat

waktu retensi dari toluene dengan perbedaan volume injeksi menyebabkan waktu retensi

semakin besar, karna berdasarkan teoritis bila volume yang diinjeksikan semakin banyak

maka waktu retensi akan semakin besar.

BAB V

KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan

Perbandingan konsentrasi dapat mempengaruhi waktu retensi

Jumlah volume yang diinjeksikan dapat mempengaruhi waktu retensi, semakin

banyak volume yang diinjeksikan semakin besar nilai waktu retensi.

DAFTAR PUSTAKA

Bassett, J, dkk. 1994. Buku Ajar Vogel. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.

S.M Khopkar, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta, 1990:147-157

Robert C. Reynolds and C. Allen O’Dell, J. Chem. Educ., 1992, 12: 989-991