LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI ISOLASI DNA KROMOSOM DAN DNA PLASMID

Disusun oleh :Kelompok B-3

Raras Puspa WNindi Di PamelaMonica SantosoDini Syarifah132210101096

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER2015

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Tujuan Mahasiswa mengetahui dan mampu mengisolasi plasmid rekombinan pET ads dari bakteri Escherichia coli Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA kromosom bakteri1.2 Teori Dasar1.2.1 Isolasi DNA kromosomDNA terbagi menjadi dua yaitu DNA kromosom dan DNA ekstrakromosomal seperti DNA mitokondria, kloroplas dan plasmid. DNA kromosom memiliki ukuran yang besar (>0,5 Mb) dibandingkan dengan DNA plasmid ( 2 kb). Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi (DNA di mana informasi genetik dalam sel disimpan, sekuens DNA yang terletak pada kromosom disebut DNA kromosomal. Kata kromosom berasal dari kata khroma yang berarti warna dan soma yang berarti badan kromosom terdiri atas dua bagian, yaitu sentromer ; kinekthor yang merupakan pusat kromosom berbentuk bulat dan lengan kromosom yang mengandung kromonema dan gen berjumlah dua pasang).Isolasi DNA kromosm bakteri secara garis besar meliputi tahap-tahap perusakan dan pembuanagn dinding sel, lsiis sel, pembuangan remukan sel, serta pemisahan DNA dari protein dan RNA. Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim, sedangkan untuk lisis sel biasanya digunakan triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (SDS). Pembuangan remukan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi, sedangkan protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse.Isolasi DNA kromosom memiliki prinsip, Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga menyisakan adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air. Secara umum, prosedur preparasi DNA dari biakan sel bakteri dapat dibagi dalam empat tahap:1. Biakan bakteri ditumbuhkan dan kemudian dipanen2. Sel dipecah untuk melepaskan isinya3. Ekstrak sel diperlakukan untuk menghilangkan semua komponen kecuali DNA4. Larutan DNA dimurnikan1.2.2 Isolasi DNA plasmidPlasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah :a. plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasib. DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimiac. mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d. jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi;e. mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu. (Brock, et al., 1994).Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994). Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders and Parkers, 1999). Secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran sel. Ini semua menyebabkan sel menjadi lisis. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida (DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).

BAB IIMETODOLOGI PENELITIAN2. 1 Alat dan Bahan 2.1.1 Isolasi DNA Plasmid2.1.1.1 Alat Inkubator goyang 37oC UV transilluminator Mikropipet Ose bulat Sentrifus Tabung eppendorf 1,5 ml Tip biru (1 ml) Tip kuning (100 l) Tip putih (10 l)

2.1.1.2 Bahan Bakteri Eschericia coli PET 30b Medium Luria Bertani Antibiotik Kanamisin Solution I (150 mM glukosa, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8) Solution II (0,2 N NaOH, 1% SDS [dibuat baru]) Solution III (60 mL 5 M Potasium asetat, 11,5 mL Asam Asetat Glasial, 28,5 mL Aquadest) PCI (Phenol Chloroform Isoamilalkohol) Buffer TE Etanol pa Natrium Asetat2.1.2 Isolasi DNA Kromosom2.1.2.1 Alat Sentrifuga Vortex Inkubator goyang Pemanas air Freezer Tabung reaksi Lampu Bunsen Mikropipet Tip Eppendorf 1,5 ml Cawan petri Sengkelit Erlenmeyer

2.1.2.2 Bahan Bakteri Eschericia coli Medium LB cair PBS (Phospat Buffer Saline)- Aquabidest steril2.2 Cara Kerja2.2.1 Isolasi DNA Plasmid 2.2.1.1 Pembiakan dan Pemanenan Bakteri

Media LB cair yang sudah steril diberi antibiotik Kanamisin (konsentrasi akhir 25 g/ml).

Koloni tunggal bakteri E.Coli pET 30b diambil menggunakan jarum ose dari media LB padat dalam petridish dan dibiakkan dalam 5 ml media LB cair yang sudah diberi Kanamisin. Kemudian diinkubasi selama 18 jam suhu 37oC dalam inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm.

Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri dimasukkan kedalam 3 tabung eppendorf 1,5 ml, lalu disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12000 rpm, supernatan dibuang dengan membalikkan tabung dan diletakkan diatas kertas tisu dengan posisi terbalik.

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 4,5 ml biakan bakteri yang disentrifugasi, untuk mendapatkan pelet sel bakteri.

2.2.1.2 Isolasi plasmidPelet sel diresuspensi dengan 100 l solution I dengan cara memipet naik turun beberapa kali hingga benar-benar tersuspensi lalu divortex.

Ditambahkan solution II (dibuat baru) sebanyak 200 l. Solution II dibuat dengan memipet NaOH 20 l, SDS 100 l dan aquadest 880 l. Dihomogenkan dengan cara tabung eppendorf dibolak-balikkan secara perlahan sebanyak 6-8 kali, kemudian didiamkan selama 5 menit didalam box berisi es hingga lisat jernih. Tidak boleh divortex.

Ditambahkan solution III sebanyak 150 l. Dihomogenkan dengan cara tabung eppendorf dibolak-balikkan secara perlahan sebanyak 6-8 kali, kemudian didiamkan selama 5 menit didalam box berisi es hingga lisat jernih. Tidak boleh divortex.

Campuran disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 12000 rpm suhu 4oC. Diulangi sentrifugasi jika supernatan tidak jernih.

Supernatan dipindahkan kedalam tabung eppendorf baru, dilakukan dengan hati-hati agar tidak ada endapan terikut.

Ditambahkan PCI sama banyak dengan volume supernatan (350 l), kemudian divortex selama 3 menit dan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 12000 rpm.

Lapisan atas diambil (150 l) dan dimasukkan pada tabung eppendorf baru. Lalu ditambahkan etanol pa dan Natrium asetat dengan perbandingan 2,5:0,1 (yaitu 875l:35l) dari volume supernatan.

Didiamkan dalam freezer (-20oC) selama 1 jam untuk mempresipitasi/mengendapakan plasmid.

Setelah 1 jam presipitasi plasmid, eppendorf disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 12000 rpm suhu 4oC.

Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70% lalu disentrifugasi lagi selama 5 menit pada kecepatan 12000 rpm suhu 4oC.

Pelet dikeringkan dengan divakum, kemudian diresuspensi dalam 20 l buffer TE dan disimpan pada suhu 4oC untuk analisis selanjutnnya.

2.2.2 Isolasi DNA Kromosom

Koloni tunggal bakteri E.Coli diambil dari media LB padat dalam petridish dan dibiakkan dalam 5 ml media LB cair dan diinkubasi selama 18 jam suhu 37oC dalam inkubator goyang dengan kecepatan 120 rpm.

Sebanyak 1 ml biakan bakteri dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1,5 ml, lalu disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm, supernatan dibuang dengan membalikkan tabung dan diletakkan diatas kertas tisu dengan posisi terbalik.

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 3 ml biakan bakteri yang disentrifugasi, untuk mendapatkan pelet sel bakteri.

Pelet sel yang diperoleh dicuci dengan 1 ml PBS steril kemudian disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Pencucian pelet sel dilakukan 3 kali.

Pelet sel yang diperoleh disimpan pada suhu -20oC selama 24 jam untuk ekstraksi DNA genom.

DNA kromosom diekstraksi dengan mendidihkan pelet beku selama 4 menit, kemudian dilarutkan dengan 50 l aquabidest steril dan diresuspensi dengan cara mikropipet dan vortex.

Suspensi tersebut disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 13000 rpm suhu 4oC. Supernatan yang diperoleh dipindahkan dalam tabung eppendorf yang baru.

Supernatan tersebut mengandung DNA kromosom dan disimpan -20oC hingga digunakan untuk analisis selanjutnya.

BAB IVPEMBAHASAN

4.1 Cara Kerja Deskritive Isolasi DNA Plasmid dan Kromosom BakteriPertama , Media LB cair yang telah steril diberi antibiotik kanamisin . selanjutnya mengambil biakan bakteri E.coli didalam petri disk dengan menggunakan jarum ose . kemudian , media LB cair yang sudah diberi biakan bakteri diletakkan pada shaker inkubator dengan kecepatan 120 rpm selama 18 jam .Kedua , Biakan bakteri yang diletakan dalam shaker inkubator selanjutnya dikeluarkan dan diambil 1,5 ml biakan bakteri dari Media LB cair , kemudian dimasukkan kedalam tabung effendorf 1,5 ml lalu disentrifugasi selama 2 menit denga kecepatan 12000 rpm , dan akan didapatkan pelet . pada praktikum kali ini didapatkan 3 pelet dari 3 effendorf , kemudian ketiga pelet ini digabungkan dalam satu effendorf dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12000 rpm . setelah itu supernatan dibuang dengan cara membalikkan tabung dan diletakkan diatas kertas tisu dengan posisi terbalik .Kemudian pelet ditambahkan dengan solution I sebanyak 100 l dan diresuspensi dengan cara memipet naik turun campuran pelet dengan solution I dengan menggunakan mikropipet selanjutnya di vortex. Solution I ini berfungsi untuk meresuspensikan pelet sel bakteri setelah pemanena menggunakan sentrifus EDTA . selanjutnya ditambah solution II yang berfungsi untuk melisiskan sel dengan melarutkan membran sel dan mendenaturasi DNA kromosom namun tidak mendenaturasi DNA plasmid . sebelumnya solution II yang digunakan harus fresh . cara membuat solution II yaitu memipet NaOH 20 l ditambah dengan SDS 100 l dan aquadest sebanyak 880l . Tabung effendorf yang telah diberi solution II tadi dibolak balik agar campuran nya homogen , kemudian dimasukkan kedalam ice box selama 5 menit maka akan terbentuk suatu lendir yang mengindikasikan bahwa dinding sel dari bakteri E.coli telah lisis .Selanjutnya ditambahkan Solution III sebanyak 150 l , seperti sebelumnya yaitu dihomogenkan dengan cara membolak-balikan tabun effendorf secara pelahan dan dimasukkan kembali kedalam ice box selama 5 menit . setelah itu campuran disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm dengan suhu 4oC . Solution III berfungsi untuk menetralisir PH , menghentikan denaturasi DNA kromosom sehingga terbentuk presitipasi DNA kromosom yang menembus debris seluler dan memisahkan DNA plasmid yang larut didalam supernatan . Setelah 5 menit , tabung effendorf diambil dan supernatan yang dihasilkan diambil ( NB: jangan ada endapan yang terbawa ) . Volume supernatan yang kelompok kami dapat yaitu 350 l dan selanjutnya supernatan tersebut ditambahkan dengan menggunakan PCl 350 l , kemudian di sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm . pada tabung effendorf yang terbentuk akan terbentuk 2 lapisan , lapisan bagian atas diambil dengan volume 350 l dimasukkan dalam tabung effendorfbaru dan ditambah dengan etanol 875 l dan ditambahkan dengan Na-asetat 35l . setelah itu dimasukkan kedalam freezer suhu -20oC selama 1 jam ,tujuannya yaitu untuk memperipitasi plasmid , Setelah 1 jam , disentrifus kembali selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm . selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan dimbil peletnya saja . Selanjutnya pelet dicuci dengan etanol 70% 1 ml . selanjutnya pelet disentifugrasi selam 5 menit dengan kecepatan 12000 rpmpada suhu 4oC . kemudian etanol dibuang , ditutup menggunakan parafilm yang dilubangi dan di vakum Selama 10 menit .selanjutnya parafin ditambahkan dengan buffer TE sebanyak 20l lalu disimpan didalam kulkas dengan suhu 4oC .Sedangkan cara kerja isolasi DNA kromosom adalah Cara kerja deskritive isolasi DNA Kromosom seperti berikut, langkah pertama yang dilakukan yaitu penanaman bakteri dengan cara mengambil media LB cair dan ditambahkan antibiotik kanamisin 0,6 g dari konsentrasi 25 g/ml .kemudiaan dihomogenkan. selanjutnya E.coli ditanam sebanyak 2.05 secara aseptis didalam laminar air flow lalu dihomogenkan kembali dan diletakkan dalam shaker inkubator dengan posisi miring selama 18 jam pada suhu 37oC dengan kecepatan 120 rpm . dilakukan pemiringan pada shaker inkubator ini bertujuan untuk memperluas daerah aeresi sehingga kadar oksigen pada media LB tinggi dan mikroba yang ditanam dapat tumbuh secara optimal .Selanjutnya dilakukan pengambilan 1 ml biakan bakteri dimasukkan kedalam tabung mikrotube 1,5 ml . kemudian disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4oC . kemudian hasil sentrifugasi supernatan dibuang , kemudian pelet diambil , dilakukan sebanyak 3 kali . selanjutnya pelet dari ketiga replikasi tersebut dijadikan satu pada satu tabung mikrotube . kemudian dicuci menggunakan Pbs 1 ml yang selanjutnya disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4oC . proses pencucian ini dilakukan 3 kali , maka akan diperoleh pelet dan selanjutnya disimpan dalam freezer dengan suhu -20oC . tetapi sebelum disimpan di dalam freezer tabung mikrotube tersebut dilapisi dengan plastik wrap dan dpat disimpan dalam freezer .pelet yang didapat ini akan digunakan dalam praktikum selanjutnya .

4.2 Isolasi DNA Plasmid

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri. Selain DNA kromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid bisa saja tidak terdapat pada bakteri yang biasa saja karena plasmid tidak mempengaruhi ketahanan hidup bakteri tersebut. Plasmid hanya memberikan sifat istimewa yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap antibiotik. Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat ditransfer ke bakteri lain dan memiliki ORI (Origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ORI hingga semua plasmid tereplikasi.Plasmid merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kurang lebih 2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang penting untuk pertumbuhan bakteri. Di alam, gen informasi ini sering mengkode protein yang akan membuat bakteri resisten terhadap antibiotik. Plasmid mungkin merupakan hasil dari perkembangan heterotrop yang tertutup. Bakteri sering tumbuh pada lingkungan yang sama dengan mold dan fungi dan berkompetisi dengan mereka untuk mendapatkan makanan (bahan organik kompleks). Sebagai hasilnya, mold dan fungi menghasilkan toksin untuk membunuh bakteri (dalam dunia kedokteran sering deisebut dengan antibiotik) agar supaya menang dalam memperebutkan makanannya. Untuk menanggapi ini bakteri menghasilkan plasmid untuk mempertahankan hidupnya. Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang terjadi secara alamiah pada bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara simbiotik maupun parasitik pada sel inang.Pada praktikum kali ini kami melakukan isolasi dna plasmid bakteri. Plasmid merupakan materi gen yang memiliki kemampuan untuk melakukan replikasi secara otonom. Ukuran plasmid antara 1 kb-200 kb. Berbeda dengan DNA genom, DNA plasmid biasanya berbentuk sirkuler dan terdapat bebas di dalam sitoplasma bakteri.Selain itu, DNA plasmid jika diberi penambahan kalium asetat maupun asetat maka untai ganda DNA akan terlarut, dan pada kondisi Ph=12-12,5, DNA plasmid akan mengalami denaturasi namun tidak mengalami fragmentasi. Pada satu sel bakteri dapat ditemukan lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi. Pada teknologi DNA rekominan, plasmid digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan DNA yang siklon sehingga perlu diperoleh plamid yang tidak terkontaminasi dengan kromosom. Kami menggunakan isolasi DNA plasmid menggunakan metode kimiawi yakni penambahan bahan-bahan mekanik seperti EDTA, buffer TE, etanol, PCL(Phenol/chloroform/isoamilalkohol, potasium asetat. Setelah kami melakukan tahapan kerja seperti pembiakan bakteri dan penanaman bakteri kemudian kami melakukan isolasi DNA plasmid dengan metode kimiawi. Isolasi DNA plasmid ini menghasilkan pelet yang dikeringkan dan diresuspsnsi dalam 20 mikroliter bufer TE, kemudian pelet tersebut disimpan pada suhu 4C yang disimpan hingga digunakan untuk praktikum selanjutnya. Penyimpanan pelet dalam buffer TE ini berguna untuk mencegah kontaminasi dari lingkungan sekitar agar DNA plasmid yang akan telah diisolasi tetap dalam kondisi steril untuk digunakan kembali pada praktikum berikutnya.4.3 Isolasi DNA Kromosom BakteriBerdasarkan hasil praktikum isolasi DNA kromosomal bakteriEscherichia coliisolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein , lemak, dan karbohidrat. Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi DNA kromosom dari bakteri Eschericia coli. Isolasi DNA kromosom diawali dengan memperbanyak bakteri dengan cara menumbuhkan bakteri, pemanenan dan kemudian dilakukan pemecahan dinding sel, selanjutnya dilakukan pemisahan DNA kromosom dari komponen lain. Untuk memecah dinding sel bakteri, dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu pemecahan secara fisik ( Freeze Thaw, bead mill homogenization) dan secara kimia dengan menggunakan reagen-reagen kimia seperti lisozim, EDTA, Tris HCL, atau dengan detergen Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Pemecahan dinding sel dengan metode diatas dapat merusak integritas barier dinding sel sehingga DNA kromosom dapat keluar, kemudian pemisahan DNA dilakukan dengan sentrifugasi. Pada praktikum kali ini dipilih metode Freeze Thaw yaitu pemisahan secara fisik. Metode ini dilakukan dengan cara Heat Stock yaitu dengan membekukan bakteri kemudian dipanaskan secara tiba-tiba, sehingga diharapkan sel bakteri akan pecah kemudian DNA kromosom akan keluar. Prinsip-prinsip pada isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan persipitasi. Bakteri pada percobaan ini disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit setelah dibekukan pada suhu -20 selama 24 jam, diaman didapat endapan putih ( pellet) yang terdapat pada bagian bawah tabung sentrifuga.Hal tersebut dikarenakanprinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Prinsip presipitasi adalah pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang terdapat dalam sel.Sentrifugasi merupakan salah satu metode dasar yang Sangat penting dalam studi biologi sel maupun molekular. Sentrifugasi tidak hanya berguna untuk memisahkan sel atau organel subselular, melainkan juga digunakan untuk pemisahan molekular. Teknik sentrifugasi pada pengisolasian DNA berfungsi untuk memisahkan DNA dari zat lain dalam sel berdasarkan berat molekulnya.Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan mengunakan alat yang berupa rotor yang digerakan oleh motor elektrik yang merupakan tempat berpegangnya tabung yang akan disentrifugasi. Pergerakan mesin sentrifugasi berhubungan dengan massa, kerapatan dan susunan dari molekul yang disentrifugasi, serta massa , kerapatan dan viskositas dari lingkungan larutan. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Dimana supernatan mengandung DNA kromosom sedangkan pelet mengandung organel-organel dari bakteri serta dinding sel yang telah pecah.4.4 Titik KritisTitik kritis pada praktikum Isolasi DNA dan Kromosom Bakteri adalah sebagai berikut:a. Resuspensi dengan mikropipetProses resuspensi pada isolasi DNA bertujuan untuk menghomogenkan pellet bakteri dengan Solution I, II, dan III. Pada saat proses resuspensi harus dipastikan tidak ada gelembung udara didalam cairan, karena gelembung udara berisi bakteri dan dapat menyebabkan kontaminasi.b. Pengambilan SupernatanSupernatan yang dihasilkan dari proses sentrifugasi setelah penambahan Solution I, II, dan III berisi DNA plasmid, oleh karena itu pengambilan supernatan dari tabung eppendorf harus hati-hati agar tidak ada endapan yang ikut terambil.

BAB VPENUTUP5.1 Kesimpulan5.1.1 Bakteri memiliki DNA kromosomaldan DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal.5.1.2 Pada praktikum ini, isolasi DNA plasmid dilakukan dengan metode kimiawi menggunakan PCl, solution I, solution II dan solution III.5.1.3 Untuk memecah dinding sel bakteri pada isolasi DNA kromosom, dilakukan pemecahan secara fisik ( Freeze Thaw, bead mill homogenization) dan secara kimia menggunakan reagen-reagen kimia seperti lisozim, EDTA, Tris HCL, atau dengan detergen Sodium Dodecyl Sulfat (SDS).5.1.4 Pada praktikum isolasi DNA kromosom kali ini dipilih metode Freeze Thaw yaitu pemisahan secara fisik. 5.1.5 Titik kritis dalam praktikum ini terletak pada resuspensi dengan pipet dan pengambilan supernatan.

DAFTAR PUSTAKA

Kimball.J. 2005.Biologi. ed. ke -5. jilid 1. terj dariBiology.5th ed, olehProf. DR. Ir. H. Siti Soetarmi T. Erlangga.Jakarta: xiii + 333 hlm.Triwibowo, Y. 2005.Biologi Molekular. Erlangga,Jakarta: xiii + 269 hlmYuwono, Triwibowo.2006.Bioteknolgi Pertanian.Gadjag Mada University Press. Yogyakarta