BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Bioteknologi merupakan suatu kajian yang berhubungan dengan

penggunaan organisme hidup atau produknya dalam proses industri

berskala-besar. Bioteknologi mikroorganisme adalah aspek bioteknologi

industri yang berhubungan dengan proses yang melibatkan

mikroorganisme.

Antibiotika merupakan senyawa kimia yang dihasilkan oleh

mikroorganisme, dan dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme

lain. Perkembangan antibiotika sebagai zat untuk pengobatan penyakit

infeksi lebih banyak mempengaruhi penggunaan obat dibandingkan

dengan perkembangan antibiotik itu sendiri (Goodfellow, 1983).

Antibiotika merupakan produk metabolisme sekunder. Meskipun

hasilnya relatif rendah dalam sebagian besar industri fermentasi, tetapi

karena aktivitas terapetiknya tinggi maka menjadi memiliki nilai

ekonomik tinggi, oleh karena itu antibiotika dibuat secara komersial

melalui fermentasi mikroba. Beberapa antibiotika dapat disintesis secara

kimia, tetapi karena kompleksitas bahan kimia antibiotika dan cenderung

menjadi mahal, maka tidak memungkinkan sintesis secara kimia dapat

mampu bersaing dengan fermentasi mikroorganisme lain yang mampu

diproduksi lebih banyak dari berbagai industri mikroorganisme (Madigan,

2003).

Salah satu bakteri penghasil antibiotika adalah Streptomyces

griceus yang termasuk kelompok Actinomycetes. Antibiotika yang

dihasilkan adalah Streptomisin, antibiotika golongan aminoglikosida yang

dapat menghambat bakteri Gram positif dan Gram negatif. Berdasarkan

konsep mutasi, mikroba dapat mengalami mutasi karena pengaruh

bermacam-macam mutagen, antara lain senyawa kimia dan pengaruh

fisika, misalnya radiasi sinar UV. Mutasi dapat pula terjadi secara alami,

karena penyimpanan yang terlalu lama. Manifestasi akibat mutasi

1

bermacam-macam, dapat terjadi perubahan secara morfologis maupun

fisiologis.

Mutasi yang terjadi pada bakteri bisa saja mempengaruhi

kemampuan dalam memproduksi antibiotika dan potensinya menghambat

bakteri sehingga perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui pengaruh

mutasi pada kemampuan bakteri Streptomyces griceus menghasilkan

antibiotika dan menghambat pertumbuhan bakteri lain. Salah satu metode

yang dapat digunakan adalah metode bioautografi. Bakteri yang digunakan

adalah Streptomyces griceus ATCC 10137 yang telah mengalami mutasi

alami setelah disimpan selama 20 tahun.

B. Rumusan Masalah

1. Apakah mutasi alami pada bakteri Streptomyces griceus ATCC 10137

menyebabkan perubahan kemampuan bakteri memproduksi

antibiotika?

2. Apakah antibiotika yang dihasilkan dari fermentasi bakteri

Streptomyces griceus ATCC 10137 sama dengan antibiotika

Streptomisin?

C. Tujuan

1. Memberikan informasi hasil fermentasi mutan bakteri Streptomyces

griceus ATCC 10137

2. Mengetahui proses pembuatan antibiotika dengan cara fermentasi

3. Mengetahui cara isolasi dan identifikasi antibiotika dengan

bioautografi

2

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Sejarah dan Perkembangan Antibiotika

Sejarah perkembangan penemuan antibiotik berawal dari penemuan oleh

Fleming yang terus berkembang sampai sekarang. Sekarang ini telah

ditemukan lebih dari 10.000 senyawa bahan alam yang dihasilkan dari

mikroba. Tahun 1940 sampai dengan awal tahun 1950 merupakan tahun

keemasan yaitu banyak ditemukan senyawa alam antibiotik yang berasal dari

mikroba. Hampir semua antibakteri penting seperti tetrasiklin, sefalosporin,

amiloglikosid, dan makrolida telah ditemukan pada tahun-tahun tersebut.

Menurut Berdy (2005) pada tahun 1940 sekitar 10-20 antibiotik telah

ditemukan, pada tahun 1950-an telah ditemukan 300-400 antibiotik, sekitar

tahun 1960 ditemukan 800-1000 antibiotik, tahun 1970 telah ditemukan 2500,

tahun 1980 telah ditemukan 5000, tahun 1990 telah ditemukan sekitar 10.000,

dan tahun 2000 telah ditemukan sekitar 20.000 antibiotik.

Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan oleh mikroba, dalam

konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan atau membunuh

mikroba lain. Setiap antibiotik mempunyai aktivitas penghambatan

pertumbuhan hanya terhadap mikroba patogen spesifik, yang disebut spektrum

penghambat. Mikroba penghasil antibiotik meliputi golongan bakteri,

actinomycetes, fungi, dan beberapa mikroba lainnya. Kurang lebih 70%

antibiotik dihasilkan oleh actinomycetes, 20% dihasilkan oleh fungi dan 10%

dihasilkan oleh bakteri. Streptomyces merupakan penghasil antibiotik yang

paling besar jenisnya (Berdy 2005).

Antibiotik dan produk alami (natural product) yang sejenis merupakan

metabolit sekunder yang dihasilkan oleh hampir semua tipe makhluk hidup,

seperti mikroba prokariotik, eukariotik, beberapa tumbuhan dan hewan.

Kemampuan menghasilkan metabolit sekunder sangat bervariasi pada setiap

spesies. Total jenis senyawa aktif yang dihasilkan oleh kelompok bakteri

adalah sebanyak 3.800 atau 17% dari total senyawa aktif yang telah

3

ditemukan. Actinomycetes menghasilkan lebih dari 10.000 senyawa aktif,

7.600 dihasilkan oleh Streptomyces dan 2.500 dihasilkan oleh actinomycetes

langka (Berdy 2005).

Pada siklus hidupnya yang normal, mikroba akan tumbuh dalam medium

yang sesuai dan menghasilkan jumlah sel maksimum. Setelah itu

pertumbuhannya berhenti dan memasuki fase stasioner, dan selanjutnya

masuk pada fase kematian terjadi kematian sel vegetatif (lisis) atau

pembentukan spora. Pada fase stasioner sel-sel berhenti membelah dan

metabolit sekunder mulai diproduksi. Metabolit sekunder sering diproduksi

dalam jumlah besar dan kebanyakan disekresikan ke dalam medium biakan.

Sebagian besar antibotik merupakan metabolit sekunder, akan tetapi ada

antibiotik merupakan metabolit primer, yaitu 14 antibiotik yang terbentuk

selama fase pertumbuhan eksponensial, misalnya antibiotik polipeptida nisin.

B. Bakteri Actinomycetes

Actinomycetes adalah bakteri yang banyak ditemukan ditanah. Bakteri ini

mempunyai miselia bercabang yang menyerupai bentuk cendawan/jamur

berfilamentus. Bakteri actinomycetes dikelompokkan ke dalam bakteri gram

positif, dan dibandingkan dengan kelompok bakteri lain mempunyai

perbedaan yang istimewa yaitu mengalami pembelahan morfologis yang

kompleks dan menghasilkan produk senyawa bioaktif. Menurut Holt et al

(1994) dan Madigan et al (2003) Actinomycetales dan genusnya dapat

dibedakan menjadi dua kelompok berdasarkan ciri morfologi dan kandungan

kimiawi dalam dinding sel yaitu Streptomyces dan Non-Streptomyces (jenis

jarang)

Actinomycetes merupakan suatu mikroba penghasil senyawa aktif

terbanyak dibandingkan dengan bakteri ataupun kapang, baik itu senyawa

aktif sebagai antimikroba, antikanker, antivirus, maupun antikolesterol.

Eksplorasi senyawa aktif dari yang berasal dari mikroba, selama ini diambil

dari sampel tanah (teristorial) atau dari tumbuhan. Namun demikian eksplorasi

4

senyawa aktif dari biota laut seperti hewan, tumbuhan, dan mikroba laut

belum banyak dilakukan.

Actinomycetes tersebar di lingkungan yang berbeda-beda. Pada daerah

kondisi panas, misalnya di daerah yang bersuhu lebih dari 60 °C maka

kemungkinan dapat ditemukannya actinomycetes thermofil menjadi lebih

besar. Di daerah yang berkadar garam tinggi, akan banyak diperoleh jenis

actinomycetes yang tahan terhadap kadar garam tinggi. Menurut Lam (2006)

peluang untuk mendapatkan senyawa aktif baru actinomycetes laut masih

sangat besar. Seperti halnya pada populasi actinomycetes tanah, kondisi

ekosistem laut juga berpengaruh terhadap jenis populasi actinomycetes laut.

Biodiversitas ekosistem laut sangat besar, seperti diketahui tingkat kedalaman

laut, kadar garam, dan pertemuan arus laut berpengaruh terhadap populasi

biota laut.

Pada awalnya actinomycetes digolongkan dalam kelompok fungi, sebab

penampakan morfologi dan perkembangannya yang mirip dengan fungi yang

dilihat dari miseliumnya, sehingga actinomycetes juga disebut ray fungi.

Namun demikian dengan berkembangnya ilmu pengetahuan, morfologi

actinomycetes lebih dekat dengan bakteri. Dilihat dari ukuran sel, spora serta

miselianya actinomycetes dikategorikan sebagai bakteri yang memiliki

nukleod yang sama dengan bakteri. Chitin dan selulosa sebagai penyusun

dinding sel fungi tidak terdapat pada actinomycetes. Penyusun dinding sel

actinomycetes adalah polimer gula, gula amino, dan beberapa asam amino

seperti halnya bakteri gram positif. Sensitifitas terhadap beberapa antibiotik

menempatkan actinomycetes termasuk dalam golongan bakteri gram positif.

Actinomycetes biasanya dipandang sebagai kelompok bakteri Gram-positif

yang memiliki kandungan Guanin (G) dan Citosin (C) yang tinggi di dalam

DNA-nya (>55%) dengan kemampuan membentuk cabang-cabang hifa pada

tahap-tahap pengembangannya (Locci et al. 1983).

Actinomycetes pada khususnya Streptomyces dikarakterisasi dengan

pertumbuhan koloni yang spesifik. Koloni actinomycetes bukan akumulasi

dari kumpulan sel-sel tunggal dan seragam seperti halnya bakteri, melainkan

5

bentuk masa filamen bercabang (Locci et al. 1983). Koloni yang tumbuh pada

medium padat tersusun secara vegetatif dan dengan miselia berantena atau

bersungut. Pada 8 koloni yang belum tumbuh miselianya, permukaan koloni

terlihat mengkilap. Pada genus Streptomyces, miselium tumbuh secara luas

menempel pada medium padat dan keseluruhan unit mudah diambil dengan

kawat Ose (Cross 1982). Dilain pihak koloni yang dibentuk oleh Nocardia

cenderung mudah terpisah setiap hifanya dan cenderung mudah pecah seperti

tepung. Apabila miselium berkembang, permukaannya cenderung seperti

tepung dan halus. Struktur, bentuk, ukuran dan warna dari koloni sangat

bervariasi dan dapat berubah sesuai dengan kondisi kulturnya. Kebanyakan

Streptomyces mengeluarkan bau yang khas seperti tanah. Asam asetat,

acetaldehida, etanol, isobutanol, dan isobutil asetat sekarang ini sudah

diidentifikasi sebagai aroma senyawa utama yang dihasilkan oleh

Streptomyces. Bahkan hidrogen sulfida dipercaya berperan dalam

pembentukan aroma tanah yang dikeluarkannya (Goodfellow 1983).

Miselium vegetatif actinomycetes berbentuk hifa non-septat yang panjang.

Beberapa hifa membentang dan panjangnya lebih dari 600 μm, bercabang,

melengkung/meliuk-liuk, dan cabangnya berbentuk monopodial. Miselium

vegetatif memiliki karakteristik berwarna, seperti kuning, oranye, merah,

hijau, coklat, atau hitam. Apabila terlarut dalam air, pigmen akan dikeluarkan

dalam medium.

Beberapa jenis Actinomycetes memiliki miselium aerial. Miselium aerial

merupakan bentuk dan struktur dari miselium vegetatif. Miselium aerial

muncul dari substrat miselium dan menutupi seluruh koloni, sehingga terlihat

seperti kapas atau tepung.Miselium aerial ada yang bersifat steril dan ada yang

fertil. Hifa steril umumnya tipis dan menunjukkan tidak adanya pertambahan

diameter. Hifa sporogenous awalnya tipis tetapi pada tahap akhir

perkembangannya menjadi lebih tebal. Fertil aerial micellium mengandung

sporosphores yang berbentuk panjang, lurus atau bengkok. Hifa pendek

memberikan permukaan koloni yang mirip tepung, sementara hifa panjang

menunjukkan permukaan menyerupai kapas.

6

Karakteristik aerial micellium lain dari Streptomyces adalah pigmentasi yang

dapat memiliki warna dari putih atau abu-abu sampai ke kuning, oranye, lavender,

biru, dan hijau, sehingga sering disebut sebagai ”colour wheel” (Locci et al.1983)

http://www.microbiologyprocedure.com/

Gambar 1 Morfologi aerial micellium Streptomyces

C. Bakteri Streptomyces griceus

Klasifikasi Bakteri Strepromyces griceus

Kingdom : Bacteria

Filum : Actinobacteria

Ordo : Actinomycetales

Famili : Streptomycetaceae

Genus : Streptomyces

Species : S. griseus

Streptomyces griseus adalah bakteri dari genus Streptomyces yang banyak

dijumpai di tanah. Beberapa strain dilaporkan juga ditemukan di sedimen dasar

laut. Bakteri ini merupakan bakteri Gram positif dengan kandungan GC yang

tinggi, dan dikena sebagai penghasil antibiotika dan metabolit sekunder lainnya.

Strain ini dikenal menghasilkan 32 jenis komponen bioaktif yang berbeda tipe

strukturnya. S. griseus pertama kali ditemukan oleh Waksman dan Henrici pada

tahun1948, oleh karena kemampuannya untuk menghasilkan streptomisin, yang

mempunyai aktivitas antibakteri terhadap organisme seperti Yersinia pestis dan

Mycobacterium tuberculosis.

7

Streptomyces griseus dan strainnya bersifat alkalifilik, dan bertumbuh paling

baik pada pH basa. Meskipun organisme ini bertumbuh pada rentang pH yang

luas (5-11), pertumbuhan optimum terjadi pada pH 9. Bakteri ini menghasilkan

massa spora abu-abu dan pigmen abu-abu kuning dalam bentuk koloni. Sporanya

memiliki permukaan yang lembut dan berbentuk rantai lurus.

D. Strain Mikroorgansime Untuk Industri

1. Asal Strain Industri

Sumber utama semua strain mikroorganisme industri adalah lingkungan

alaminya. Tetapi setelah beberapa tahun, sebagai proses mikrobiologi berskala-

besar maka strain dapat menjadi sempurna, sejumlah strain industri disimpan

pada koleksi biakan.

2. Perbaikan Strain Untuk Industri

Seperti kita ketahui, bahwa sumber asal mikroorganisme industri adalah

lingkungan alaminya, tetapi isolat asal tersebut akan dimodifikasi secara besar

besaran di laboratorium. Sebagai akibat modifikasi tersebut, dapat diharapkan

penambahan perbaikan dalam menghasilkan suatu produk. Peningkatan

perbaikan yang paling dramatik, contohnya terjadi pada penisilin, antibiotik

yang dihasilkan oleh fungi Penicillium chrysogenum. Pertamakali dihasilkan

pada skala besar, penisilin diperoleh sebanyak 1-10 mg/ml. Setelah beberapa

tahun, sebagai hasil perbaikan strain dengan merubah kondisi pertumbuhan dan

medium, hasilnya meningkat menjadi 50.000 mg/ml.

Yang menarik ialah, peningkatan hasil sampai 50.000 kali-lipat diperoleh

melalui mutasi dan seleksi; tidak melibatkan manipulasi rekayasa genetika.

Selanjutnya diperkenalkan teknik genetika baru, walaupun lebih sederhana,

hasilnya meningkat.

E. Syarat-syarat Mikrooorganisme Industri

Suatu mikroorganisme dianggap layak digunakan dalam industri, bukan saja

mampu menghasilkan substansi yang menarik, tetapi harus lebih dari itu.

Mikroorganisme harus tersedia sebagai biakan murni, sifat genetiknya harus

8

stabil, dan tumbuh dalam biakan berskala-besar. Bikan juga harus dapat dipelihara

dalam periode waktu yang sangat panjang di laboratorium dan dalam ‘plant’

industri. Biakan tersebut lebih disukai jika dapat menghasilkan spora dan bentuk

sel reproduktif lain sehingga mikroba mudah diinokulasikan ke dalam fermentor

besar.

Karakteristik penting yang harus dimiliki mikroorganisme industri yaitu harus

tumbuh cepat dan menghasilkan produk yang diharapkan dalam waktu yang

relatif singkat, karena alasan sebagai berikut:

1. Alat-alat yang digunakan pada industri berskala besar termasuk mahal, hal

tersebut tidak menjadi masalah (secara ekonomi) jika produk dapat

dihasilkan dengan cepat;

2. Jika mikroorganisme tumbuh dengan cepat, kontaminasi fermentor akan

berkurang;

3. Jika mikroorganisme tumbuh dengan cepat, akan lebih mudah

mengendalikan berbagai faktor lingkungan dalam fermentor.

Sifat penting lain yang harus dimiliki mikroorganisme industri adalah:

a) Tidak berbahaya bagi manusia, dan secara ekonomik penting bagi hewan

dan tumbuhan.

b) Harus non-patogen dan bebas toksin, atau jika menghasilkan toksin, harus

cepat di-inaktifkan. Karena, ukuran populasi besar dalam fermentor

industri, sebenarnya tidak memungkinkan menghindari kontaminasi dari

lingkungan luar fermentor, suatu patogen yang ada akan mampu

mendatangkan masalah.

c) Mudah dipindahkan dari medium biakan. Di laboratorium, sel

mikroorganisme pertamakali dipindahkan dengan sentrifugasi, tetapi

sentrifugasi bersifat sulit dan mahal untuk industri skala-besar.

d) Mikroorganisme lebih disukai jika berukuran besar, karena sel lebih

mudah dipindahkan dari biakan dengan penyaringan (dengan bahan

penyaring yang relatif murah). Sehingga, fungi, ragi, dan bakteri

9

berfilamen, lebih disukai. Bakteri unisel, berukuran kecil sehingga sulit

dipisahkan dari biakan cair.

e) Terakhir, mikroorganisme industri harus dapat direkayasa secara genetik.

Dalam bioteknologi mikroorganisme tradisional peningkatan hasil

diperoleh melalui mutasi dan seleksi. Mutasi akan lebih efektif untuk

mikroorganisme. Dalam bentuk vegetatif dan haploid, dan bersel satu.

Pada organisme diploid dan bersel banyak mutasi salah satu genom tidak

akan menghasilkan mutan yang mudah diisolasi. Untuk fungi berfilamen,

lebih disukai yang menghasilkan spora, karena filamen tersebut tidak

mampu mempermudah rekayasa genetika. Organisme juga diharapkan

dapat direkombinasi secara genetik, juga dengan proses seksual dan

beberapa jenis proses paraseksual. Rekombinasi genetik juga dapat

memungkinkan ada penggabungan genom tunggal sifat genetik dari

beberapa organisme. Teknik yang sering juga digunakan untuk

menciptakan hibrid, bahkan tanpa melalui siklus seksual adalah

fusi/penggabungan protoplasma, menyertai regenasi sel vegetatif dan

seleksi progeni hibrid. Bagaimanapun, beberapa strain industri sudah

diperbaiki secara genetik tanpa menggunakan rekombinasi genetika.

F. Pembuatan Antibiotik

Antibiotik adalah produk metabolisme yang dihasilkan oleh mikroorganisme

tertentu yang mempunyai sifat dapat menghambat pertumbuhan atau merusak

mikroorganisme lain. Antibiotik pertama yang digunakan untuk mengobati

penyakit pada manusia adalah tirotrisin. Antibiotik ini diisolasi dari bakteri

Bacillus brevis (suatu bakteri tanah) oleh Rene Dubois. Penelitian tentang

antibiotik pertama kali dilakukan oleh A. Gratia dan S. Dath pada tahun 1924.

Dari hasil penelitian ini dihasilkan actinomisetin dari Actinomycetes. Pada tahun

1928 Alexander flemming menemukan antibiotik penisilin dari jamur Penicillium

notatum. Antibiotik ini mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus

aureus.

10

Antibiotik digunakan untuk melawan berbagai infeksi mikroorganisme

patogen. Mikroorganisme patogen adalah mikroorganisme yang menyebabkan

penyakit. Antibiotik dibuat dengan cara tertentu. Tahap-tahap pembuatan

antibiotik adalah sebagai berikut.

1. Mikroorganisme penghasil antibiotik dikembangbiakkan

2. Mikroorganisme dipindahkan ke dalam bejana fermentasi yang berisi

media cair. Pada bejana fermentasi ini mikroorganisme dipacu untuk

berkembang biak dengan cepat.

3. Dari cairan biakan mikroorganisme tersebut, antibiotik diekstraksi dan

dimurnikan, kemudian dilakukan pengujian pertama kali dengan cara diuji

di dalam laboratorium menggunakan cawan petri, apakah antibiotik

tersebut dapat mematikan kuman atau tidak. Kedua, antibiotik diujikan

pada hewan percobaan. Ketiga, apabila hasil pengujian pada hewan

percobaan ternyata aman, maka antibiotik ini dapat diujikan pada

sekelompok orang dengan pengawasan ketat dari para ahli.

G. Proses Fermentasi

Fermentasi adalah segala macam proses metabolisme (enzim, jasad renik

secara oksidasi, reduksi, hidrolisa atau reaksi kimia lainnya) yang melakukan

perubahan kimia pada suatu substrat organik dengan menghasilkan produk akhir.

Fermentasi juga merupakan aplikasi metabolisme mikrobia untuk mengubah

bahan (Industri) bahan baku produk yang bernilai lebih tinggi misalnya: etanol,

asetat, antibiotik, enzim, vitamin, protein sel tunggal dan sebagainya.

Fermentasi biasanya menggunakan satu macam mikroorganisme yang telah

terseleksi. Namun pada fermentasi dual atau multiple digunakan lebih dari satu

mikroorganisme. Organisme ini dapat diinokulasikan ke dalam substrat secara

simultan. Fermentasi ini dilarutkan untuk menghasilkan produk yang tidak dapat

dilakukan hanya dengan semacam mikroorganisme saja, atau untuk menghasilkan

produk fermentasi yang berbeda tetapi mempunyai nilai ekonomis lebih tinggi.

Sebagai contoh fermentasi untuk memproduksi cuka, pertama yeast diperlukan

11

untuk menghasilkan etil alkohol, kemudian Acetobacter digunakan untuk merubah

alkohol menjadi cuka.

Fermentasi dapat dilakukan dengan cara batch per batch atau secara kontinyu.

Pada fermentasi batch, pertumbuhan mikroorganisme dan sintesis produk

berlangsung dalam media, kemudian setelah sintesis produk maksimum, semua

substrat diambil bersamaan dan dilakukan proses isolasi produk. Pada fermentasi

kontinu, media nutrien ditambahkan secara terus menerus, diimbangi dengan

pengambilan substrat dari fermentor juga secara terus menerus untuk

mendapatkan sel-sel atau produk fennentasi. Selama fermentasi diperlukan tempat

yang berisi media bernutrisi untuk pertumbuhan mikroorganisme, sehingga

organisme tersebut dapat berkembang dan menghasilkan produk yang diinginkan.

Di dalam laboratorium, fermentasi antibiotik dapat dilakukan dengan berbagai

cara antara lain:

1. Pada media padat.

Penelitian mikroorganisme penghasil antibiotik biasanya membutuhkan

media padat untuk pertumbuhannya. Misalnya pada waktu skrining, suspensi

mikroorganisme terpilih ditumbuhkan pada media padat, setelah inkubasi

dalam waktu cukup, aktivitas antibiotik yang dihasilkan dapat diuji terhadap

berbagai bakteri indikator. Dalam hal fermentasi antibiotik pada media padat,

temperatur dan komposisi media merupakan faktor yang sangat penting dan

menentukan keberhasilan produksi antibiotik. Untuk mengontrol temperatur

supaya konstan dan sesuai dengan yang dikehendaki, dapat menggunakan

inkubator atau alat lain.

2. Pada media cair dengan shaker

Fermentasi antibiotik biasanya menggunakan fermentor untuk

pertumbuhan biakan submerged. Namun jika fermentor tidak tersedia, teknik

shake flask dapat dipakai untuk menggantikannya, tetapi dengan kondisi lebih

terbatas dan kontrol parameter kurang optimum dibandingkan dengan

fermentor. Teknik ini biasanya digunakan untuk berbagai percobaan fermentasi

pendahuluan sebelum menggunakan fermentor sebenarnya. Sebagai con toh,

12

setelah organisme diperoleh sebagai biakan murni, maka perlu memeriksa

karakteristik biokimia atau morfologi mereka dengan menumbuhkannya pada

kondisi biakan submerged. Untuk tujuan tersebut teknik shake flask dapat

digunakan karena sederhana dan dapat memberikan informasi yang hetguna.

lnformasi yang dapat diperoleh dri percobaan dengan teknik ini antara lain,

komposisi medium, tingkat aerasi, pola pH dan parameter-parameter yang

berkaitan dengan pertumbuhan dan produk yang dihasilkan.

Pengaturan temperatur dapat dilakukan dengan menggunakan inkubator

shaker atau dengan meletakkan shaker pada ruangan yang dikontrol

temperaturnya misalnya dengan menggunakan heater dan termostat untuk

mengontrol temperatur yang diperlukan.

Flask dapat menggunakan baffled flask atau plain flask. Pada baffled flask

laju transfer oksigen akan lebih tinggi dan biasanya menyebabkan terjadinya

buih. Agitasi pada shake flask selain memberikan aerasi juga memungkinkan

transfer substrat dan organisme. Pada waktu fermentasi menggunakan shake

flask, biasanya akan terjadi kehilangan air dari medium karena evaporasi.

Seperti pernah diamati oleh Solomons (1969) pada medium biakan 100 ml

dalamflask. 1000 ml dengan waktu inkubasi 48 jam pada temperatur 37�C,

agitasi menggunakan reciprocating shaker laju transfer oksigen ï½ 55 mMO2/

1 /jam, maka kehilangan air mencapai 20%. Untuk mengimbangi kehilangan

air ini, ke dalam medium dapat ditambahkan akuades.

Teknik shake flask pertama kali dilakukan oleh Kluyver dan Perquin

(1933). Pada dasarnya ada dua macam mekanisme dari teknik ini.

- Reciprocating shaker.

Variasi dapat dilakukan dengan mengatur panjang stroke. Keuntungan alat

ini, secara mekanis lebih sederhana dibandingkan rotary shaker.

Kecepatannya dapat diatur misalnya 60 � 120 stroke per menit. Panjang

stroke juga dapat diatur misalnya 4 � 8 cm. Alat ini paling sesuai

digunakan untuk menumbuhkan organisme uniseluler bakteri dan yeast.

- Rotary shaker, bergerak dengan arah melingkar.

13

Variasi dapat dilakukan dengan mengatur panjang radius orbit. Alat ini

dianggap sebagai tipe standar karena dapat digunakan untuk menumbuhkan

semua mikroorganisme termasuk sel tanaman dan hewan. Alat ini selain

mempunyai kekuatan senfrifugal juga harus mampu beroperasi pada

kecepatan tinggi. Kecepatan dapat diatur misalnya antara 100 - 400 rpm

dan radius orbit juga dapat diatur misalnya 1½ - 5 cm

3. Pada media cair dengan fermentor

Teknik shake flask dengan rotary shaker atau reciprocating shaker

merupakan cara konvensional dan berguna pada tahap pendahuluan proses

fermentasi, penelitian dan pengembangan dalam laboratorium fermentasi.

Namun cara ini akan memberikan estimasi kondisi fermentasi skala besar

yang kurang baik mengenai potensi mikroorganisme dalam mensintesis

produk. Oleh karena itu untuk mendapatkan estimasi kondisi fermentasi

yang ideal perlu menggunakan fermentor volume kecil. Karena kondisi

fermentasi dalarn fermentor kecil ini akan lebih menggambarkan kondisi

fermentasi skala besar yang sebenarnya.

Fermentor berfungsi menyediakan lingkungan bagi pertumbuhan

organisme atau sel di bawah kondisi terkontrol. Dalam industri fermentasi,

fermentor harus memungkinkan pertumbuhan dan biosintesis paling baik

bagi biakan mikroba (yang bermanfaat bagi industri) dan memberikan

kemudahan untukmanipulasi semua operasi yang berhubungan dengan

penggunaan fermentor. Fermentor harus dilengkapi pengontrol dan

pengatur kondisi fermentasi misalnya kontrol temperatur dengan mengatur

pemanas atau pendingin, kontrol pH dengan menambah asam atau alkali,

kontrol agitasi dengan mengatur kecepatan stirrer dan ukuran impeller,

kontrol aerasi dengan mengatur aliran gas dan kecepatan stirrer dan

sebagainya. Bejana biakan merupakan bagian pokok dari setiap

fermentasi, karena di dalam bejana inilah proses biologis akan

berlangsung. Oleh karena itu bejana ini harus terjamin keamanannya

selama proses berlangsung dan tahapan operasional dapat dilakukan

14

dengan mudah. Bejana harus cukup kuat untuk menahan tekanan dari

media dan udara. Penyusunannya harus tidak terkoreksi oleh produk

fermentasi dan tidak melepaskan ion toksik ke media pertumbuhan.

Fermentasi biasanya memerlukan waktu lama. Operasinya dapat berlangsung

beberapa hari, bahkan pada fermentasi kontinu dapat berlangsung beberapa

minggu. Fermentasi berlangsung pada kondisi aseptik, jadi fermentor harus

menjamin sterilitas kandungannya dan terpeliharanya kondisi aseptik selama

periode operasi. Demikian juga alat-alat penambah inokulum, antifoam, nutrien,

asam atau alkali dan sebagainya harus menjamin kondisi aseptik dan mencegah

terjadinya kontaminasi mikroba yang tak dikehendaki. Berdasarkan proses

penyebaran organisme dan media dalam bejana, Bull et.al. mengelompokkan jenis

fermentor ke dalam 3 grup :

- Reaktor dengan agitasi internal.

Merupakan biorekator yang paling lazim digunakan di berbagai industri

fermentasi. Grup ini termasuk stirred tank reactor.

- Bubble column bioreactor.

Merupakan bioreaktor paling sederhana. Terdiri dari tabung panjang dengan

beberapa sparger di bagian dasarnya. .

- Loop reactor.

Merupakan collumn reactor di tnana percampuran dan sirkulasi diinduksi

dengan alat-alat tertentu.

Berdasarkan penggunaan alat tersebut, fermentor ini dikelompokkan atas tiga

jenis:

a ) Air lift loop reactor .

b) Pro peller'loop reactor.

c) Jet loop reactor .

Semua sistem fermentasi memerlukan homogenitas media maupun

mikroorganisme. Sistem agitasi memungkinkan distribusi tersebut dengan

meniadakan gradien konsentrasi seperti unsur media, pH, temperatur dan

sebagainya. Sistem fermentasi aerob, merupakan proses industri fermentasi yang

15

sangat penting. Dalam fermentasi aerob, selain tugas tersebut sistem agitasi

mempunyai tugas tambahan memecah gelembung udara besar menjadi gelembung

yang lebih kecil untuk menambah area permukaan gas dan membantu mentransfer

oksigen ke dalam biakan serta menyebarkann oksigen. Impeller mempunyai

peranan penting untuk menyelesaikan tugas tersebut dan keberhasilannya

tergantung pada beberapa faktor antara lain kekuatan atau kecepatan rotasi,

ukuran dan desain impeller, densitas dan viskositas substrat, kecepatan aliran gas

dan sebagainya. Ada beberapa tipe impeller yang biasanya digunakan dalam

fermentor antara lain disc turbine, vaned disc, open turbine dan marine propeller.

Disc turbine merupakan tipe impeller yang paling lazim digunakan di berbagai

industri fermentasi.

Cara bekerjanya untuk melakukan aerasi dan agitasi dapat dikelompokkan ke

dalam dua kelompok:

1) Impeller bekerja tanpa baffle.

Jika impeller cukup cepat, maka akan terjadi vortex dari permukaan substrat,

sehingga menarik udara ke dalam sistem. Tipe sistem fermentor ini juga

disebut sebagai vortex aeration. Keuntungan sistem ini aerasinya efisien yaitu

aerasi berlangsung cukup baik tanpa tenaga relatif besar. Sedang kerugiannya

yaitu kesukaran untuk scale up karena kesulitan mendapatkan kesamaan aliran

pada dua ukuran bejana yang berbeda.

2) Impeller bekerja menggunakan baffle.

Tipe ini paling lazim digunakan dan biasanya baffle diletakkan vertikal

untuk menghalangi arus perputaran cairan sehingga memungkinkan substrat

mengalami turbulensi. Sistem fermentasi aerob memerlukan udara steril yang

dimasukkan ke dalam fermentor. Cara yang biasa digunakan dengan

melewatkan udara melalui filter steril. Udara memasuki fermentor biasanya

melalui pipa yang terletak di bawah impeller dan udara mengalir melalui

sparger. Gas yang memasuki fermentor dapat menimbulkan tekanan positif di

dalam fermentor, maka laju aliran udara harus dikontrol, demikian juga sistem

pengeluaran gas.

16

Setiap mikroorganisme mempunyai temperatur pertumbuhan berbeda dan

kadang-kadang suatu organisme mempunyai temperatur pertumbuhan berlainan

dengan temperatur untuk produksi antibiotik. Supaya pertumbuhan dan produksi

antibiotik optimum maka temperatur optimum dalam fermentor harus

dipelihara/dipertahankan. Organisme yang aktif metabolismenya, biasanya

menghasilkan panas yang terakumulasi pada fermentor. Karena itu kontrol

temperatur harus dilakukan dengan mengalirkan air pendingin.

Pada waktu mikroorganisme mensintesis produk metabolit, pH substrat

dapat mengalami perubahan karena hasil metabolit mungkin sangat alkali atau

asam. Tentu perubahan pH ini tidak disukai oleh mikroorganisme tersebut, karena

dapat mengganggu pertumbuhannya dan pada gilirannya dapat mempengaruhi

pembentukan produk. Untuk menjaga kemungkinan tersebut, selama proses

fermentasi berlangsung ke dalam substrat sering ditambahkan penyangga untuk

memperlambat atau mengurangi perubahan pH yang terlalu besar. Buffer mungkin

hanya sebagai penyangga pH tapi dapat juga berperan ganda yaitu sebagai

penyangga pH dan sumber nutrien.

Suatu antibiotika yang dihasilkan secara komersial, pada awalnya harus

berhasil diproduksi pada fermentor industri berskala-besar. Salah satu gugus-tugas

penting adalah pengembangan efisiensi metode pemurnian. Metode elaborasi

(yang terperinci) sangat penting dalam ekstraksi dan pemunian antibiotika, karena

jumlah antibiotika yang terdapat dalam cairan fermentasi hanya sedikit

Jika antibiotika larut dalam pelarut organik yang tidak dapat bercampur

dengan air, maka pemurniannya relatif lebih mudah, karena memungkinkan untuk

mengekstraksi antibiotika ke dalam suatu pelarut bervolume kecil, sehingga lebih

mudah mengumpulkan antibiotika tersebut. Jika antibiotika tidak larut dalam

pelarut, selanjutnya harus dipindahkan dari cairan fermentasi melalui adsorpsi,

pertukaran ion, atau presipitasi secara kimia. Pada semua kasus, tujuannya untuk

memperoleh produk kristalin yang sangat murni, meskipun sejumlah antibiotika

tidak mudah terkristalisasi dan sulit dimurnikan.

Produksi antibakteri melalu proses fermentasi dapat menggunakan sel utuh

(whole cells) atau menggunakan sel amobil (immobilized cells). Amobilisasi sel

17

didefinisikan sebagai suatu metode untuk menjebak atau menempatkan sel

mikroba secara fisik pada suatu ruang tertentu dan pada kondisi ini sel masih

memiliki aktivitas, serta dapat dipergunakan secara kontinyu dan berulang kali.

Implementasi sel amobil banyak digunakan baik di bidang industri obat antara

lain untuk produksi antibiotika, enzim maupun industri makanan.

Teknik amobilisasi sel dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu ikatan

dengan carrier, ikatan silang dan metode penjebakan. Metode penjebakan

biasanya dilakukan dalam matrik polimer dan merupakan metode yang paling

sering dipelajari untuk dikembangkan.

H. Isolasi Streptomyces griceus

Isolasi mikroba dari alam merupakan tahap awal dalam penapisan

metabolit mikroba seperti antibiotik. Pada prinsipnya tujuan isolasi mikroba yaitu

untuk mendapatkan mikroba yang dikehendaki sebanyak-banyaknya. Untuk

maksud tersebut dapat digunakan teknik medium diperkaya dan sistem

pengenceran. Untuk mendapatkan Streptomyces telah digunakan medium khusus

yaitu Medium International Streptomyces Project (ISP). Fungi dapat dihilangkan

dengan menambahkan antifungi seperti nistatin atau sikloheksimid ke dalam

medium, dan bakteri dapat dieliminiasi dengan menambahkan beberapa

antibiotika ke dalam medium. Selain itu parameter kondisi lingkungan juga harus

diperhatikan seperti pH, suhu dan sebagainya. Sebagian besar bakteri lebih peka

terhadap pH asam, sedangkan fungi lebih tahan terhadap rentang pH yang lebih

lebar. Suhu inkubasi dapat meningkatkan isolasi mikroba yang dikehendaki.

Isolasi anggota aktinomisetes pada umumnya menggunakan suhu inkubasi 28 –

30 N C.

Streptomyces griceus merupakan bakteri yang efektif dalam menggunakan

substrat. Sebagai organisme heterotrof, bakteri ini memerlukan bahan organik

sebagai sumber karbon bagi kelangsungan hidupnya.

I. Identifikasi Antimikroba menggunakan Bioautografi

18

J.

19

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Produksi biomassa Streptomyces griseus

Kultur pada media persediaan Potato Dextrose Agar dipindahkan ke

dalam 10 mL media pertumbuhan ISP-4 cair, dikocok 180 putaran per menit

(PPM) selama 24 jam pada suhu 28ºC. Sebanyak 5 mL suspensi dipindahkan

ke dalam 50mL media pertumbuhan ISP-4 cair, dikocok 180 PPM pada suhu

28º C dan pH awal 7,3. Pengambilan sampel untuk membuat kurva

pertumbuhan dilakukan setiap tiga jam, disentrifugasi, supernatan dibuang, sel

dicuci dengan air suling, dikeringkan pada suhu 105ºC sampai diperoleh berat

konstan. Kecepatan pertumbuhan dinyatakan sebagai berat kering sel per

satuan waktu (hari).

B. Produksi AAG dari mutan Streptomyces griseus

Kultur pada media persediaan PDA dipindahkan ke dalam 25 mL media

pertumbuhan cair, dikocok 180 PPM selama 24 jam pada suhu 28ºC.

Sebanyak 20 mL suspensi dipindahkan ke dalam 200 mL media pertumbuhan

Sg2, diinkubasi pada rotary shaker dengan kecepatan pengocokan 180 PPM

pada suhu 28ºC sampai awal fase stasioner, disentrifugasi 6000 PPM selama

10 menit, supernatan dibuang, sel dicuci dua kali masing-masing dengan 2,5

mL NaCl 0,9%, disentrifugasi 6000 PPM selama 10 menit. Supernatan

dibuang, sel dimasukkan dalam media SgP1 sebanyak 10% (b/v), diinkubasi

pada rotary shaker dengan kecepatan pengocokan 180 PPM pada suhu 28ºC

selama empat hari.

C. Pemisahan dan karakterisasi antibiotika Streptomyces griseus

Dari kaldu fermentasi dilakukan dengan penyerapan menggunakan arang

aktif, diikuti dengan kromatografi kolom penukar kation Amberlite CG-50

(NH4+) menurut Isnaeni (1998), merupakan modifikasi metode isolasi yang

telah dilakukan oleh Okachi and Nara (1977).

20

D. Penapisan AAG mutan Streptomyces griseus

Penapisan AAG ditujukan untuk mengetahui adanya inti streptidin dan 2-

DOS dalam antibiotika mutan Streptomyces griseus . Eluat kromatografi

kolom filtrat hasil fermentasi ditotolkan pada kertas kromatografi, dikeringkan

dan disemprot dengan pereaksi warna Sakaguchi dan Na-nitroprusid untuk

identifikasi gugus guanidin dalam inti streptidin. Warna ungu kemerahan akan

tampak setelah kertas dikeringkan. Sebagai penampak noda untuk 2-DOS

digunakan ninhidrin. Warna biru keunguan akan tampak setelah kertas

dipanaskan pada suhu 110ºC selama 10 menit (Isnaeni, 1998).

E. Bioautografi Antibiotika Mutan Streptomyces griceus ATCC 10137

Fraksi aktif hasil kromatografi kolom dikumpulkan, dipekatkan dengan

liofilisasi menggunakan freeze dryer. Sebanyak 6 µL konsentrat ditotolkan

pada lempeng KLTKT, dielusi dengan larutan KHPO4 5%. Bioautogram

dibuat dengan cara meletakkan hasil KLTKT (yang telah dikeringkan dengan

aliran udara untuk menghilangkan sisa eluen) di atas permukaan media agar

perbenihan dalam cawan petri yang berisi media Nutrient Agar mengandung

bakteri uji Bacillus subtilis PCI-219 (0,5 µL/15 mL media), kemudian

disimpan di dalam lemari es selama dua jam agar proses difusi senyawa dalam

noda kromatogram ke dalam media sempurna. Cawan petri dikeluarkan dari

lemari es, lempeng KLTKT diangkat dari permukaan agar, biakan diinkubasi

pada suhu 30N C selama 24 jam. Zona yang terbentuk pada posisi noda

diamanti dan diukur diameternya.

21

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Produksi biomassa mencapai puncak pada jam ke 24 dengan jumlah sel

6,40 g/10 mL, sehingga untuk pemindahan biomassa ke dalam fermentasi

atau produksi antibiotika dilakukan 24 jam setelah inokulum awal dikocok

dalam media pertumbuhan. Bentuk kurva mengikuti bentuk kurva

pertumbuhan secara umum; yaitu bell shape, seperti kurva pertumbuhan S.

Fradiae dan S. kanamyceticus.

Hubungan antara produksi biomassa dengan produksi antibiotika ternyata

mengikuti pola non-assiciated. Potensi antibiotika (dinyatakan sebagai diameter

zona hambat) mencapai puncak pada jam ke-66, pada saat jumlah sel mulai

22

menurun karena lisis dan pH optimal untuk fermentasi pada saat itu adalah 8,28.

Fermentasi dihentikan pada jam ke-66, untuk selanjutnya diisolasi dan identifikasi

antibiotika. Pembentukan antibiotika aminoglikosida dalam streptomyces terjadi

antara fase sporulasi dan germinasi, untuk melindungi hifa yang masih muda dari

pengaruh lingkungannya.

Hasil penapisan menunjukkan bahwa fraksi aktif hasil kromatografi kolom

menunjukkan daya hambat terhadap Bacillus subtilis, Eschericia coli dan

Staphylococcus aereus. Fraksi aktif juga memberikan reaksi positif terhadap Na-

nitroprusid suatu reaksi identifikasi untuk menunjukkan adanya inti guanidin.

23

Untuk memastikan apakah inti guanidin tersebut merupakan bagian molekul

streptomisin atau senyawa lain, dilanjutkan identifikasi dengan KLTKT.

Salah satu keuntungan metode bioautografi adalah selain untuk pemisahan

dan identifikasi, juga dapat digunakan untuk mengetahui aktivitas biologis secara

langsung dari matrik yang kompleks, terutama terkait dengan kemampuan suatu

senyawa menghambat pertumbuhan mikroba. Bioautografi secara langsung pada

KLT ekstrak tanaman untuk uji antifungi telah dilakukan menggunakan beberapa

jamur patogen sebagai mikroba uji. Dari kromatogram KLTKT dapat diketahui

jumlah komponen dalam sampel yang ditotolkan berdasarkan jumlah noda

(dengan penampak noda yang sesuai), sedangkan data bioautogram memberikan

informasi jumlah komponen sampel yang memiliki aktivitas terhadap mikroba uji

baik secara kualitatif maupun kuantitatif.

Bioautogram KLTKT fraksi aktif hasil kromatografi kolom filtrat hasil

fermentasi antibiotika mutan Stretomyces griceus ATCC 10137 menunjukkan dua

noda dengan harga Rf yang jauh berbeda. Streptomisin standar (S) menghasilkan

Rf 0,15, sedangkan antibiotika dalam filtrat hasil fermentasi (F1) memberikan

harga Rf 0,65. Kedua noda memberikan daya hambat terhadap bakteri uji, sedang

fraksi F2 dan F3 tidak menunjukkan aktivitas. Untuk meyakinkan bahwa noda F1

hanya terdiri dari satu komponen dan untuk menentukan struktur senyawa

tersebut, perlu dilakukan identifikasi lanjut dengan mengunakan instrumen lain,

misalnya HPLC dan GC-MS. Hasil identifikasi lanjut akan memberikan

informasi, apakah antibiotika yang dihasilkan mutan Streptomyces griseus ATCC

10137 termasuk antibiotika baru. Penelitian ini hanya melakukan identifikasi

secara kualitatif, untuk membandingkan potensi antibiotika hasil fermentasi

dengan streptomisin perlu dicari terlebih dahulu Konsentrasi Hambat Minimum

(Minimum Inhibition Concentration). Selanjutnya dibuat suatu seri konsentrasi

baku streptomisin yang mewakili konsentrasi rendah, menengah dan tinggi untuk

menentukkan rasio potensi antibiotika analit.

24

BAB V

KESIMPULAN

1. Mutasi bisa menyebabkan perubahan komposisi senyawa yang dihasilkan

oleh bakteri Streptomyces griceus ini dibuktikan dengan perbedaan harga

Rf pada kromatogram dimana senyawa yang dihasilkan berbeda dengan

streptomisin.

2. Bioautografi dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa, juga

mengetahui aktivitas biologis secara langsung dari senyawa tersebut

25

DAFTAR PUSTAKA

Budiyanto, A. Muhtadi. F. 2012. Peranan Bakteri Actinomycetes dalam Industri

Antibiotik. Jurnal Online Biosains Volume 1. Universitas Airlangga.

Surabaya. Diakses tanggal 21 Oktober 2013.

www.aguskrisno.wordpress.com

Isnaeni. 2005. Bioautografi Antibiotika Hasil Fermentasi Mutan Streptomyces

griceus ATCC 10137. Majalah Farmasi Airlangga Vol.5 No.1. Diakses

tanggal 21 Oktober 2013.

Isnaeni,dkk. 2006. Aktivitas Antibakteri Sel Amobil Streptomyces Sp-1 dalam

Matrik Ca-alginat dan Ba-alginat terhadap terhadap Staphylococcus

aureus. Majalah Farmasi Airlangga 2006. Diakses tanggal 22 Oktober

2013.

http://id.wikipedia.org/wiki/Streptomyces Diakses tanggal 22 Oktober 2013.

http://id.wikipedia.org/wiki/Streptomyces-griceus Diakses tanggal 22 Oktober

2013.

26