Oleh:

Tim Asisten Prinsip Bioteknologi

Akuakultur

BUDIDAYA PERAIRAN 2020

Prinsip Bioteknologi Akuakultur

BUKU PANDUAN PRAKTIKUM

PRINSIP BIOTEKNOLOGI AKUAKULTUR

NAMA :

NIM :

KELOMPOK :

PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN

JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2020

KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah kami panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala

limpahan rahmat dan Karunia-Nya sehingga Buku Panduan Praktikum Prinsip

Bioteknologi Akuakultur dapat disusun.

Buku panduan merupakan susuatu pedoman yang menyajikan metode

pelaksanaan praktikum Prinsip Bioteknologi Akuakultur yang pada dasarnya

dirangkum dari berbagai referensi untuk menuntun praktikan. Materi yang

disajikan mengenai Isolasi Bakteri dan Ekstrasksi DNA udang vannamei

(Litopenaeus vannamei).

Buku panduan ini merupakan penuntun praktikum Prinsip Bioteknologi

Akuakultur sehingga dapat bermanfaat bagi praktikan dan pembaca. Kami

menyampaikan terimakasih kepada pihak-pihak yang secara langsung maupun

tidak langsung telah membantu dalam penyelesaian buku ini. Tim penyusun

menyadari akan keterbatasan yang dimiliki sehingga kami mengharapkan saran

atau kritik konstruktif bagi penyempurnaan buku ini di lain waktu.

Malang, 30 Agustus 2020

Tim Penyusun

TATA TERTIB PRAKTIKUM

PRINSIP BIOTEKNOLOGI AKUAKULTUR

1. Mempersiapkan diri dan masuk beberapa menit sebelum praktikum dimulai.

2. Dilarang meninggalkan praktikum tanpa seizin koordinator praktikum

3. Dilarang makan dan minum selama praktikum berlangsung kecuali seizin

koordinator praktikum

4. Wajib mengikuti rangkaian praktikum diantaranya pretest, posttest, praktikum

kelas (melalui Google Meet), ujian akhir praktikum serta mengerjakan

laporan praktikum

5. Mengikuti ketentuan praktikum kelas

6. Apabila tidak mengikuti salah satu dari rangkaian praktikum maka tidak ada

susulan

7. Jika terdapat kendala dapat menghubungi asisten kelompok masing-masing

8. Terdapat absensi pada kegiatan praktikum

9. Menjaga ketertiban dan kelancaran jalannya praktikum

1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Segala sesuatu yang menggunakan jasad hidup mikroorganisme atau

produknya untuk menghasilkan barang dan jasa demi kemaslahatan manusia

merupakan konsep dasar yang harus dipahami sebelum mempelajari cakupan

bioteknologi secara luas. Prinsip dasar bioteknologi adalah adanya agen biologi

(mikroba, enzim, sel hewan, sel tumbuhan), pendayagunaan “teknologi” untuk

memanipulasi DNA, serta menggunakan berbagai disiplin ilmu yang saling

berkaitan (Nugroho dan Rahayu, 2017).

Dalam kurun waktu 20 tahun terakhir ini, bioteknologi telah mengalami

perkembangan sangat pesat. Di beberapa negara maju, bioteknologi

mendapatkan perhatian serius dan dikembangkan secara intensif dengan

harapan dapat memberi solusi untuk mengatasi berbagai permasalahan yang

dihadapi manusia pada saat ini maupun yang akan datang yang menyangkut;

kebutuhan pangan, obat-obatan, penelitian, yang pada gilirannya semuanya

bertujuan untuk meningkatkan kesejahteraan hidup umat manusia (Nurcahyo,

2011).

Kemajuan-kemajuan ilmu pengetahun dan teknologi yang telah ada baik

di bidang fisika, kimia, matematika dan biologi telah memicu majunya

bioteknologi. Selain itu, banyak hal yang juga ikut berperan dalam memicu

lahirnya bioteknologi, diantaranya adalah karena semakin besar tuntutan untuk

mencapai target yang diinginkan dengan proses yang lebih cepat dan terobosan

yang inovatif yang bisa menguntungkan bagi umat manusia. Bioteknologi juga

memiliki peran penting dalam ilmu pengetahuan dewasa ini, bioteknologi sendiri

mengalami berbagai pembaruan dari bioteknologi yang bersifat tradisional

kearah bioteknologi yang modern. Manfaat bioteknologi bagi kehidupan manusia

dalam meningkatkan kesejahteraan dan perbaikan hidup telah terbukti, antara

lain penerapannya untuk memerangi kelaparan, mengatasi kelangkaan sumber

daya energi, mengurangi pencemaran lingkungan dan masih banyak lagi

(Sutarno, 2016).

Usaha akuakultur dapat dibedakan menjadi dua, yaitu (1) budidaya

perikanan berbasis di darat (land-based aquaculture) dan (2) budidaya perikanan

berbasis di laut (marine based aquakultur). Berdasarkan sistem produksinya,

budidaya dibedakan menjadi : budidaya tradisional, budidaya semi-intensif, dan

budidaya intensif. Kesemuanya dapat memberikan hasil yang maksimal apabila

ditunjang dengan adanya bioteknologi yang memadai (Saru, et al., 2004).

Oleh sebab itu, salah satu alternatif untuk mengatasi permasalahan

tersebut di atas, perlu dilakukan perbaikan terhadap sistem budidaya perikanan

yang diterapkan selama ini, yaitu dapat dilakukan dengan melalui pemanfaatan

mikroba menguntungkan. Melalui aplikasi bioteknologi diharapkan produktivitas

budidaya dapat ditingkatkan.

1.2 Maksud

Maksud dari Praktikum Prinsip Bioteknologi Akuakultur adalah untuk

menambah pengetahuan, dan melakukan teknik pelaksanaan ekstraksi DNA,

pengenalan dan teknik gambaran pelaksanaan PCR hingga proses

elektroforesis. Selain itu mahasiswa dapat mengetahui bagaimana prosedur

untuk menanamkan bakteri

1.3 Tujuan

Tujuan dari Praktikum Prinsip Bioteknologi Akuakultur yaitu:

1. Mengetahui prinsip kerja PCR

2. Mengetahui dan mampu melaksanakan cara ekstraksi DNA udang dan

bakteri

3. Mengetahui dan mampu melaksanakan prosedur amplifikasi

4. Mengetahui dan mampu melaksanakan cara elektroforesis

1.4 Tempat dan Waktu Pelaksanaan

Praktikum Prinsip Bioteknologi Akuakultur dilaksanakan daring melalui

Google Meet pada tanggal 11 Oktober 2020.

2. MATERI DAN METODE

2.1 Kultur Bakteri.

Bakteri adalah mikroorganisme yang berukuran mikroskopis. Menurut

Mohamad et al. (2014), bakteri merupakan mikroorganisme prokariotik, yaitu

organisme yang paling sederhana strukturnya. Prokariota tidak memiliki inti dan

organel kompleks. Bentuk bakteri yang paling biasa ditemui adalah batang, cocci

(bundar), dan bentuk spiral. Beberapa spesies memiliki flagela yang

memungkinkan bakteri berenang dan bergerak. Spesies bakteri biasanya

dikelompokkan menjadi beberapa jenis dan ada beberapa jenis yang biasanya

bersifat pathogeni seperti Salmonellae, E. Coli, dan Vibriones.

Austin (1988) mengatakan Vibrio merupakan patogen oportunistik yang

dalam keadaan normal ada dalam lingkungan pemeliharaan, kemudian

berkembang dari sifat saprofitik menjadi patogenik jika kondisi lingkungan

memungkinkan. Bakteri vibrio yang patogen dapat hidup dibagian tubuh

organisme lain baik di luar tubuh dengan jalan menempel, maupun pada organ

tubuh bagian dalam seperti hati, usus, dan sebagainya. Menurut dampak

langsung bakteri patogen dapat menimbulkan penyakit, parasit, pembusukan

DNA toksin yang dapat menyebabkan kematian biota yang menghuni perairan

yang terkontaminasi Vibrio sp.

Proses kultur bakteri Vibrio sp. pada media TSB (Trypticase Soy Broth) 2%

adalah sebagai berikut:

Ambil stock bakteri V. alginolyticus dari Freezer (-80oC).

Siapkan media TBS steril.

Nyalakan LAF (Laminary Air Flow).

Kultur Bakteri Vibrio alginolyticus

Nyalakan bunsen di dalam LAF (Laminary Air Flow).

Ambil 100 µl bakteri V. alginolyticus dengan mikropipet.

Tanam bakteri pada media TSB steril.

Vortex selama 10 detik.

Inkubasi maksimal 2 x 24 jam pada inkubator bersuhu 30°C.

Media yang sering digunakan secara umum dalam mirkobiologi antara lain:

Lactose agar, EMBA (Eosin Methylene Blue Agar), NA (Nutrient Agar), NB

(Nutrient Broth), TSB (Trypticase Soy Broth), PCA (Plate Count Agar), PCA

(Potato Dextrose Agar)

Skema Kerja Pembuatan Media TSB (Trypticase Soy Broth)

Siapkan erlenmeyer 100 ml

Timbang TSB

TSB = 30/1000 x ∑ tabung reaksi x ∑ ml untuk 1 tabung reaksi

Tambahkan NaCl sebanyak 2% dari volume TSB

Masukan aquades pH 7 sebanyak 50 ml(5 tabung) pada gelas ukur

Larutkan TSB dan NaCl dalam aquades pada Erlenmeyer

Tutup dengan kapas dan alumunium foil

Homogenkan dengan hot plate

Masukan dalam tabung reaksi masing masing 10ml sebanyak 5 tabung

dengan bantuan bola hisap dan pipet volume

Sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121’C tekanan 1 atm selama 15

menit

Keluarkan dari autoklaf dan biarkan sampai hangat kuku

Didapatkan media TSB steril

Hasil

TSB (Trypticase Soy Broth)

Hasil

2.2 Pengertian PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR ditemukan oleh Kary Muilis tahun 1983. PCR menjadi teknik umum

yang digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai

keperluan, seperti pengurutan gen-gen dan diagnosis penyakit turunan,

identifikasi sidik-jari genetik (digunakan dalam pengujian forensik dan paternitas),

deteksi dan diagnosis penyakit infeksi dan pembentukan organisme transgenik.

PCR juga digunakan dalam biosistematika, biologi populasi, biologi konservasi,

ekologi, biologi perkembangan, dan genetika.

PCR adalah salah satu teknik dalam biologi molekuler untuk

mengamplifikasi atau menggandakan sejumlah kecil DNA secara in vitro

menggunakan system enzimatik dan suhu. PCR merupakan suatu sistem

pemeriksaan untuk replikasi DNA yang memungkinkan suatu rangkaian DNA

target spesifik mengalami amplifikasi secara selektif atau bertambah dalam

waktu beberapa jam saja. PCR dimulai dengan DNA template (cetakan) dalam

jumlah yang sangat sedikit, kemudian setelah melalui beberapa siklus

amplifikasi, jumlah copy DNA kan menjadi jutaan kali lipat.

Menurut Lo (2006), prinsip dasar yang dilakukan PCR sebenarnya sangat

sederhana, karena PCR memiliki prinsip kerja berlandaskan terjadinya replikasi

DNA yang terjadi selama proses pembelahan sel. PCR adalah teknik yang paling

populer dan banyak digunakan di semua bidang studi biologis. Metode PCR

banyak disukai karena cepat dan tidak menimbulkan senyawa radioaktif hanya

dengan menggunakan alat Thermal cycler yang dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Thermal Cyler

Manfaat PCR sendiri adalah isolasi gen, DNA Sequencing, forensik, dan

diagnosa penyakit. Pada akuakultur sendiri, PCR paling sering digunakan untuk

mengidentifikasi apakah terdapat penyakit atau tidak pada suatu organisme yang

diuji. Menurut Zulfahmi (2013), teknologi PCR ditemukan oleh Mullis dan Faloona

pada tahun 1987. Alat ini ditujukan untuk pemanfaatan penanda molekuler DNA

dan diaplikasikan pada berbagai bidang. Teknik PCR telah banyak digunakan

pada penelitian mengenai filogenetik. Oleh karena itu, dalam bidang perikanan

teknik PCR ini dapat digunakan untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar

genus ikan yang berbeda.

Kelebihan PCR:1. Memiliki spesifitas tinggi

2. Sangat cepat dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama

3. Dapat membedakan varian mikroorganisme

4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup

5. Mudah di set up

Kelemahan PCR:1. Sangat mudah terkontaminasi

2. Biaya peralatan dan reagen mahal

3. Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit

infeksi misalnya infeksi pasif atau laten

4. Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian

khusus untuk melakukannya.

2.3 Ekstraksi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis

DNA. DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel,

yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan

langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti,

dilanjutkan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel. Prinsip utama dalam

isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA

dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain-

dengan cara diekstraksi atau dilisiskan, biasanya dilakukan dengan homogenase

dengan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA

rusak. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak rusak dan

didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang.

Isolasi DNA khusus untuk udang post larva, diambil semua bagian

tubuhnya, sedangkan udang yang berukuran lebih dari 4 cm (umur 1,5 bulan)

hanya diambil hepatopankreas. Hepatopankreas merupakan organ target infeksi

bakteri dan merupakan organ yang bertanggung jawab dalam proses pertahanan

tubuh.

Sampel yang diambil pada udang ada 3 (karena ada gen pertumbuhan)

1. Tangkai mata, ada MIH (Moulting Inhibiting Hormone)

2. Hepatopankreas, ada CypA (Cyclophilin A)

3. Daging, ada SIBD (Single Insulin Binding Domain)

Skema Kerja Ekstraksi DNA Udang Vannamei (Litopanaeus vannamei) dengan Metode Lysis Buffer

Ditimbang sebanyak 100 mg menggunakan timbangan digital.

Sampel dihancurkan dan haluskan pada botol film lalu dimasukkan ke

dalam mikrotube 1,5 mL.

Tambahkan 500 µL Lysis Buffer, dan homogenkan.

Inkubasi pada suhu 95oC selama 10 menit.

Sentrifuge 12.000 rpm selama 10 menit.

Pindahkan 200 µL supernatan dalam tube baru, tambahkan 400 µL

ethanol 95 %.

Voretex kemudian sentrifuge 12.000 rpm selama 5 menit.

Buang supernatan secara hati-hati, kering anginkan pelet DNA selama

10 menit.

Larutkan DNA dengan ddH2O atau TE Buffer sebanyak 100 µL.

Simpan DNA pada lemari pendingin dengan suhu 2-8oC.

Skema Kerja Ekstraksi DNA bakteri Vibrio alginolyticus dengan Metode Lysis Buffer

Isolat bakteri diambil sebanyak 1 mL.

Sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit suhu 4oC.

Diambil 500 µL supernatant.

Tambahkan 500 µL Lysis Buffer, dan homogenkan.

Inkubasi pada suhu 95oC selama 10 menit.

Sentrifuge 12.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4oC.

Pindahkan 200 µL supernatan dalam tube baru, tambahkan 400 µL

Sampel

Hasil

Isolat Bakteri

Ethanol 95 %.

Vortex kemudian sentrifuge 12.000 rpm selama 5 menit dengan suhu

4oC.

Buang supernatan secara hati-hati, disisikan filtrat sebanyak 500 µL.

Larutkan pelet dengan ddH2O atau TE Buffer sebanyak 100 µL.

Simpan DNA pada lemari pendingin dengan suhu 2-8oC.

Macam-Macam Ekstraksi DNA :

A. Penggunaan KIT

Kelebihan : - Mudah digunakan

- Proses lebih cepat

- Hasil ekstraksi bagus

- Sudah tersedia dalam 1 paket

- Bisa digunakan untuk DNA dan RNA

Kekurangan : - Harganya relative mahal

- Membutuhkan peralatan canggih

- Komposisi hanya diketahui oleh perusahaan

B. C-TAB atau D-TAB

Kelebihan : - Umum digunakan

- Dapat digunakan hampir semua jenis sampel

- Hasil pita DNA tebal

Kekurangan : - Terlalu banyak bahan yang digunakan

- Harga mahal

- Proses lama

C. Lysis Buffer

Kelebihan : - Mudah digunakan

Hasil

- Bahan-bahan yang digunakan sedikit

- Proses lebih cepat

- Harga terjangkau

Kekurangan : - Hasil DNA kurang jelas atau kurang tebal

D. Phenol Chloroform

Kelebihan : - Umum digunakan

- Bahan mudah dicari

- Proses lebih cepat

- Hasil DNA lebih bagus

Kekurangan : - Menghasilkan senyawa toksik yang bersifat karsinogenik

2.4 Uji Kuantitatif DNA

DNA genom hasil isolasi dilakukan uji kuantitatif menggunakan

spektrofotometer untuk melihat kemurnian DNA sampel. Tingkat kemurnian isolat

DNA murni memiliki nilai yang berkisar antara 1,8-2,0 dan uji kualitatif

menggunakan metode standar berupa identifikasi, pemisahan, dan purifikasi

fragmen DNA yaitu elektroforesis gel agarose. Jika tingkat kemurniannya rendah

maka akan mempengaruhi pada penempelan primer terhadap situsnya dan akan

menghambat aktivitas enzim polimerase DNA.

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi

suatu bahan dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang

tertentu pada suatu objek kaca atau kuarsa yang disebut cuvet. Sebagian dari

cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan.

Prinsip kerja : menembakkan cahaya untuk diserap dan dibaca pantulannya.

Skema Kerja Uji kuantitatif DNA

Sambungkan ke arus listrik.

Dikalibrasi menggunakan 1 µL aquades pada sensor hingga

konsentrasinya 0 ng/µL.

Tekan penutupnya.

Jalankan alat menggunakan software dengan panjang gelombang 260

nm untuk uji DNA dan 280 nm untuk uji protein.

Tunggu sampai hasil terbaca (0).

Masukkan DNA sampel sebanyak 1 µL.

Tutup penutupnya dan jalankan menggunakan software.

Blasting adalah metode untuk mengetahui index similaritas DNA. Aplikasi yang

digunakan adalah Mega 7,026

Uji dengan Nanodrop Spectrophotometer 3 kali ulangan

Rumus uji kuantitatif kemurnian DNA:

nilai absorbansi panjang gelombang DNA

nilai absorbansi panjang gelombang protein

Keterangan :

nilai absorbansi pada panjang gelombang DNA = 260 ng/ µL

nilai absorbansi pada panjang gelombang protein = 280 ng/ µL

*Protein merupakan kontaminan utama dalam kemurnian DNA

Nanodrop Spectrophotometer

Hasil

Uji kuantitatif kemurnian DNA =

2.5 Amplifikasi DNA dengan PCR

Amplifikasi adalah suatu proses yang dapat menggandakan atau

mereplikasi suatu DNA yang semulanya sedikit (bisa 1 atau 2 dan seterusnya)

bisa menjadi banyak atau berlipat ganda. Pada setiap n siklus PCR akan

diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR

adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target

dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.

Menurut Lo (2006), pada dasarnya PCR terjadi dalam tiga tahap, yakni

denaturasi, annealing dan extension. Denaturasi akibat adanya panas yang

diberikan kepada DNA. Annealing atau penempelan DNA primer dalam

temperatur yang dingin, dan yang terakhir adalah pemanjangan/ekstensi dari

DNA primer yang telah dilakukan proses annealing dengan menggunakan DNA

polimerase. Proses dasar siklus dari PCR ini akan berulang hingga 30-35 siklus.

Siklus dari PCR dapat dilihat pada Gambar 2.

Untuk menjalakan proses amplifikasi diperlukan beberapa komponen

untuk berjalannya proses ini. Adapun komponen dari PCR yang diperlukan

antara lain:

a. DNA template

b. dNTPs

c. Primer

d. Buffer

e. DNA polymerase

f. NFW (steril water)

g. MgCl2

h. Thermal cycler

Gambar 2. Siklus PCR

Skema Kerja tahapan PCR dari Sampel Udang

Siapkan master mix, yaitu: Primer F (0,5 µL) Primer R (0,5 µL) Steril Water (ddH2O) (3 µL) 2x Go Taq Green PCR (5 µL)

Masukkan master mix ke dalam mikrotube 0,5 mL.

Dihomogenkan sampai bening.

Siapkan mikrotube ukuran 200 µL.

Masukkan master mix ke dalam mikrotube ukuran 200 µL dengan

konsentrasi yang telah ditentukan.

Tambahkan 1 µL DNA template.

Masukkan mikrotube pada Thermal cycler yang sudah disetting

waktunya.

Ambil mikrotube dari Thermal cycler.

2.6 Elektroforesis

Prinsip dasar dari elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan

muatan listrik. Elektroforesis DNA biasanya digunakan untuk memisahkan DNA

Sampel

Hasil

berdasarkan perbedaan ukurannya. Semakin besar ukuran molekul maka laju

dari migrasi akan semakin rendah. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di

dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif

(anode).

Ada bermacam-macam zat kimia yang dapat digunakan sebagai gel di

dalam proses elektroforesis. Penggunaan jenis gel disesuaikan dengan tujuan

yang akan dicapai. Secara umum ada 2 jenis gel yang biasa digunakan yaitu

Agarose Gel Electrophoresis (AGE) dengan visualisasi menggunakan ethidium

bromide dan Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE) dengan visualisasi

menggunakan silver staining. Kedua cara elektroforesis ini banyak digunakan

dalam visualisasi produk PCR. Prinsipnya alat elektroforesis dibagi menjadi 2

yaitu horizontal elektrophoresis dan vertical elektrophoresis.

Prinsip dasar elektroforesis berhubungan dengan gaya gerak Iistrik yang

digunakan untuk mendorong atau menarik molekul melalui matriks gel. Molekul

bermuatan yang ditempatkan di dalam "sumur" gel dan dialiri arus listrik akan

bergerak melalui matriks dengan kecepatan berbeda, menuju anoda jika

bermuatan negatif atau menuju katoda jika bermuatan positif (catatan bahwa

Elektroforesis gel bekerja sebagai sel listrik; anoda bermuatan positif dan katoda

bermuatan negatif). Alat yang digunakan untuk proses eletroforesis dapat dilihat

pada Gambar 3.

Gambar 3. Alat Elektroforesis

Skema Kerja Pembuatan Gel Agarose

Ditimbang sebanyak 0,45 gr.

Masukkan ke dalam erlenmeyer.

Tambahkan TBE 1X pH 8 sebanyak 30 ml.

Dihomogenkan dan dipanaskan dalam microwave.

Tunggu hingga bening.

Angkat dan tunggu hingga hangat kuku.

Tambahkan larutan EtBr sebanyak 1 ml.

Tuang ke dalam cetakan yang telah disiapkan.

Tunggu hingga gel agarose menjadi padat.

Bubuk gel agarose

Hasil

Skema Kerja Elektroforesis

Letakkan gel agarose padat ke dalam Gel Tank dan pastikan

letaknya sudah sesuai.

Tambahkan TBE 1X pH 8 sampai menggenangi gel agarose.

Gel agarose yang digunakan berkosentrasi 1,5%. Gel agarose ada 2:

1% : pori-pori lebih besar, untuk whole DNA (DNA murni) / DNA

utuh suatu organisme

1,5% : pori-pri lebih kecil, untuk pengujian DNA spesifik/potongan

khusus

Ambil 5 µL sampel DNA hasil PCR dan homogenkan dengan 1 µL

loading dye pada mikrotitter menggunakan mikropipet.

Masukkan ke dalam sumuran gel agarose secara hati-hati.

Marker 1Kb yang digunakan letakkan pada ujung dari agarose

sebanyak 6 µL.

Tutup alat elektroforesis sambungkan pada power supply dan tekan

power supply “ON”.

Tunggu hingga 60 menit untuk proses elektroforesis.

Angkat agarose dan rendam agarose dengan aquades selama 15

menit.

Visualisasikan agarose dengan menggunakan Gel Doc.

Elektroforesis

Hasil

FUNGSI ALAT DAN BAHAN

1. ddH2O atau TE Buffer : untuk melarutkan dan menambah kemurnian

DNA

2. DNA template: sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru

yang sama atau sebagai sampel DNA yang akan digandakan.

3. DNTPs: sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses

ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari

primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA

templat.

4. Primer: sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi

dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang

diperlukan untuk proses eksistensi DNA.

5. Primer F dan R: sebagai kodon yang mengawali dan mengakhiri sampel

DNA yg akan digandakan

6. Buffer: untuk menjamin pH medium.

7. DNA polymerase: sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada

proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA.

8. MgCl2: sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA

polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi

primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP

(senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh

pada spesifisitas dan perolehan proses.

9. Thermal cycler: sebagai alat yang melakukan proses PCR

10. 2x Go Taq Green PCR: bahan yang berisi basa-basa nitrogen untuk

memperbanyak DNA

11. TBE (Tris-Borate-EDTA “Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid”) buffer: membantu agar electron yang ada di DNA berjalan dan tidak meluber

kemana-mana

12. EtBr (Ethidium Bromide): untuk staining, bersifat karsinogenik

13. Loading dye: sebagai pemberat dan pewarna DNA

14. Ethanol: untuk menghilangkan residu dan meningkatkan kemurnian DNA

DAFTAR PUSTAKA

Austin, B. 1988. Metode-metode untuk Bakteriologi Akuatik (terjemahan Ratna Hadioetomo). PAU IPB. Bogor. p: 125-133.

Lo, D. 2006. Clinical Applications of PCR : Second Edition. New Jersey : Humana Press.

Nugroho, E. D. dan D. A. Rahayu. 2017. Pengantar Bioteknologi (Teori dan Aplikasi. Deepublish. Yogyakarta. 133 hlm.

Nurcahyo, H. 2011. Diktat Bioteknologi. Universitas Negeri Yogyakarta. Yogyakarta. 121 hlm.

Saru, A., A. R. Pratiwi, B. Rosida, E. T. Setiatin, dan Y. Yelita. 2004. Bioteknologi dan aplikasinya di berbagai bidang: suatu tinjauan umum. Artikel Ilmiah. ITB. Bogor. 18 hlm.

Sutarno. 2016. Rekayasa genetik dan perkembangan bioteknologi.Prosiding Biology Education.13(1): 23-27.

GLOSARIUM PRAKTIKUM PRINSIP BIOTEKNOLOGI AKUAKULTUR

1. Bioteknologi : Cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk

hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup

(enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan

jasa.

2. Diploid (2n) : Sel yang berisi dua set lengkap kromosom atau disebut

juga berjumlah 2n (n ialah jumlah pasangan kromosom).

3. DNA : Asam nukleat yang menyimpan semua informasi tentang

genetika.

4. DNA Polimerase: Enzim yang mengkatalisis polimerisasi nukleotida

menjadi untaian DNA.

5. DNA Templete : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen

yang akan digandakan.

6. Elektroforesis : Teknik yang digunakan untuk memisahkan makromolekul

(DNA, RNA dan Protein) berdasarkan ukurannya.

7. Gen : Bagian dari kromosom atau salah satu kesatuan kimia

(DNA) dalam lokus pada kromosom.

8. Genbank : Aplikasi untuk mengetahui kemiripan serta kode gen

dari objek yang diteliti.

9. Genom : Keseluruhan informasi genetik yang dimiliki suatu sel

atau organisme, atau khususnya keseluruhan asam nukleat yang memuat

informasi tersebut.

10. Haploid (n) : Sel yang hanya berisi satu set lengkap kromosom atau

disebut juga berjumlah n (n ialah jumlah pasangan kromosom).

11. Hepatopankreas: Organ terpenting pada udang yang memiliki fungsi

seperti hati dan pankreas pada mamalia.

12. Isolasi : proses pemindahan bakteri dari media asal ke media

buatan (baru) untuk memperoleh biakan murni.

13. Isolat : Biakan murni pertama yang dibuat dari sumber segar

aslinya.

14. Kromosom : Unit pewaris dalam inti dari semua sel eukariot yang

didalamnya tersusun oleh banyak DNA.

15. Kultur : Suatu metode untuk menanam atau memelihara sel atau

jaringan dalam suatu laboratorium.

16. Lisis : Peristiwa pecahnya sel karena kerusakan membran

plasma.

17. Patogen : Mikroorganisme parasit yang dapat menyebabkan penyakit pada

inangnya.

18. Polimerisasi : Suatu reaksi pengabungan molekul-molekul kecil

(monomer) yang membentuk molekul yang besar.

19. Primer : Rantai DNA pendek yang terdiri atas beberapa

nukleotida.

20. Purifikasi : Proses pemisahan mikroorganisme yang diinginkan dari

populasi campuran ke media biakan (buatan) untuk mendapatkan kultur

murni.

21. Residu : Ampas, sisa pengendapan dari sebuah zat tertentu yang

mengalami pemisahan kepekatan.

22. Sequencing : Penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul

DNA yang relatif pendek.

23. Similaritas : Sebuah kemiripan dalan gen satu ke gen yang lain yang

dihasilkan dengan sekuen yang telah ada di dalam Genbank.

24. Supernatan : Substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis

yang lebih rendah.

25. Transgenik : Proses pemindahan gen (transgen) ke organisme hidup

sehingga organisme memiliki sifat dan ciri-ciri baru yang akan diteruskan ke

keturunannya.

DAFTAR NAMA ASISTEN PRINSIP BIOTEKNOLOGI AKUAKULTUR 2020

No. Nama NIM No. HP / ID Line Alamat

1. Wahyu Pangestu Gusti 175080507111015 087866801298 /

wahyupgstJl. Kenanga Indah 1

2. Izzah Linatul Khariroh 175080500111007 081332943232 /

izzahlinaJl. MT. Haryono Gg. 5 No. 273

3. Winda Lestari Marhaningsih 175080500111023 085607799475 /

windalemJl. Sumbersari Gg. 1A No.82

4. Rizza Mayang Anggraini 175080500111003 081216868684 /

rizzamayangJl. Sumbersari Gg. 4 No. 225 K

5. Yolani Jamilatul Uswah 175080500111035 089616233153 /

yolanijamilatuluJl. Kerto Rahayu No. 41

6. Derliana Anantya Sari 185080500111014 081554592824 /

derlianantyasJl. Sumbersari Gg. 4 No. 280

7. Nanin Dewi Fitriyah 185080500111047 0895607999866 /

nanindewiJl. Sumbersari Gg. 4 No. 270

8 Nisa Wahyu 185080500111022 081232716505 / nisawahyuu

Jl. Kertorejo No. 33

9 Irsanti Mawaddah Nur 185080500111046 081252300342 /

mawaddahirsa31Jl. Sumbersari Gg. 2

10 Jamiilah Zahrotul Jannah 185080507111015 08970862432 /

jamiilahzjJl. Sumbersari No. 200 C

11. Khalimatus Sya’diyah 185080501111031 085848355892 /

lisakhalimatusJl. Kertosentono N0. 29

12. Kevin 185080501111013 082261303160 / sanjayakevin

Jl. Semanggi Barat No. 3 B