laporan mikro isolasi bakteri1

8/10/2019 Laporan Mikro Isolasi Bakteri1

1/22

LAPORANPRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

ISOLASIBAKTERI

Oleh:

Sri Lestari

Nim.11630052

JURUSANKIMIA

FAKULTASSAINSDANTEKNOLOGI

UNIVERSITASISLAMNEGERIMAULANAMALIKIBRAHIM

MALANG

2014


2/22

BAB I

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna

dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu

cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat

sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan

sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga

berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel

bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan selbakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian

mikrobiologi.

Oleh karena itu praktikum ini dilakukan agar dapat mengetahui dan mengerti

cara mengisolasi, pertumbuhan, serta morfologi bakteri selulolitik dengan cara yang

benar.

1.2Rumusan Masalah

1.Bagaimana isolasi bakteri selulolitik dari bekatul sehingga diperoleh isolat

murni ?

2.Bagaimana menguji isolat bakteri selulolitik dalam hal kemampuannya untuk

menghasilkan enzim selulase?

3.Bagaimana mengidentifikasi dan mengetahui morfologi isolat bakteri selulolitik

dengan pewarnaan gram?


3/22

1.3Tujuan

1.Untuk mengisolasi bakteri selulolitik dari bekatul sehingga diperoleh isolat

murni.

2 Untuk menguji isolat bakteri selulolitik dalam hal kemampuannya untuk

menghasilkan enzim selulase.

3 Untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi isolat bakteri selulolitik

dengan pewarnaan gram.


4/22

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Isolasi Bakteri Dari Bekatul

Bekatul mempunyai kandungan komponen-komponen nutrisi yang

dibutuhkan bakteri proteolitik. Bekatul mengandung protein tinggi, karbohidrat,

lemak, vitamin, asam lemak esensial, serat pangan, oryzanol, dan asam ferulat

(www.gizi.net, 15 Februari 2006). Bekatul mempunyai sumber karbon dan nitrogen

lebih kompleks dibandingkan media lain. Keunggulan lain yaitu harganya lebih

murah, mudah diperoleh dan tersedia secara melimpah, bahkan merupakan limbah

yang dapat mencemari lingkungan.

Isolasi Bakteri adalah proses pemurnian bakteri dari sekelompok bakteri yang

terdapat dalam habitat yang sama. Pemurnian ini bertujuan untuk mendapatkan

bakteri murni yang hanya terdiri dari satu species saja. Bakteri yang sudah

dimurnikan, kemudian akan dibiakkan dalam media buatan untuk mendapatkan kultur

bakteri murni dalam jumlah banyak. Fardiaz (1988) menyebutkan bahwa terdapat tiga

jenis isolasi yang umum dilakukan yaitu isolasi pada media cawan, isolasi pada

medium cair, dan isolasi sel tunggal. Isolasi agar cawan dilakukan dengan

menggunakan goresan kuadran atau metode agar tuang. Keberhasilan metode ini

sangat tinggi karena kebanyakan bakteri, kapang dan khamir dapat membentuk koloni

pada media padat sehingga mudah diisolasi dengan cara menyebarkan sel sel

tersebut pada agar cawan sehingga timbul koloni koloni yang terpisah. Isolasi

medium cair digunakan untuk beberapa bakteri yang ukuran selnya besar, tidak dapat

tumbuh pada agar cawan, hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode yang

digunakan adalah metode pengenceran. Metode ini mempunyai kelemahan karena

hanya dapat digunakan untuk mengisolasi mikroba yang jumlahnya dominan dalam

suatu campuran populasi mikroba. Isolasi sel tunggal digunakan untuk mengisolasi

sel mikroba yangukurannya besar serta tidak dapat diisolasi dengan metode cawan

maupun pengenceran.


5/22

2.2 Bakteri Selulolitik

Selulolitik merupakan aktivitas bakteri dalam perombakan selullosa dengan

bantuan enzim selulase. Enzim selulolitik dibentuk oleh sebagian besar

mikroorganisme. Mikroorganisme banyak ditemukan pada fungi, actinomycetes,

myxobacteria dan bakteri sejati (Enari, 1983 dalam(Widyastuti,2005). Beberapa

mikroorganisme mengeluarkan enzim selulase didalam media kultur. Enzim selulase

benar-benar ekstra selular dalam banyak kasus tingginya aktivitas selulase ditemukan

didalam filtrat pada fase pertumbuhan strasioner dan dapat diduga bahwa enzim

dilepaskan secara otomatis. Secara jelasnya bahwa enzim harus berada diluar sel

tetapi enzim ini masih terikat pada permukaan. Hal ini meimbulkan dugaan bahwa

degradasi selulosa lebih efisien ketika kontak secara langsung antara sel mikroba dansubstrat. Dengan maksud ini konsentrasi enzim dan kondisi ruang yang baik telah

terpenuhi.

Pemanfaatan bakteri selulolitik sebagai penghasil enzim selulase digunakan

untuk menghidrolisis selulosa karena bakteri tersebut menghasilkan enzim selulase

sebagairespon terhadap adanya selulosa pada lingkungannya. Proses ini berlangsung

apabila terjadi kontak langsung antara sel bakteri dan permukaan selulosa (Hartanti,

2010). Enzim selulase dapat dihasilkan oleh bakteri dan fungi. Salah satu bakteri

yang dapat menghasilkan enzim selulase adalah Bacillus sp. (Sadhu et al., 2013).

Selulase dapat diaplikasikan untuk memperhalus bubur kertas pada industri kertas,

menjaga warna kain agar tetap cemerlang pada industi tekstil, meningkatkan kualitas

pada industri pangan, sebagai dekomposer bahanbahan organik, meningkatkan nutrisi

pakan ternak, berperan penting dalam biokonversi selulosa menjadi berbagai

komoditas senyawa kimia dan dapat mengurangi dampak negatif dari polusi limbah

terhadap lingkungan(Hartanti, 2010). Enzim selulase merupakan enzim ekstrakseluler

yang dihasilkan di dalam sel kemudian dikeluarkan ke media tumbuhnya. Selulase

dapat menghidrolisis ikatan -1,4- glikosidikpada selulosa. Enzim Selulase dapat

diklasifikasikan menjadi tiga kelompok, yaituendo-1,4--Dglukanase,eksoo-1,4--D-

glukanase, dan -D-glukosidase. Ketiga komponen enzim tersebut bekerjasama


6/22

dalam menghidrolisis selulosa yang tidak dapat larut menjadi glukosa (Fikrinda,

2000).

2.3 Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram ini bertujuan untuk mlihat bakteri bersifat gram positif atau

negatif dan bentuknya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode

empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram

positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.

Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian

Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk

membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Pada uji

pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metilungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah

muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini

berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Dalam pewarnaan gram

diperlukan empat reagen yaitu :

1. Zat warna utama (violet kristal)

2. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan

warna utama.

3. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang

digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

4. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-

sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

a. Bakteri Gram Negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil

ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan

warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negative

tidak. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 1015 mm, berlapis tiga atau multilayer.


7/22

2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat

didalam

3. lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak

mengandung asam tekoat.

4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal

violet.

6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

9. Peka terhadap streptomisin

10. Toksin yang dibentuk Endotoksin

b. Bakteri Gram Positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu

sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di

bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda.

Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada

perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010) Ciri-ciri bakteri gram positif

yaitu:

1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada

yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat

ringan. Mengandung asam tekoat.

3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

8. Tidak peka terhadap streptomisin

9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin.


8/22

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Data Pengamatan

4.1.1 Isolasi Bakteri Selulolitik dari Bekatul

Perlakuan Hasil

1. Ditimbang 11 gr serbuk

bekatul

2. Dimasukkan ke dalam

erlenmeyer yang berisi 100

ml media Nutrient Broth (pH

8-11) dengan cara : Dibuka tutup kapas

erlenmeyer

Dibakar mulut erlenmeyer

(proses berlangsung

dalam laminar)

Dimasukkan bekatul

sebanyak 11 gram

Dibakar kembali mulut

erlenmeyer

Ditutup kembali dengan

kapas

Di wraping

3. Diinkubasi pada suhu 450C

selama 48 jam

4. Dibuat media (CMC) untuk

penanaman bakteri pada

cawan petri

5. Diambil sampel bekatul yang

telah melalui proses dalam

inkubator

6.

Dilakukan pengenceranbertingkat dari 10

-1sampai

10-5

dengan cara :

Dibuka tutup kapas

tabung reaksi

Dibakar mulut tabung

Diperoleh 11 gr bekatul

Bekatul bercampur dengan Nutrien

Broth

Nutrien broth berwarna bening

Sampel dalam inkubator

CMC siap digunakan sebagai media

penanaman bakteri

Bekatul keluar dari inkubator

Pengenceran dengan konsentrasi

bertingkat dari 10-1

sampai 10-2


9/22

reaksi diatas bunsen

Dibuka tutup kapas

erlenmeyer yang berisi

bekatul

Dipanaskan muluterlenmeyer

Diambil 1 ml sampel

bekatul

Dimasukkan sampel

bekatul dalam tabung

reaksi yang berisi NaCl

Di vortex

Diulangi langkah yang

sama dari dari 10-1

sampai

10

-5

7. Di ambil sampel yang sudah

bercampur dengan NaCl

8. Dimasukkan ke dalam cawan

petri yang berisi media CMC

agar untuk ditanam secara

pour plate

9. Diinkubasi pada suhu 70oC

selama 24 jam

10.Diambil cawan petri yang

berisi sampel dari inkubator

11.

Diamati bakteri yang muncul

pada masing-masing cawan

petri

12.Dilakukan pemurnian dengan

cara :

Disiapkan kawat ose dan

disterilkan dengan

disemprot menggunakan

alkohol

Dibakar kawat ose pada

nyala api bunsen spiritussampai kawat berwarna

merah

Diambil satu ose isolat

mikroba yang terpisah dari

koloni dengan

Sampel bercampur dengan NaCl

Penanaman bakteri dengan media

CMC agar dalam cawan petri

Cawan petri dalam inkubator

Cawan petri keluar dari inkubator

Bakteri yang muncul 10-1

, 10-2

,10-4

,

10-5

. bakteri yang tidak muncul 10-3

Kawat ose steril

Kawat ose panas

Didapat satu isolat mikroba


10/22

menggunakan kawat ose

Di taruh dalam tabung

reaksi yang berisi media

CYPEagar dengan

metode streak kuadran(zig-zag)

Ditutup kembali tabung

reaksi

Disimpan isolat murni

yang didapatkan pada

media miring CYPEagar

untuk perlakuan

selanjutnya

Satu isolat mikroba berada dalam

media CYPEagar

Tabung reaksi tertutup

Di dapat isolat murni

4.1.2 Uji Bakteri Selulolitik secara Kualitatif

Perlakuan Hasil

1. Diambil satu ose isolat

dengan kawat ose yang

telah dibakar pada nyala

api bunsen sampai

berwarna merah

2.

Dimasukkan kedalam 25 mlmedia CMC broth

3. Dishaker selama 24 jam

4. Dimasukkan kertas cakram

dalam biakan isolat bakteri

5. Diletakkan kertas cakram

tersebut diatas media CMC

agar dalam cawan petri

6. Diinkubasi selama 24 jam

pada suhu 37C

7. Ditambahkan congo red 0,3

% dengan pipet tetes

secukupnya (jangan sampai

terkena kertas cakram)

8. Didiamkan selama 15 menit

9. Dibilas dengan NaCl 1 M

sampai terendam

Satu ose isolat terambil

Satu ose isolat dalam CMCbroth

Homogen

Kertas cakram dalam isolat

bakteri

Kertas cakram berada diatas

media CMC

Sampel dalam inkubator

Congo red berwarna merah ,

sampel putih keruh


11/22

10.Dibuang hasil sisa

pencucian NaCl

11.Diukur zona bening dan

diameter koloni dengan

menggunakan jangkasorong

Zona bening tampak

4.1.3 Identifikasi Bakteri Selulolitik dengan Pewarnaan Gram

Perlakuan Hasil

1. Disemprot alkohol

2. Ditetesi aquades

3.

Dimasukkan bakteri ( 3 10-1b)4. Difiksasi sampai kering

5. Ditetesi dengan 1 tetes kristal

violet

6. Ditunggu sampai 60 s

7. Dibilas dengan aquades dan

dikeringkan

8. Ditetesi 1 tetes iodin



dikeringkan11. Ditetesi 1 tetes etil alkohol



dikeringkan

14. Ditetesi 1 tetes safranin


16. Dibilas dengan alkohol dan

dikeringkan

17. Diberi minyak imersi jika tidak bisa

terlihat dalam mikroskop

18.

Diamati pada mikroskop

19. Dilakukan ulang dengan perlakuan

yang sama pada bakteri (3 10-2

a, 3

10-1

4, 1 10-4

, 3 10-1

a)

Bakteri selesai difiksasi

Bakteri berwarna ungu

Bakteri tetap berwarna ungu

Bakteri tetap berwarna ungu

Bakteri tidak berwarna

Bakteri berwarna merah

Bakteri uji gram negatif


12/22

4.2 Pembahasan

4.2.1 Isolasi Bakteri Selulolitik dari Bekatul

Isolasi bakteri selulolitik dari bekatul ini bertujuan untuk mengisolasi

bakteri selulolitik dari bekatul, sehingga diperoleh isolat murni.

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan

menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba

adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari

campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan

menumbuhkannya dalam suatu media padat sel-sel mikroba akan membentuk

suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya.

Adapun langkah-langkah yang dilakukan dalam isolasi bakteri selulolitik

yaitu, pertama menimbang 11 gram serbuk bekatul dengan neraca analitik.

Bekatul digunakan sebagai sampel yang akan diisolasi bakteri selulolitiknya

untuk diambil isolat murninya yang nantinya akan dilakukan beberapa uji untuk

menguji kemampuannya menghasilkan enzim selulase dan mengetahui morfologi

dari isolat bakteri tersebut. Langkah selanjutnya yaitu memasukkan sampel ke

dalam erlenmeyer yang berisi 100ml Nutrient Broth dalam laminar dengan cara

membuka tutup kapas erlenmeyer yang berisi nutrient broth, kemudian

membakar mulut erlenmeyer. Fungsi pembakaran disini adalah untuk

mensterilkan. Selanjutnya memasukkan 11 gram bekatul, membakar kembali

mulut erlenmeyer dan menutupnya dengan kapas lalu diwrapin agar sampel tidak

terkontaminasi dengan lingkungan luar. Nutrient broth merupakan media yang

berfungsi sebagai nutrisi untuk mencukupi kebutuhan hidup dari bakteri. Berikut

gambar dari nutrient broth sebelum dan sesudah bercampur dengan sampel.


13/22


14/22

disediakan. Setelah itu, memvortex agar didapatkan campuran yang homogen.

Setelah di vortex, mengambil 1 ml sampel dalam tabung reaksi dan

memasukkanya ke dalam cawan petri yang berisi media CMC. Inilah yang

disebut dengan penanaman (inokulasi). NaCl 10 -1dimasukkan kedalam NaCl 10-

2, mengulangi langkah-langkah seperti sebelumnya sampai 10

-5. Setelah itu,

diinkubasi pada suhu 70oC selama 24 jam.

Mengambil cawan petri yang berisi sampel dari inkubator dan mengamati

bakteri yang muncul pada masing-masing cawan petri. Berikut data hasil

pengamatan baik bentuk koloni, tepi koloni, dalam koloni dan elevasi.

No Nama Bentuk

Koloni

Tepi

Koloni

Dalam Koloni Elevasi

1. III 10-

Melingkar Seperti

Rambut

Transparan (tidak

tembus cahaya)

Cembung

2. III 10- Tidak

Beraturan

Tidak

Beraturan

Tidak Transparan Cembung

3. III 10- Melingkar Rata Tidak Transparan Cembung

4. I 10-

Melingkar Rata Transparan

Tembus Cahaya

Rata

5. IV 10-

Tidak

Beraturan

Berombak Transparan

Tembus Cahaya

Cembung

Selanjutnya dilakukan pemurnian dengan cara mempersiapkan kawat ose

dan mensterilkannya dengan menyemprot menggunakan alkohol. Kemudian

membakar kawat ose pada nyala api bunsen spiritus sampai kawat berwarna

merah menyala. Lalu, mengambil satu ose isolat mikroba yang terpisah dari

koloni dengan menggunakan kawat, saat pengambilan. Usahakan kawat ose

ditempelkan dulu pada media. Agar pada waktu pengambilan, bakteri tidak mati

akibat tingginya suhu (panas) dan menaruhnya dalam tabung reaksi yang berisi

media CYPE-agar dengan metode streak kuadran (zig-zag) yang mana ujung

kawat ose yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk

zig-zag pada permukaan agar-agar dalam cawan petri sampai meliputi seluruh

permukaan. Metode ini yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan


15/22

menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Berikut gambar

metode metode streak kuadran :

4.2.2 Uji Bakteri Selulolitik Secara Kualitatif

Pengujian zona bening dilakukan dengan menggunakan larutan congo red

0,1% sebagai larutan penguji dan NaCl 1% sebagai larutan pencuci. Sebanyak 2 ml

larutan congo red 0,1% dituangkan ke dalam media yang berisi isolat, kemudian

didiamkan selama 2030 menit. Larutan dibuang dan dibilas dengan larutan NaCl

1%, kemudianbdiamati keberadaan zona bening (Clear zone). Hasil positif

dinyatakan dengan adanya zona bening (clear zone) di sekitar koloni.

Pengamatan bentuk sel dan pewarnaan cat gram merupakan langkah awal

dalam melakukan identifikasi. Bakteri diberi pewarnaan cat gram untuk mengetahui

sifat bakteri tersebut berkenaan dengan kandungan peptidoglikan di dalam dinding sel

bakteri yang dapat berikatan kuat dengan salah satu komponen cat gram yang akan

diberikan yaitu kristal violet sebagai pewarna utama, sedangkan sebagai pewarna

pembanding yaitu safranin. Maka akan diketahui bakteri tersebut termasuk gram

positif jika berwarna ungu, menunjukkan kandungan peptidoglikannya tinggi, dan

sebaliknya jika kandungan peptidoglikannya rendah maka sel bakteri akan berwarnamerah sebagai gram negatif. Selain itu, pengamatan morfologi koloni dan

karakteristik lain. Jika spesies suatu mikroorganisme itu diketahui dengan jelas,

tentunya penyediaan kondisi pertumbuhan yang sesuai dapat dipenuhi, sehingga laju

pertumbuhan akan maksimal dan hasil yang diperoleh pun akan optimal.


16/22

Langkah-langkah yang dilakukan dalam pengujian ini yang pertama yaitu

mengambil satu ose isolat dengan kawat ose yang telah dibakar pada nyala api bunsen

sampai berwarna merah menyala. Kemudian memasukkannya kedalam 25ml media

CMC broth. Media CMC broth ini berwujud cair yang digunakan sebagai media

penanaman bakteri untuk menghasilkan bakteri selulolitik. Untuk menghomogenkan

antara CMC broth dan sampel dilakukan dalam shaker selama 24 jam. Lalu

memasukkan kertas cakram dalam biakan isolat bakteri dan meletakkan kertas

cakram diatas media CMC agar dalam cawan petri. Kertas cakram digunakan untuk

membantu pengukuran indeks bias . Kemudian menginkubasinya selama 24 jam pada

suhu 37oC dan menambahkan congo red 0,3% dengan pipet tetes secukupnya,

usahakan dalam penambahan congo red jangan sampai terkena kertas cakram.

Selanjutnya mendiamkannya selama 15 menit dan membilasnya dengan NaCl 1 M

sampai terendam yang selanjutnya membuang hasil sisa pencucian NaCl. Hasil

pencucian sampel tersebut siap untuk diukur zona bening dan diameter koloni yang

terbentuk dengan menggunakan jangka sorong. Uji aktivitas selulase dilihat dari

indeks selulase yang terbentuk. Indeks selulase merupakan nisbah antara diameter

zona bening dengan diameter koloni. Adanya zona bening menandakan adanya enzim

selulose pada bakteri selulolitik. Indeks selulase memperlihatkan besar kecilnya

enzim selulase. Semakin besar indeks selulolitik yang dihasilkan semakin besar

enzim yang dihasilkan oleh isolat bakteri tersebut. Berikut data hasil pengukuran

indeks selulase :

Nama Indeks selulase

III 10-

A 0,25

III 10- A 0,45

III 10-

A 0,35

III 10-

B Tak terbentuk

III 10-

B 0,15

III 10-

B 0,25

I 10- 0,35

I 10

-

0,45I 10

- 0,1

Dari hasil pengukuran diatas, indeks selulase yang terbentuk paling besar

yaitu pada III 10-2

A dan I 10-2

yang menghasilkan enzim selulase terbesar.


17/22

Berikut gambar koloni bakteri sebelum dan sesudah ditambahkan congo red.

Adanya zona bening yang tampak :

4.2.3 Identifikasi Bakteri Selulolitik

a. Pewarnaan Gram

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk

mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan

pewarnaan pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka

dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnyabersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan

rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan

sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan

sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan. Berbagai macam tipe

morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan

menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan

satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-

pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)

sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya

bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Tujuan pengecatan

sederhana ini adalah untuk melihat bentuk sel.

Zona Bening


18/22

Tahap yang dilakukan dalam identifikasi ini antara lain pertama menyemprot

kaca preparat dengan alkohol agar steril, kemudian menetesinya dengan aquades dan

meletakkan bakteri ( 3 10-1

b) diatas kaca preparat. Penambahan aquades disini

bertujuan agar bakteri yang akan diamati merata pada kaca preparat. Karena apabila

sampel menggumpal, sulit diamati dalam mikroskop. Tahap selanjutnya memfiksasi

untuk melengketkan bakteri pada kaca preparat diatas nyala api sampai kering.

Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek

glass tanpa merusak struktur selnya. Pemanasan tidak boleh terlalu panas karena bisa

merusak sel bakteri. Kemudian menetesi sampel pada kaca preparat dengan 1 tetes

kristal violet ditunggu sampai 60 detik, dibilas dengan air dan ditiriskan. Crystal

violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan

sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet

memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing,dan sebelumnya penting

sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991). Langkah selanjutnya menetesi preparat

dengan setetes iodin sampai 1 menit, membilasnya dengan aquades dan

mengeringkannya. Iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau

memfiksasi cat primer yang diserap bakteri. Sampel bakteri dalam preparat tetap

berwarna ungu. Kemudian menetesi setetes atil alkohol untuk melunturkan warna

sebelumnya sampai 30 detik, sehingga didapatkan hasil bakteri preparat tak berwarna.

membilasnya dengan aquades dan mengeringkannya. Langkah selanjutnya yaitu

menetesinya dengan satu tetes safranin yang merupakan cat sekunder atau kontras

berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target sehingga bakteri berubah

warna menjadi merah selama 60 detik yang kemudian membilasnya dengan alkohol

dan mengeringkannya.

Setelah dilakukan pewarnaan gram diamati pada mikroskop dengan

perbesaran 1000 X agar terlihat dengan jelas bentuk dan warna sel bakteri.

Bakteri gram positif berwarna ungu dan gram negatif berwarna merah. hasil yang

diperoleh pada praktikum pewarnaan gram ini adalah sebagai berikut :


19/22

nama Warna

bakteri

Jenis gram Gambar dalam mikroskop

III 10-b Merah Negatif

III 10

-

a Tak terdeteksi Tak terdeteksi

III 10-

4 Merah Negatif

I 10-

Merah Negatif


20/22

III 10- a Merah Negatif

Dilakukan ulang dengan perlakuan yang sama pada bakteri (III 10-2

a, III

10-1b , III 10

-14, I 10

-4, dan III 10

-1a ).


21/22

BAB V

KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat di simpulkan bahwa isolasi adalah

dengan cara mengisolasi (menuang) sampel untuk mendapatkan isolat campuran

dengan cara menuangkan sampel yang telah diencerkan ke dalam cawan petri, lalu

ditambahkan media, digoyang dan diinkubasi selama 48 jam, sehingga dapat

diamatikoloni bakteri dalam cawan petri.

Uji aktivitas selulase dilihat dari indeks selulase yang terbentuk. Indeks selulase

memperlihatkan besar kecilnya enzim selulase. Dari hasil pengukuran diatas, indeks

selulase yang terbentuk paling besar yaitu pada III 10-2

A dan I 10-2

yang

menghasilkan enzim selulase terbesar. Semakin besar indeks selulolitik yang

dihasilkan semakin besar enzim yang dihasilkan oleh isolat bakteri tersebut.

Pengecatan Gram adalah suatu pewarnaan diferensial yang mengelompokkan bakteri

menjadi gram positif dan gram negatif bergantung kepada kemampuan bakteri yang

bersangkutan untuk menahan pewarna primer (ungu kristal) ketika mengalami

perlakuan dengan bahan pengecat. Hasil pengamatan yang kami lakukan diperoleh

bakteri gram negatif dengan indikator warna merah.

5.2 SARAN

Terimakasih kepada assisten yang telah banyak membantu, semoga ilmunya

bermanfaat.


22/22

DAFTAR PUSTAKA

Fikrinda, 2000. Isolasi dan karakterisasi Bakteri Penghasil Selulase Ekstermofilik

dari Ekosistem Air hitam. Tesis Program Pascasarjana IPB, Bogor.

Hartanti, 2010. Isolasi dan Seleksi Bakteri Selulolitik Termofilik dari Kawah Air

Panas Gunung Pancar, Bogor. Skripsi FMIPA IPB, Bogor.

Sadhu, S., Saha, P., Sen, S.K., Mayilraj, S., & Miti, T. 2013. Production, Purification

and Characterization of Novel Thermotolerant Endoglucanse (CMCase) from

Bacillus Strain Isolated from Cow Dung.Spingerplus Jurnal. India.

laporan mikro isolasi bakteri1

Documents