I

POLIPLOIDI KROMOSOM BAWANG MERAH

(Allium cepa fa. ascalonicum )DENGAN INDUKSI KOLKHISINLANDASAN TEORIPoliploidi

Poliploidi adalah keadaan bahwa individu memiliki lebih dari dua genom. Poliploidi lebih banyak dijumpai pada tumbuhan dan jarang terdapat pada hewan karena hewan memiliki kromosom kelamin sehingga poliploidi akan menyebabkan terjadinya kelainan pada keseimbangan seks, keguguran atau lahir dalam keadaan mati. Sifat-sifat umum tanaman poliplidi adalah tanaman kelihatan lebih kekar, rogan-organ tanaman menjadi lebih besar, jaringan-jaringan penyusun organ juga tampak lebih besar. Terjadinya poliploidi dialam dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya faktor alami dan karena sengaja campur tangan manusia (diinduksi oleh senyawa tertentu). Secara alami, poliploidi terbentuk karena terjadi kelipatan somatis yaitu pada saat sel-sel mengalami pemisahan yang tidak teratur selama mitosis sehingga menghasilkan sel-sel meristematis yang menyebabkan kelipatan jumlah kromosomnya tetap berada dalam generasi baru dari tanaman tersebut. Selain karena kelipatan somatis, juga disebabkan karena sel-sel reproduktif padat mengalami reduksi yang tidak teratur atau mengalami pembelahan sel yang tidak teratur sehingga kromosom-kromosom tidak memisah secara sempurna. Sedangakan secara sengaja dibuat, umumnya orang-orang menginduksi terjadinya poliploidi menggunakan zat-zat kimia tertentu seperti asenaften, kloralhidrat, sulfanilamid, etil-merkuri-klorida, heksklorosikloheksan dan kolkhisin atau menggunakan cool water dan pemberian panas.

Pada percobaan kali ini digunakan zat kimia kolkhisin karena sering digunakan dalam penelitian-penelitian poliploidi, lebih efektif, mudah didapat dan mudah larut dalam air. Sementara zat-zat kimia yang lain hanya dapat larut dalam gliserol.

Poliploidi mempunyai dua tipe, antara lain : autopoliploid dan allopoliploid. Autopoliploid yaitu apabila genom yang sama mengalami kelipatan (misalnya : n1 + n1), dapat dibedakan tanaman yang triploid (3n), tetraploid (4n), pentaploid (5n), dst. Sedangkan jika allopoliploid yaitu apabila genom-genom yang berbeda berkumpul melalui hibridisasi (misalnya : m1 + m2).

Kokhisin

Kolkhisin (C22H25O6N) merupakan suatu alkaloid yang berasal dari umbi dan biji tanaman Autum crocus (Colchicum autumnale Linn.) yang termasuk dari famili Liliaceae. Kolkhisin bersifat racun, terutama pada tumbuhan memperlihatkan pengaruhnya pada nukleus yang sedang membelah. Larutan kolkhisin dengan konsentrasi yang berbeda akan memperlihatkan hasil yang berbeda pula terutama pada jumlah kromosom sel yang diberi perlakuan kolkhisin. Dalam penggunaan kolkhisin, tidak ada ukuran tertentu mengenai besarnya konsentrasi larutan kolkhisin yang harus digunakan, juga mengenai lamanya waktu perlakuan. Keduanya bergantung pada bahan yang akan dipakai dalam percobaan, karena masing-masing bahan mempunyai kemampuan dalam menyerap larutan kolkhisin yang berbeda-beda. Pada umumnya kolkhisin dapat bekerja efektif pada konsentrasi 0,001-1,00% dalam waktu 3-14 jam.

Jika dilihat dari morfologi tanaman yang diberi perlakuan kolkhisin maka akan tampak lebih indah, kuat dan bunga-bunga yang dihasilkan jau lebih besar, warna lebih cerah dan lebih indah. Jika konsentrasi larutan kolkhisin dan lamanya waktu perlakuan kurang mencapai keadaan yang tepat, maka poliploidi belum dapat diperoleh. Sebaliknya, jika konsentrasi terlalu tinggi atau waktu perlakuan terlalu lama, maka kolkhisin akan memperlihatkan pengaruh yang kurang baik, yaitu penampilan tanaman jauh lebih jelek, sel-sel banyak yang rusak atau bahkan menyebabkan matinya tanaman.

Mikrotubulus

Mikrotubulus merupakan tabung protein panjang, berlubang dan relatif liat. Ukuran diameter kurang lebih 24 nm dan tebal dinding 5 nm. Panjangnya bervariasi tetapi dapat tumbuh 1000 x dari tebalnya dan tersusun oleh protein tubulin (dimer ( dan ( tubulin). Tubulin tersebut mengalami polimerasi menjadi protofilamen dan tiap protofilamen mempunyai polaritas yaitu ujung ( sebagai ujung positif yang bebas di sitosol sedangkan ujung ( tubulin sebagai ujung negatif ang tertanam dalam sentrosom. Tiap mikrotubulus terdiri dar 1 protofilamen yang saling paralel, sepa terurai (melepas protein dimer) dan terntuk kembali. Dapat dijumpai pada sel hewan dan tumbuhan di sekitar inti sel.

Pada saat pembentukan mikrotubulus, tahap awal merupakan tahap nukleasi (perlu tubulin, Mg2+, GTP dan pada suhu 37oC. Alfa dan beta tubulin bergabung membentuk heterodimer, heterodimer bergabung satu sama lain membentuk oligodimer , kemudian oligodimer memanjang membentuk protofilamen. Tiap dimer tubulin membawa GTP (sumber energi) pada beta tubulin dan oligodimer membentuk cincin mikrotubulus.Terdapat dua kelompok protein penggerak pada mikrotubulus, yaitu kinesin yang bergerak ke arah ujung positif dan dyneins yang bergerak ke arah ujung negatif. Beberapa peranan mikrotubulus pada saat mitosis-metafase adalah

1. mikrotubulus dari dua arah sampai terbentuk ukuran yang sama

2. penggerak mikrotubulus melekat pada kinetokor pada kromosom, ke arah ujung negatif yang berperan adalah dynein yang akan terjadi pemendekan mikrotubulus sedangkan ke arah ujung positif yang berperan adalah kinesin yang akan terjadi pemanjangan mikrotubulus3. lengan kromosom menggunakan kinesin yang berbeda untuk bergeraak ke bidang ekuatorial

Pemisahan kromosom pada saat mitosis-anafase terjadi pemisahan sister kinetochores dan masing-masing membawa kromatida. Kromatida bergerak pada mikrotubulus dengan adanya dynein kemudian mikrotubulus memendek. Benang spindel yang saling overlap bergerak melewati satu dengan yang lainnya (mendorong daerah kutub saling menjauhkan diri) dengan bantuan konesin kemudian masing-masing kromatidda berhenti pada kutub yang brlawanan.PEMBAHASAN DAN HASIL

a. Pembahasan cara kerja Pada praktikum kali bertujuan untuk mengetahui rentang waktu pembelahan sel (mitosis) pada tanaman bawang merah (Allium cepa fa. ascalonicum ), mengetahui pada jam berapakah fase prometafase ditemukan sehingga jika telah diketahui dapat mengukur jumlah kromosom dan mempelajari efek pemberian kolkhisin terhadap jumlah kromosom bawang merah Digunakannya sampel bawang karena diketahui bahwa bawang mempunyai kromosom yang besar-besar, selnya relatif besar, selaput dinding selnya transparan dan jam pembelahannya berkisar antara pukul 8.00 sampai 14.00 WIB, sehingga diharapkan mendapatkan preparat kromosom yang mudah untuk dilihat menggunakan mikroskop cahaya

Pada praktikum kali ini digunakan perlakuan (treatment) menggunakan kolkhisin 0,05 % dan praperlakuan (pre treatment) menggunakan kolkhisin 0,03 %. Fungsi dari perlakuan (treatment) ini adalah dengan menggunakan kolkhisin 0,05% mampu mencegah pembentukan benag spindel dan mencegah pembentukan sel plate, sehingga jumlah kromosom berlipat ganda (poliploidi) Praperlakuan diberikan sebelum dilakukannya preparasi kromosom yang bertujuan agar supaya kelihatan menyebar dan kromosom tampak kondens sehingga harapannya kromosom tampak jelas dan dapat dihitung pada saat prometafasenya

Perlakuan dilakukan pada saat bawang dikecambahkan, sebelumnya kolkisin yang sebagai perlakuan diencerkan sampai dengan 0,05% dengan akuades kemudian dimasukkan dalam petri disk dan bawang dikecambahkan didalamnya selama kurang lebih 24 jam sampai tumbuh akar kemudian ujung akar dipotong kurang lebih 3-4 mm, hasil perkecambahan dapat diamati dalam gambar dibawah ini :

Gambar 1. Perbandingan hasil perkecambahan bawang merah dengan kolkhisin (a) dan tanpa kolkhisin (b)

Dipotong pada bagian ujung akar karena pada bagian inilah letak sel-sel meristem apikal yang mempunyai aktivitas pembelahan sel dan mudah mendapatkan sel-sel meristemnya, dapat juga yang dipotong adalah pada bagian ujung daun akan tetapi mengalami kesulitan untuk tepat mendapaktan sel meristem apikalnya

Setelah dipotong, kemudian dilakukan praperlakuan menggunakan kolkhisin yang telah diencerkan dalam akuades dengan konsentrasi 0,03 % dan dimasukkan dalam tabung flakon serta disimpan dalam suhu kurang lebih 4oC, sementara spesimen yang tidak diberi praperlakuan, langsung difiksasi dengan asam asetat 45 % Sehingga pada acara praktikum kali ini ada 3 macam jenis specimen yang akan dipreparasi antara lain :

1. kontrol, dengan praperlakuan kolkhisin 0,03%

2. perlakuan kolkhisin 0,05% dengan praperlakuan kolkhisin 0,03%, dan

3. perlakuan kolkhisin 0,05% tanpa praperlakuan

Ketiga specimen diatas kemudian dipreparasi untuk melihat kromosomnya dengan langkah-langkah dan metode yang sama yaitu :

Setelah dipotong kemudian difiksasi dengan larutan asam asetat 45 % yang telah dimasukkan dalam botol flakon dan simpan dalam suhu 4oC selama 15 menit. Fiksasi ini bertujuan untuk mengikat, memelihara, mengawetkan dan mempertahankan sel-sel didalam ujung akar bawang yang telah dipotong agar didapatkan keadaan pembelahan sel sama seperti pada saat akar tersebut dipotong, selain itu fiksasi juga berfungsi untuk mencegah keadaan post mortem yaitu keadaan yang ditimbulkan oleh adanya pemotongan jaringan atau organ dan keadaan ini dipicu oleh enzim proteolitik yang dapat menghancurkan sel-sel, adanya fiksasi dan suhu dingin maka enzim tersebut dapat non aktif sehingga sel-sel masih tetap segar sama seperti saat dipotong

Dalam proses fiksasi menggunakan larutan asam asetat 45 % karena penetrasinya cepat, tidak menimbulkan kotoran dan tidak merusak sel maupun kromosom

Penyimpanan dalam suhu 4oC bertujuan untuk mencegah enzim proteolitik bekerja atau akan menonaktifkan enzim proteolitik sehingga sel-sel tetap segar, tidak busuk selain itu akan mengkondenskan kromosom dan disimpan dalam waktu 15 menit karena waktu ini adalah waktu yang sangat tepat untuk kerja asam asetat jadi merupakan waktu yang optimal (setelah dilakukan beberapa kali percobaan)

Setelah 15 menit berlangsung kemudiaan cuplikan dicuci dengan akuades sebanyak tiga kali, fungsi pencucian adalah untuk membilas cuplikan, menghilangkan larutan asam asetat yang mungkin masih ada dalam cuplikan sehingga asam asetat tersebut tidak bereaksi dengan larutan yang lain

Kemudian cuplikan dimaserasi dengan HCl 1 N dalam suhu 55oC selama 2-5 menit, fungsi maserasi adalah untuk melisiskan lamela tengah yang terdapat diantara sel-sel tumbuhan (lamela tengah ini berfungsi sebagai lem/perekat antar sel) sehingga tidak ada lagi perekat sel dan sel-sel nantinya dapat menyebar satu dengan yang lainnya

Senyawa HCl berfungsi sebagai agen penghidrolisis untuk memecah air yang ada dalam lamela tengah karena sifat HCl adalah asam. Disimpan dalam suhu 55oC dalam waktu 2-5 menit karena dalam suhu dan waktu tersebut merupakan suhu dan waktu yang optimal untuk berlangsungnya rekasi kimia antara HCl dengan cuplikan

Kemudian cuplikan dicuci kembali menggunakan akuades sebanyak 3 kali untuk menghilangkan larutan HCl yang masih tersisa dala cuplikan sehingga tidak bereaksi dengan larutan lain

Kemudian cuplikan diwarnai menggunakan aceto-orcein 1% selama 30-45 menit, yang bertujuan untuk memberi warna kromosom sehingga mudah dilihat. Aceto-orcein digunakan sebagai agen pewarnaan karena sifatnya yaitu penetrasi cepat, tidak menimbulkan kotoran dan karena cat ini khusus untuk kromosom, dalam jangka waktu tersebut dimungkinkan telah terjadi reaksi antara aceto-orcein dengan kromosom

Setelah cuplikan diwarnai, kemudian cuplikan diletakkan diatas obyek gelas dan aceto-orcein yang masih menempel pada bagian pinggir cuplikan diserap dengan tissue yang bertujuan agar aceto-orcein tidak mengganggu dalam pengamatan dan tidak bereaksi dengan larutan yang lain

Selanjutnya cuplikan tersebut ditetesi dengan gliserin , ditutup dengan gelas penutup dan dipencet dengan ujung kuas, larutan gliserin berfungsi untuk meningkatkan indeks bias dan menjaga kesegaran bahan

Pemencetan/squash bertujuan untuk membantu persebaran sel-sel yang ada dalam cuplikan sehingga antara satu sel dengan sel yang lain dapat menyebar satu-satiu tidak saling menumpuk sehingga lebih mudah untuk diamati

Ujung kuas digunakan untuk alat pencet karena tumpul dan kecil sehingga tidak merusak preparat dan yang terakhir dilekatkan dengan cutex, fungsi cutex adalah untuk melekatkan gelas penutup dengan obyek gelas

Selanjutnya preparat diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran yang kecil terlebih dahulu dan diamati perbedaannya antara masing-masing perlakuan

b. HasilDari praktikum yang telah dilakukan dihasilkan preparat sebagai berikut :

1. kontrol, dengan praperlakuan kolkhisin 0,03%

2. perlakuan kolkhisin 0,05% dengan praperlakuan kolkhisin 0,03%, dan

3. perlakuan kolkhisin 0,05% tanpa praperlakuan

Gambar 2. Hasil preparasi yang didapatkan pada saat praktikum, kontrol (1) dan perlakuan dengan praperlakuan (2) dan tanpa perlakuan (3)c. Pembahasan hasil

Pada gambar hasil diatas, tampak bahwa pada pengaruh kolkhisin sebagai perlakuan dengan konsentrasi 0,05 % dan praperlakuan 0,03% sangat nyata dan jelas terhadap jumlah kromosom dan persebaran kromosom pada saat prometafase. Pada perlakuan (treatment) dengan kolkhisin 0,05% terjadi pelipatgandaan jumlah kromosom disebabkan efek kolkhisin yang mampu mencegah terbentuknya benang-benang plasma dari gelendong inti (spindel) dan mencegah pembentukan sel plate metafase sehingga pemisahan kromosom pada anafase dari mitosis tidak berlangsung sehingga menyebabkan penggandaan kromosom tanpa pembentukan dinding sel. Hal ini terjadi karena terdapat ikatan kompleks antara cincin-cincin dalam senyawa kolkhisin yang berikatan dengan tubulin-tubulin yang ada didalam benang spindel. Seperti yang telah diketahui bahwa benang spindel tersusun atas mikrotubulus yang mempunyai ujung alfa (( tubulin) dan ujung beta (( tubulin) sementara itu kolkhisin mempunyai struktur kimia berupa cincin A, B dan C. ikatan kompleks terjadi pada saat cincin A dan B dan kolkhisin berikatan dengan ( tubulin dari mikrotubulus dan cincin C dari kolkhisin berikatan dengan ( tubulin dari mikrotubulus. Karena tidak terbentuk benang spindel, maka kromosom-kromosom tetap tinggal berserakan dalam sitoplasma (tampak jelas pada saat metafase : gambar 2.2 dan 3) dan jumlah kromosom menjadi kelipatan dari jumlah genomya (tampak lebih banyak). Apabila konsentrasi larutan kolkhisin terus diberikan, maka pertambahan genom akan mengikuti suatu deret ukur seperti 4n, 8n, 16n, dst.Kromosom-kromosom yang telah berlipat ganda dan mampu memisahkan diri dari sentromer dan memlui anafase (gambar 2.2 dan 3) dan menghasilkan sel anakan yang mengandung jumlah kromosom lipat dua (anakan poliploi) akibatnya pada ujung akan tampak membesar karena jumlah kromosom yang banyak. Sedangkan pada pengamatan sitologis jumlah kromosom sangat banyak.

Banyaknya jumlah kromosom ini akibat adanya poliploidi menyebabkan kesulitan dalam menghitung jumlah kromosom yang baru, sehingga diperlukan adanya suatu praperlakuan (pretreatment) sebelum dilakukan preparasi kromosom. Dengan fungsi kolkisin yang sama yaitu mencegah pembentukan benang spindel dan plate metafase sihingga pada sel yang telah dilakukan perlakuan dan kemudian dilakukan praperlakuan, kromosom tampak berlilpat ganda dan tampak menyebar sehingga mudah dihitung dan diketahui jumlahnya (gambar 2.2). Hal ini terjadi karena fungsi praperlakuan adalah menyebarkan kromosom dan mengkondenskan bentuk kromosom. Sedangkan pada perlakuan kolkhisin akan tetapi tidak diberi praprelakuan, kromosom tampak banyak (poliploid) akan tetapi tidak menyebar, jadi menggerombol sehingga sulit untuk menghitung (gambar 2.3). Jika dibandingkan dengan kontrol yang tanpa diperlakukan kolkhisin, maka dari hasil tampak bahwa jumlah kromosom tetap diploid (2n) akan tetapi letaknya dapat menyebar karena diberi praperlakuan kolkhisin terlebih dahulu (gambar 2.1).Dari gambar diatas, tipe poliploid yang terjadi adalah autopoliploid dan berdasarkan banyaknya diduga adalah autotetraploid (karena foto tidak terlalu jelas). Autotetraploid adalah penggandaan jumlah kromosom akibat induksi kolkhisin yang jumlah kromosomnya dua kali lipat dari tumbuhan diploid (2n ( 4n).

Berikut ini merupakan simulasi gambar perbandingan mitosis normal dengan mitosis yang diperlakukan dengan kolkhisin :

1. Mitosis normal dalam nukleus dengan 2 pasang kromosom

Nukleus diploid Prometafase Metafase Anafase Telofase

(2n)

2. Mitosis dalam nukleus yang sama setelah diberi kolkhisin

Nukleus diploid C-Prometafase C-Metafase C-Anafase Nukleus restitusi

(2n) (tetraploid = 4n)Keterangan : kromosom yang tampak diatas hanya perwakilan dari jumlah kromosom sebenarnya yang ada di bawang adalah 16 (2n)

Gambar 3. Mitosis normal (1) dibandingkan dengan mitosis dalam nukleus yang diperlakukan dengan kolkhisin (2) (C-mitosis)KESIMPULAN

Dari praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkuan :

1. Perlakuan kolkhisin 0,05 % dan praperlakkuan kolkhisin 0,03% memberikan efek yang nyata terhadap pelipatan jumlah kromosom sehingga menjadi autopoliploidi dan kromosom dapat tersebar dalam sel

2. Penambahan jumlah kromosom hampir selalu diikuti oleh penambahan ukuran sel dan sering menunjukkan keunggulan sifat

3. Setiap perubahan pada jumlah kromosom akan merubah segregasi genetikDAFTAR ACUANSuryo. 1995. Sitogenetika. Gadjah Mada University Press

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA SEL

POLIPLOIDI KROMOSOM BAWANG MERAH

(Allium cepa fa. ascalonicum ) DENGAN INDUKSI KOLKHISIN

Disusun Oleh :

GANIES RIZA ARISTYA

07/259220/PBI/782

PROGRAM STUDI PASCASARJANA BIOLOGI

FAKULTAS BIOLOGI

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA2007

a

Keterangan :

Profase

Prometafase

Metafase

Anafase

Telofase

b

c

d

a

d

e

a

b

b

b

Keterangan :

Profase

Prometafase

b

b

d

a

c

Keterangan :

Profase

Prometafase

Anafase

Telofase

a

b

Keteangan :

Bawang merah hasil perkecambahan didalam perlakuan kolkhisin 0,05% (ujung akan tampak lebih besar)

Bawang merah hasil perkecambahan tidak diperlakukan kolkhisin (ujung akar tampak normal)

PAGE 8