laporan praktikum bioteknologi 2

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI“PEMBUATAN MEDIA KULTUR”

DISUSUN OLEH :

NAMA : NANANG BUDI SANTOSONIM : 115040201111134KELOMPOK : SENIN, JAM 13.00ASISTEN : KHOIRUN ENISSA

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGIFAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG

2012

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangKultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan

tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan

adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa, ekstrak buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan juga menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman.

Unsur hara makro dan mikro diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik. Pada umumnya biasa diberikan dalam komposisi tertentu seperti komposisi media MS, WPM, B5, White, dan lain-lain tergantung dari jenis tanaman yang akan dikulturkan. Vitamin yang banyak digunakan adalah vitamin B12 (thiamin), Nicotinic Acid, vitamin B6 (pyridoxine), dan vitamin E atau C yang digunakan sebagai antioksidan. Asam amino dipakai sebagai sumber N organik, yang biasa digunakan adalah glycine, asparagin, glutanin, alanin, dan threonin.

Zat Pengatur Tumbuh (ZPT) sangat penting dalam pembutan media kultur jaringan. Zat pengatur tumbuh adalah suatu persenyawaan organik yang dalam jumlah sedikit (1 mM) dapat merangsang, menghambat atau mengubah pola pertumbuhan dan perkembangan tanaman.Dalam kultur jaringan ZPT penting: sitokinin (Kinetin, BA, Zeatin, 2iP, Thidiazuron), auksin (IAA, NAA, IBA, 2.4-D, 2.4.5-T, Dicamba, Picloram). Kedua ZPT ini mempunyai fungsi masing-masing yang berbeda, sitokinin mempengaruhi pembelahan sel serta pembentukan organ seperti pucuk dan pembentukan embrio somatik. Auksin dipakai untuk menginduksi pembentukkan sel dan akar. Kombinasi antara auksin dan sitokinin berfungsi untuk menginduksi pertumbuhan kalus. Selain auksin dan sitokinin digunakan juga giberelin(menginduksi pemanjangan tunas dan perkecambahan embrio, dan menghambat pengakaran) dan retardan (untuk menghambat pertumbuhan tunas) seperti pachlobutrazol.

Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media sebagai sumber pembentuk asam amino dan vitamin. Senyawa

organik yang sering ditambahkan adalah air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai sumber energi ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakan sumber karbohidrat, seperti sukrosa (paling baik pada tanaman umumnya), glukosa, fruktosa, dam maltosa. Penambahan arang aktif berfungsi untuk mengarbsorbsi senyawa-senyawa fenolik dan untuk merangsang pertumbuhan akar.

Selain ditambahkan oleh senyawa-senyawa tersebut, media yang baik harus selalu berada dalam PH yang optimal yaitu 5,5-5,8. selain itu, harus dibuat dalam tempat yang steril. Autoclave sering dipakai untuk sterilisasi dalam pembuatan media kultur jaringan.

1.2 TujuanTujuan dari praktikum bioteknologi bab “pembuatan media kultur”, adalah : Mahasiswa dapat mengerti dan memahami tentang jenis-

jenis media pada kultur jaringan dan aplikasi kegunaannya

Makasiswa dapat mengerti dan memahami tentang komposisi dan fungsi unsure dalam media MS (Murashige dan Skog)

Mahasiswa dapat mengerti dan memahami tentang teknik-teknik aseptik dalam pembuatan media

Mahasiswa dapat mengerti dan memahami tentang perhitungan larutan stok

1.3 ManfaatManfaat dari praktikum bioteknologi bab “pembuatan media kultur”, adalah :1. Mahasiswa dapat membuat sendiri larutan stok untuk

pembuatan media kultur jaringan sebagai pengembangan tanaman

2. Dapat mengerti dan memahami tentang materi-materi mengenai pembuatan media kultur dan cara aplikasinya

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jenis-Jenis Media Pada Kultur Jaringan dan Aplikasi Kegunaannya

Jenis-jenis media pada kulur jaringan ada bebebrapa macam, antara lain :

1. Media Knop Media Knop dapat juga digunakan untuk menumbuhkan

kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media

dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dalam Dodds and Roberts, 1983).

2. Media White Media white dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan

kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3

- dan K+

yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang.

3. Media Knudson dan media Vacin and Went, Media Knudson dan media Vacin and Went, media ini

dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4

+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik

untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4

+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm.

Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan

kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Mereka mengambil kesimpulan, bahwa NH4

+ sangat menunjang pertumbuhan kalus tembakau (Miller et al, 1956 dalam Gunawan 1988).

4. Media Murashige & Skoog (media MS) Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan

perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4

+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali

lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsemtrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media:

Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2PO4

yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1998) dalam penelitian kultur anther.

Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3

-, dan menambah konsentrasi Ca2

+ nya. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan

menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4

2- untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra.

Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4

+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan

supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap.

5. Media Gamborg B5 (media B5)Media Gamborg B5 (media B5) pertama kali dikembangkan

untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4

+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968).

6. Media Schenk & Hildebrant (media SH) Media Schenk & Hildebrant (media SH) merupakan media

yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil (Trigiano & Gray, 2000). Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.

7. Media WPM (Woody Plant Medium)Media WPM (Woody Plant Medium) yang dikembangkan

oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon. Pada umumnya media

kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar pada umumnya diambil dari nama penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama kali dalam kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya.

(Suryowinoto, M. 1991)

2.2 Komposisi dan Fungsi Unsur Dalam Media MS (Murashige dan Skogg)

Dalam media MS (Murashige dan Skogg), terddiri dari beberapa macam unsur yang terkandung di dalamnya, antara lain, makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan zat besi.

Jenis-jenis yang termasuk unsur makro adalah nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), sulfur (S), kalsium (Ca), dan magnesium (Mg). Unsur NPK tersedia. Sedangkan unsur S, Ca, dan Mg boleh ada dan boleh tidak, tetapi baik apabila unsur-unsur tersebut juga tersedia. Unsur-unsur yang termasuk di dalam unsur mikro adalah klor (Cl), mangan (Mn), besi (Fe), tembaga (Cu), seng (Zn), bor (B), dan molibdenum (Mo).

Unsur-unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk NH4NO3, KNO3, CaCl2, 2H2O, MGSO4.7H2O, dan KH2PO4. Sedangkan unsur-unsur mikro biasa diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI, NaMoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, dan CaCl2.6H2O.

Kegunaan tiap-tiap unsur tersebut adalah sebagai berikut:

a. Unsur Nitrogen (N)

Kegunaan Nitrogen bagi tanaman adalah untuk menyuburkan tanaman, pembentukan hijau daun, dan pertumbuhan vegetatif tanaman sebab unsur N dapat

membentuk protein, lemak, dan berbagai persenyawaan organik yang lain.

b. Unsur Fosfor (P)

Unsur P terutama dibutuhkan tanaman untuk pembentukan karbohidrat. Maka, unsur P dibutuhkan secara besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih, pembungaan, pemasakan buah dan biji.

c. Unsur Kalium (K)

Unsur K berfungsi untuk memperkuat tubuh tanaman, karena dapat menguatkan serabut-serabut akar sehingga daun, bunga, dan buah tidak mudah gugur. Di samping itu, unsur K juga berfungsi memperlancar metabolisme dan mempengaruhi penyerapan makanan.

d. Unsur Sulfur (S)

Unsur S merupakan unsur yang penting untuk pembentukan beberapa jenis protein, seperti asam amino dan vitamin B1. Unsur S juga berperan dalam pembentukan bintil-bintil akar, membantu pembentukan anakan sehingga pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin.

e. Unsur Kalsium (Ca)

Unsur Ca terdapat pada batang dan daun tanaman yang berfungsi merangsang pembentukan bulu-bulu akar, mengeraskan batang dan merasang pembentukan biji karena unsur Ca bersama Mg akan memproduksi cadangan makanan.

f. Unsur Magnesium (Mg)

Dengan menambahkan unsur Mg maka kandungan fosfat dalam tanaman meningkat. Kegunaan fosfat sebagai bahan mentah untuk pembentukan sejumlah protein, maka pertumbuhan daun menjadi hijau sempurna dan terbentuk karbohidart, lemak serta minyak.

g. Unsur Besi (Fe)

Pemberian unsur Fe juga berfungsi sebagai penyangga yang sangat penting untuk menyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman, pernafasan dan pembentukan hijau daun.

h. Unsur Sukrosa

Sukrosa sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus. Sukrosa dengan konsentrasi 2%-5% merupakan sumber karbon. Penggunaaan sukrosa di atas kadar 3% menyebabkan terjadinya penebalan dinding sel. Pengaruh rangsangan dari gula terhadap pertumbuhan ditentukan juga oleh cara sterilisasinya. Penggunaan autoklaf untuk sterilisasi dapat memberikan pengaruh baik atau buruk terhadap pertumbuhan, tergantung dari gula yang digunakan dalam medium tersebut.

i. Unsur Glukosa dan Fruktosa

Glukosa dan Fruktosa dapat digunakan untuk mengganti sukrosa karena dapat merangsang pertumbuhan beberapa jaringan. Peemilihan gula dan konsentrasi yang akan digunakan tergantung dari jaringan tumbuhan yang akan di kulturkan dan tujuan yang ingin dicapai.

j. Unsur Mio-inositol

Penambahan mio-inositol pada medium bertujuan untuk membantu diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. Bila mio-inositol diberikan bersama dengan auksin, kinetin dan vitamin, maka dapat mendorong pertumbuhan jaringan kalus.

k. Unsur Vitamin

Vitamin yang sering digunakan dalam media kultur jaringan antara lain Tiamin, Piridoksin, dan asam nikotonat. Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim daalam reaksi yang menghasilkan energi dari karbohidrat dan memindahkan energi. Asam nikotinat penting dalam reaksi-reaksi enzimatik, sebagai prekursor dari beberapa alkaloid. Pemberian vitamin C bertujuan untuk mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan. Vitamin yang sering ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah niasin, glisin, piridoksin HCl, tiamin HCl, mio-inositol, asam folat, sianokobalamin, riboflavin, iotin, kolin klorida, kalsium pentetonat, piridoksin fosfat, nikotinamida.

l. Unsur Asam-asam Amino

Asam amino berperan penting untuk pertumbuhan dan diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbeda-beda. Asparagin dan glutamin berperan dalam metabolisme asam amino, karena dapat menjadi pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asam-asam amino baru dalam jaringan.

m. Unsur Zat Pengtur Tumbuh (ZPT)

Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh dalam tanaman terdiri dari lima kelompok, yaitu auksin, giberelin, sitokinin,

etilen dan inhibitor dengan ciri khas serta pengaruh yang berlebihan terhadap proses fisiologis.

Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan diferensiasi. Tanpa penambahan ZPT dalam medium, pertumbuahn sangat terhambat bahkan tidak tumbuh sama sekali. Pembentukan kalus dan organ-organ ditentukan oleh penggunaan yang tepat dari ZPT tersebut.

n. Sitokinin

sitokinin berperan dalam pembelahan sel tanaman terutama mempengaruhi metabolisme asam nukleat dan sintesis protein. Protein berpengaruh terhadap pembelahan sel tanaman.

o. Auksin

auksin berperan dalam proses merubah sifat osmotik dari vakuola dan berpengalaman terhadap perpanjangan sel tanaman sedangkan sitokinin berpengaruh pada pembelahan sel dan diferensiasi sel. Pemanjangan sel ke arah vertikal yang diikuti dengan pembesaran sel akan meningkatkan bobot basah tanaman. Peningkatan bobot basah tanaman terutama disebabkan meningkatnya pengambilan air oleh sel tanaman. Air serta zat pengatur jumbuh dan nutrisi yang terkandung dalam air kelapa masuk ke dalam sel dan dinding sel mengembang, dengan makin besarnya sel yang terbentuk akan berpengaruh terhadap berat basah tunas tanaman.

(Sriyanti, 1994)

2.3 Teknik-teknik Aseptik Dalam Pembuatan Media

Teknik aseptik adalah teknik pemindahan mikroba dengan menggunakan alat-alat yang steril serta aturan laboratorium tertentu agar tidak terjadi kontaminasi di dalam kultur tersebut.

Teknik aseptik adalah langkah-langkah yang diambil agar dalam percobaan di laboratorium sehingga diperoleh hasil yang akurat. Contoh dengan menghindarkan percobaan dari mikroorganisme yang dapat mengkontaminasi produk sehingga terjadi perubahan yang tidak diingainkan. Teknik aseptik juga berfungsi untuk melindungi diri dari infeksi dan pencemaran lingkungan.

Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-1210C. Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:

Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170o – 180oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).

Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).

Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba).

(Anonymous a, 2012)

Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode sterilisasi dengan uap air dibawah tekanan. Kapas penyumbat, kasa, perlatan laboratorium, plastik penutup, peralatan gelas, penyaring,

air, dan media nutrisi dapat disterilisasi dengan autoklaf. Hampir semua mikroba mati bial terkena uap yang sangat panas dari autoklaf selama 10-15 menit/ semua obyek hendaknya disterilisasi pada suhu 121ºC dan tekanan 15 Psi selama 15-20 menit (Torres, 1989).

Etil alcohol (70-90%) sangat berguna untuk mengusap permukaan tempat pelaksanaan, membilas tangan, dan mencelupkan peralatan dengan atau tanpa pembakaran. Alcohol mudah terbakar, sehingga harus sangat hati-hati saat menggunakannya diatas api. Kalsium atau Natrium hipoklorit digunakan sebagai sterilisasi peralatan dan sebagai desinfektan bagi jaringan tanaman tanpa melukainya (Afriastini, 2004).

Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api Bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api.

Kelemahan autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas secara manual, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan: sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

Autoklaf yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatis ini berjalan dengan baik. Maka autoklaf dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakkan total pada autoklaf. Sebagai sumber uap, juga berasal dari air yang ditambahkan ke dalam autoklaf dan didihkan.

Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoklaf dengan kapasitas besar dan sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoklaf ini sangat cepat dan dapat diprogam waktu sterilisasi, serta

waktu pendinginan. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai, temperatur dan tekanan autoklaf diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15-20 menit. Pada autoklaf yang programmable, panas ini diatur secara atomatis. Tetapi pada autoklaf yang sederhana hal ini harus diatur secara manual.

Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm.Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :

1. Penguraian gula.2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

( Lydiane Kyte & John Kleyn. 1996 : 169) Autoklaf gas atau listrik portable pada umumnya

mempergunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf, sedangkan autoklaf besar pada laboratorium komersil pada umumnya menggunakan uap dari boiler sentral.

Bagian-bagian autoklaf :1. Panci luar.2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat

saluran uap.3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap.4. Katup pengeluaran uap.5. Pengunci atau klem.

Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah yang mempunyai volume antara 300 – 500 ml. Isi wadah tersebut sampai 80% volume, dan tutup dengan kertas, serta kencangkan dengan karet gelang.

Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi

sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada tekanan 15 psi. atau 1 atm.

Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperatur 121oC, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara 20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up).

Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin.

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah, biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160o C. Setelah disterilkan dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan alumunium foil.

(Anonymous B, 2012)2.4 Rumus Perhitungan Larutan Stok

Larutan stok adalah larutan berisi satu ataul e b i h k o m p o n e n m e d i a y a n g k o n s e n t r a s i n y a l e b i h b e s a r d a r i k o n s e n t r a s i k o m p o n e n tersebut dalam formulasi media akan dibuat.

Rumus perhitungan larutan stok yang dibutuhkan, dapat menggunakan rumus :

V1 x M1 = V2 x M2

Dimana: V1 = volume yang akan dibuatM1 = banyaknya kebutuhan senyawa dalam media MSV2 = volume larutan stok yang akan diambilM2 = banyaknya senyawa dalam larutan stok

(Hemawan dan Na”em, 2006)

BAB III METODOLOGI

3.1 Alat, Bahan dan Fungsi

Alat :1. 14 botol kultur : berfungsi sebagai tempat media kultur2. 2 pak karet gelang : berfungsi untuk penutup atau tali

penutup plastik dan alumunium 3. Plastik tahan tanas (untuk 8 botol, dengan ukuran pxl; 12 x

13 cm) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan a)4. Gelas ukur : untuk mengukur cairan yang di butuhkan5. Mikro pipet : untuk mengambil larutan stok dengan ukuran

terkecil mikro meter6. Beaker glass : untuk tempat pembuatan larutan stok7. pH universal (indikator pH) : untuk mengukur pH larutan8. sitter : megaduk larutan9. microwave : untuk memasak larutan hingga larutan

mengental10. alumanium foil (unutk 6 botol, dengan ukuran pxl; 24 x 15,

kertas di lipat/rangkap) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan b)

11. autoclave : sterilisasi botol kultur sebelum di masukkan ke ruangan pengamatan

12. Timbangan analitik : untuk menimbang berat bahan yang diperlukan

13. Oven : sterilisasi kering botol kultur

bahan : Aquades : 50 ml (bahan tambahan pada

larutan stok) Makro : 30 ml

Mikro A : 3 mlMikro B : 0,3 mlFeEDTA : 3 mlVitamin : 0,3 mlCaCl2 : 3 mlFungsi : Sebagai bahan pembuatan

larutan stok Sukrosa : untuk 300 ml. Larutan media

digunakan 9 gram gula. (untuk membuat larutan menjadi

tercampur rata) Agar-agar : unutk 300 ml. Larutan media

digunakan 2,1 gram agar-agar (untuk mengentalkan larutan)

3.2 Cara Kerja Pembuatan Media Kultur (Diagram Alir)

Bilas gelas dengan menggunakan aquades

Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml

Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok :Makro : 30 mlMikro A : 3 mlMikro B : 0,3 mlFe EDTA : 3 mlVitamin : 0,3 mlCaCl2 : 3 ml

Tambahkan aquades hingga volume mencapai 300 ml

Stirer (aduk) dan ukur pH (pH indikator)

Masukkan sukrosa (gula) dan agar-agarSukrosa : 9 gramAgar-agar : 2,1 gram

Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan berwarna bening

Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi

Mikrowave selama 7 menit

Masukkan ke dalam botol kultur @20 ml :8 botol dengan tutup plastik6 botol dengan tutup alumunium

3.3 Analisa Perlakuan

Pertama, breaker glas di bilas dahulu dengan menggunakan aquades, bertujuan untuk menghilangkan dan membersihkan gelas breaker. Isi breaker glas dengan larutan aquades kurang lebih 50 ml. Setelah itu, tambahkan unsur-unsur larutan yang sudah di stok, yaitu : makro (30 ml), mikro A (3 ml), mikro B (0,3 ml), Fe EDTA (3 ml), Vitamin (0,3 ml) dan CaCl2 (3 ml). Setelah semua larutan selesai ditambahkan, tambahkan lagi aquades hingga volume mencapai 300 ml. Stirer (aduk) larutan dan ukut pH larutan menggunakan indikatorpH hingga mencapai pH sekitar 5 – 6. Masukkan sukrosa (9 gram) dan agar-agar (2,1 gram) yang bertujuan untuk melarutkan larutan dan mengentalkan larutan. Stirer kembali sampai larutan berwarna putih bening. Setelah selesai, tutup breaker glas dengan plastik wrap dan masukkan ke dalam microwave selama 7 menit setelah selesai, masukkan larutan ke dalam botol kultur dengan 8 botol di tutup plastik, dan 6 botol ditutup alumunium. Masukkan ke autoclave untuk sterilisasi akhir, dan amati selama 2 minggu, apakah terjadi kontaminasi atau tidak.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil (tabel perbandingan perlakuan)

Autoclave

a. Tabel media kultur dengan penutup plastik

No Hari Pengamatan Ke-

Botol Ke-

Jenis Kontaminan

Keterangan

1 Hari ke-2 (17 Oktober 2012)

12345678

Tidak adaTidak adaTidak adaTidak adaTidak adaTidak adaTidak adaTidak ada

Tidak terjadi kontaminan dengan warna yang masih putih dan sudah mengental

2 Hari ke 4 (19 Oktober 2012)

12345678




12345678




123

Tidak adaTidak adaTidak ada

Tidak terjadi kontamina

45678

Tidak adaTidak adaTidak adaTidak adaTidak ada

n dengan warna yang masih putih dan sudah mengental

5 Hari ke 10 *(25 Oktober 2012)

12345678




12345678



*Seharusnya tanggal 26 Oktober 2012, karena libur, jadi pengamatan dimajukan 1 hari pada tanggal 25 Oktober 2012

b. Tabel media kultur dengan penutup Aluminium Foil

No

Hari Pengamatan Ke-

Botol Ke-

Jenis Kontaminan

Keterangan

1 Hari ke-2 (17 Oktober 2012)

123


Tidak terjadi kontamina

456


n dengan warna yang masih putih dan sudah mengental


123456

Tidak adaTidak adaTidak adaTidak adaTidak adaTidak ada



123456




123456



5 Hari ke 10 *(25 Oktober 2012)

123456




123456



*Seharusnya tanggal 26 Oktober 2012, karena libur, jadi pengamatan dimajukan 1 hari pada tanggal 25 Oktober 2012

4.2 Pembahsan

Dari data hasil praktikum yang telah didapatkan, diketahui bahwa pembuatan media kultur yang telah dilakukan dapat dikatakan berhasil. Hal ini diketahui dari pengamatan yang telah dilaksanakan selama 2 minggu pengamatan (dengan selang waktu 2 hari sekali), yaitu warna dari larutan yang berada di dalam botol kultur tutup plastik maupun tutup alumunium berwarna putih dan sudah mengental.

Pada botol kultur dengan tutup plastik, dilakukan percobaan sebanyak 8 botol. Pada pengamatan pertama, 8 botol tersebut tidak menunjukkan gejala-gejala terkontaminasi. Hal ini berlanjut ke pengamatan-pengamatan selanjutnya, dengan selang waktu 2

minggu, 8 botol kultur masih menunjukkan hasil yang baik dan tidak terkontaminasi.

Pada botol dengan tutup alumunium pun, menunjukkan hasil yang sama dengan botol yang di tutup dengan plastik. Pada praktikum, di lakukan percobaan dengan 6 botol yang di tutup dengan menggunakan alumunium. Selang jangka waktu 2 minggu setelah praktikum, botol kultur tersebut tidak terkontaminasi, dengan ciri-ciri larutan tetap berwarna putih dan sudah mengental.

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Jenis-jenis media pada kulur jaringan ada bebebrapa macam, antara lain : Media Knop (wortel), Media Knudson dan media Vacin and Went (anggrek), Media White (bunga matahari), Media Murashige & Skoog (media MS), Media Gamborg B5, Media Schenk & Hildebrant (media SH), Media WPM (Woody Plant Medium)

Dalam media MS (Murashige dan Skogg), terddiri dari beberapa macam unsur yang terkandung di dalamnya, antara lain, makronutrien, mikronutrien, vitamin, dan zat besi.

Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-1210C. Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:◦ Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar

gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170o – 180oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).

◦ Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).

◦ Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba).

Rumus perhitungan larutan stok yang dibutuhkan, dapat menggunakan rumus : V1 x M1 = V2 x M2

Dari data hasil praktikum yang telah didapatkan, diketahui bahwa pembuatan media kultur yang telah dilakukan dapat dikatakan berhasil. Hal ini diketahui dari pengamatan yang

telah dilaksanakan selama 2 minggu pengamatan (dengan selang waktu 2 hari sekali), yaitu warna dari larutan yang berada di dalam botol kultur tutup plastik maupun tutup alumunium berwarna putih dan sudah mengental.

5.2 Saran

Asisten : tolong kalau menerangkan materi, lebih pelan saja, selain itu, no koment

Praktikum : bahan laporan tolong lebih di persingkat.

DAFTAR PUSTAKA

Suryowinoto, M. 1991. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Fakultas Biologi. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta

Sriyanti, Daisy P. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta.

Anonymous a, 2012. Teknik Sterilisasi http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20IV%20STERILISASI/IV2%20Sterilisasi %20Alat.html. Diakses Tanggal 16 Oktober 2012

Torres, K.C. 1989. Tissue Culture techniques for Horticultural Crops. Von Hostrand Reinheld. New York.

Afriastini, F. 2004. Perbanyakan Vegetatif : Kultur Jaringan. http://www.wikipedia.id.org/ teknik/veg. Diakses 15 Desember 2007

Kyte, Lydiane & John Kleyn. 1996. Plants from Test Tubes. USA: Timber Press

Anonymous b, 2012. Teknik Sterilisasi. http://www.iptek.net.id/ind/?ch=isti&id=211. Diakses Tanggal 16 Oktober 2012

Herawan, T dan M. Na’iem. 2006. Pengaruh Jenis Media dan Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran pada Kultur Jaringan Cendana (Santalum album Linn.). Jurnal Agrosains 19(2) : 103-109.

LAMPIRAN

Dokumentasi hari ke-2 (17 Oktober 2012)Plastik Alumunium

http://www.wikipedia.id.org/%20teknik/veg.%20Diakses%2015%20Desember%202007

http://www.wikipedia.id.org/%20teknik/veg.%20Diakses%2015%20Desember%202007

http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20IV%20STERILISASI/IV2%20Sterilisasi

http://elearning.unram.ac.id/KulJar/BAB%20IV%20STERILISASI/IV2%20Sterilisasi

Tidak terjadi kontaminasi Tidak terjadi kontaminasi


laporan praktikum bioteknologi 2

Documents