LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“ISOLASI DNA”

Disusun Oleh :

Disusun Oleh :

Nama : Frelyta A. Z.

NIM : 115040213111290

Kelompok : Selasa, (06.00 WIB)

Asisten : Dita Pahlevi

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

DNA merupakan suatu materi genetik yang terbentuk dari dua

kelompok basa yang berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin

dan pirimdin. Dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA

adalah adenin dan guanin, dan pirimidin yang umum adalah sitosin

dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa ikatan ganda yang

berhubungan. Molekul molekul yang berisi ikatan demikian itu

mempunyai potensi untuk hadir dalam sejumlah struktur kimia yang

berbeda, karena atom hidrogennya mempunyai kebebasan tertentu.

Misalnya saja satu atom hidrogen dapat berpindah dari suatu

gugusan asam amino ( -NH2 ), dengan meninggalkan gugusan asam

amino ( -NH ) dan muatan negatif netto yang diserap oleh sistem

cincin molekul yang berkonjugasi. Fluktuasi kimia semacam itu

disebut pergeseran tautomer, dan struktur struktur molekul berbeda

yang dihasilkannya disebut tautomer

DNA adalah polimer bukleotida biasa bila dua nukleotida

digabungkan,molekul resultannya disebut dinukleotida bila tiga

menjadi trinukleotida bila beberapa membentuk polinukleotida.

Hanya satu gugusan fosfat dari setiap trifosfat pelopor termasuk

dalam polimer. Gugusan fosfat ini, yang terikat pada 5’- karbon gula

pentosa pada satu nukleotida, juga terikata secara kimiawi pada 3’-

karbon gula nukleotida kedua, sehingga suatu deret 5’-3’ pautan

fosfat mengikat nukleotida nukleotida itu menjadi satu sejauh

panjangnya polimer. Ikatan ikatan fosfat itu sangat kuat dan dikenal

sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester.

1.2 Tujuan

Untuk Mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR

Untuk Mengetahui Uji Kualitas DNA

Untuk Mengetahui Komponen serta Tahapan-tahapan

Isolasi DNA

Untuk Mengetahui Manfaat dari Isolasi DNA dan PCR

Untuk Memahami Tata Cara Pembuatan Isolasi DNA

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Isolasi DNA dan PCR

Isolasi DNA merupakan proses untuk mendapatkan DNA

murni dari makhluk hidup untukkeperluan bioteknologi. Secara

spesifik untuk mengisolasi DNA yang mencangkup gen tertentu

dapat dilakukan dengan beberapa teknik, yaitu:

Isolasi DNA genom dan dilanjutkan pemotongan DNA genom

menggunakan enzim endonuklease retriksi.

Mengisolasi mRNA yang merupakan hasil transkripsi gen

yang dimaksud kemudian dilanjut dengan membuat turunan

(Complementery DNA/cDNA),

Menyintesis nukleotida yang menyusun gen tersebut

(membuat gen sintetik) dengan teknik sintesis kimiawi.

Melakukan implifikasi DNA dengan teknik (Polimerase Chain

Reaction). (Yuwono, 2008)

Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan

DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan

atau diagnose (Chawla,2000)

Isolasi Dna merupakan suatu proses untuk mendapatkan

DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan

atau diagnosa. DNa dapat di isolasi dari bergabai sal yang

memiliki inti sel, karena DNA terletak di dalam inti sel. beberapa

sumber DNA yang dapat dipergunakan dalam isolasi DNA adalah

urine, darah, biopsi,rambut, gigi kuku dan lainya.

(Adityawarman, 2010)

Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai

polimerase adalah metode enzimatis untuk melipatgandakan

(amplification) secara eksponensial suatu sekuen nukleotida

tertentu secara in vitro (Anonymous,a,2012)

PCR (Polymeracse Chain Reaction) merupakan teknik untuk

meniru urutan nukleotida suatu gen dengan cara melakukan

amplifikasi DNA. Amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro (di

dalam tabung) dengan menggunakan:

Enzim DNA polymerase

dNTP (dinukleotida triphospat)

oligonukeotida primer

molekul DNA cetakan (DNA template) (Yuwono, 2008)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk

amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara

enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak

sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA

template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak

relevan (misalnya dari total DNA genomik). (Mahmuddin, 2010)

2.2 Uji Kualitas DNA

Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara

lain :

1. Spektrofotometri Vis (Visible)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber

sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible

termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh

mata manusia. Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380

sampai 750 nm. Sehingga semua cahaya yang dapat dilihat oleh

kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun selama

ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke

dalam cahaya tampak (visible).

Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro

visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga

dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W

dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi

(3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia

digunakan sebagai sumber lampu. (Fatimah)

2. Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet Visible)

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara

spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang

gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi

oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini

terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna.

Bening dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat

berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample

dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu

diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau

centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel

harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi

suspensi. (Fatimah)

3. Elektroforesis

Metode elektroforesis merupakan teknik yang dapat

digunakan untuk menggambarkan pergerakan molekul-molekul

bermuatan dalam medan listrik ke arah elektroda dengan muatan

berlawanan atau teknik yang didasarkan pada pergerakan molekul

bermuatan dalam media penyangga di bawah pengaruh medan

listrik. Media yang umum digunakan dalam elektroforesis

adalah gel agarosa, suatu polisakarida yang diekstraksi dari

berbagai jenis ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu

melakukan separasi DNA dengan kisaran ukuran yang luas.

Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen

DNA yang berukuran lebih besar dari 100 basepairs dan

dijalankan secara horizontal, sedangkan

elektroforesispoliakrilamid dapat memisahkan 1 basepairs dan

dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya

digunakan untuk menentukan urutan 2 DNA (sekuensing).

(Windiyastika)

Kuantifikasi dan analisa kualitas DNA/RNA diperlukan

untuk mengetahui kemurnian dan jumlah konsentrasi

DNA/RNA yang diisolasi. Kualitas DNA/RNA terbaik

menunjukkan keadaan DNA/RNA bebas dari kontaminasi

seperti kontaminasi protein dan garam yang terdapat pada

DNA/RNA yang diisolasi. Kuantitas DNA/RNA menunjukkan

konsentrasi DNA/RNA. Uji kualitas DNA dapat dilakukan

dengan cara :

1. Elektroforesis

Elektoforesis adalah teknik pemisahan komponen

atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat

migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik

dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel

yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan

dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada

makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif.

Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui

suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu

kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka

molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke

kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut

tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta

tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini

dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait

dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan

kondisi elektris lingkungan

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk

memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan

fragmen DNA. Ada dua jenis elektroforesis yaitu :

a. Elektroforesis kertas

Elektoforesis kertas adalah jenis

elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai

fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut

sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion

kompleks. [4] Pemisahan ini terjadi akibat adanya

gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. [4] Pergerakan partikel dalam kertas tergantung

pada muatan atau valensi zat terlarut, luas

penampang, tegangan yang digunakan,

konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH,

viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

b. Elektroforesis gel

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang

menggunakan gel sebagai fase diam untuk

memisahkan molekul-molekul. Awalnya

elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel

kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan

biomolekul yang lebih besar seperti protein-

protein. Kemudian elektroforesis gel

berkembang dengan menjadikan agarosa dan

poliakrilamida sebagai gel media

(Anonymous,b,2012)

2. Spektrofotometer

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan

untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan

cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu

obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet. Sebagian

dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan

dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang

dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di

dalam kuvet(Harahap,2007)

2.3 Komponen dan Tahapan PCR

a. Komponen PCR

Penggunaan urutan basa nukleotida berlangsung

melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang

secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap

reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen

sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan

sebagai cetakan (template), molekul oligonukleotida untai

tunggal ujung 3’-OH bebas yang berfungsi sebagai

precursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat

macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzim

polimerase, serta larutan penyangga berupa buffer.

1. DNA template adalah DNA untai ganda yang

membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan

digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target

(target sequence). Penggandaan urutan target pada

dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi

molekul primer. Jumlah yang digunakan dalam proses

PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas hasil

PCR, tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah

cukup. Apabila target yang digunakan berupa total

DNA genome, ada baiknya kalau DNA tersebut

dipotong terlebih dahulu dengan enzim tertentu

sehingga potongan DNA yang dihasilkan masih

berukuran cukup besar, misalnya enzim SalI atau NotI

yang mempunyai sedikit situs pemotongan di dalam

total DNA genome.

2. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal

yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer

dapat berlangsung karena adanya penambahan basa

demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim

DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA

polimerase yang digunakan harus termostabil karena

salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai

ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (±

95°C). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum

digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal

dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Ada

beberapa catatan terkait dengan jumlah basa yang

digunakan dalam urutan primer apabila PCR

digunakan dalam analisis RAPD (Randomly

Amplified Polymorphic DNA), ukuran primer tidak

boleh lebih panjang dari 10 basa nukleotida. Dalam

hal ini, kita memang tidak membutuhkan penempelan

primer ke DNA target secara spesifik tetapi secara

acak (random). Biasanya, konsentrasi primer yang

dibutuhkan dalam proses PCR sekitar 1µM yang

sudah cukup digunakan untuk sedikitnya 30 siklus.

Primer yang diberikan dalam konsentrasi tinggi dapat

menyebabkan penempelan pada sekuen DNA yang

salah sehingga hasil PCR yang didapatkan tidak

seperti yang diharapkan. Sebaliknya apabila primer

berkonsentrasi rendah, proses PCR tidak dapat

berjalan secara efisien, karena hasil amplifikasi yang

diperoleh akan sangat sedikit. Penentuan konsentrasi

primer secara tepat kadang-kadang harus melalui uji

coba dengan menggunakan primer pada konsentrasi

sangat rendah sampai konsentrasi sangat tinggi.

3. Enzim Taq Polymerase yang beredar saat ini terdiri

atas dua macam, yaitu enzim alami (native) yang

diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim

rekombinan yang disintesis di dalam sel bakteri E.

coli. Pada dasarnya tidak ada perbedaan di antara

keduanya sehingga kita dapat menggunakan keduanya.

Konsentrasi enzim yang dibutuhkan tidak lebih dari 1

unit. Penggunaan 0,3 unit enzim masih memberikan

hasil PCR yang berkualitas baik. Namun demikian,

konsentrasi enzim yang berlebihan dapat

menyebabkan amplifikasi DNA pada sekuen yang

bukan target.

4. Deoxyribonucleoside Triphosphate (dNTPs)

merupakan material utama yang dibutuhkan untuk

sintesis DNA baru dalam proses PCR. Konsentrasi

yang dibutuhkan sebanyak 200µM untuk tiap dNTP

yang terdiri atas dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Material

ini tersedia dalam bentuk campuran keempat dNTP

tersebut atau dalam bentuk terpisah satu sama lain.

5. Larutan penyangga (buffer) yang biasa digunakan

untuk reaksi PCR mengandung 10 mM Tris-HCl pH

8,3 50 mM KCl dan 1,5mM MgCl2. Keberadaan ion

Mg sangat penting dan perlu disesuaikan

konsentrasinya apabila ada perubahan konsentrasi

pada DNA target atau primer atau dNTP.

b. Tahapan PCR

Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu

denaturasi template, penempelan primer (annealing) dan

polimerisasi primer yang masing-masing berlangsung pada

suhu lebih kurang 95°C, 50°C dan 70°C. Pada tahap

denaturasi, pasangan untai DNA template terpisah satu

sama lain karena terputusnya ikatan hidrogen antar basa-

basanya sehingga menjadi untai tunggal.

Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan

ditempeli primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-

masing menempel pada untai tunggal DNA template.

Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju

(forward primer) dan primer mundur (reverse primer).

Sepasang primer tersebut akan berhibridisasi menjadi

sekuen komplementer pada untai tunggal DNA. Pasangan

primer tersebut dipilih sedemikian rupa agar satu primer

bersifat komplementer terhadap salah satu ujung gen yang

diinginkan pada salah satu rantai. Sementara itu, primer

kedua bersifat komplementer dengan ujung yang lainnya

pada untai DNA yang satu lagi.

Primer akan membentuk ikatan hidrogen dengan

sekuen komplementernya sehingga terbentuklah molekul

untai ganda yang stabil.

Setelah menempel pada untai DNA template, primer

mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya

hingga ujung 5’ DNA template (ingat: polimerisasi DNA

selalu berjalan dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau berarti dari

ujung 3’ ke ujung 5’ untai template nya). Dengan demikian,

pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua

pasang untai DNA jika DNA template awalnya berupa

sepasang untai DNA.

Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada

suatu akhir putaran reaksi akan menjadi template pada

putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada

putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA

pendek sebanyak 2n-2n. Fragmen DNA pendek yang

dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan

jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen

pendek inilah yang merupakan ukuran target yang memang

dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).(Heldt,2005)

Berikut susunan struktur kimia komponen penyusun DNA:

Baik purin ataupun pirimidin yang berkaitan dengan deoksiribosa

membentuk suatu molekul yang dinamakan nukleosida atau

deoksiribonukleosida yang merupakan prekursor elementer untuk

sintesis DNA.Prekursor merupakan suatu unsur awal

pembentukan senyawa deoksiribonukleosida yang berkaitan

dengan gugus fosfat.DNA tersusun dari empat jenis monomer

nukleotida.

Keempat basa nitrogen nukleotida di dalam DNA tidak

berjumlah sama rata.Akan tetapi, pada setiap molekul DNA,

jumlah adenin (A) selalu sama dengan jumlah timin (T).Demikian

pula jumlah guanin (G) dengan sitisin(C) selalu sama.Fenomena

ini dinamakan ketentuan Chargaff.Adenin (A) selalu berpasangan

dengan timin (T) dan membentuk dua ikatan hidrogen (A=T),

sedagkan sitosin (C) selalu berpasangan dengan guanin (G) dan

membentuk 3 ikatan hirogen (C = G).

Stabilitas DNA heliks ganda ditentukan oleh susunan basa

dan ikatan hidrogen yang terbentuk sepanjang rantai

tersebut.karean perubahan jumlah hidrogen ini, tidak

mengherankan bahwa ikatan C=G memerlikan tenaga yang lebih

besar untuk memisahkan. DNA merupakan makromolekul yang

struktur primernya adalah polinukleotida rantai rangkap

berpilin.Sturktur ini diibaratkan sebagai sebuah tangga.Anak

tangganya adalah susunan basa nitrogen, dengan ikatan A-T dan

G-C.Kedua “tulang punggung tangganya” adalah gula

ribosa.Antara mononukleotida satu dengan yang lainnya

berhubungan secara kimia melalui ikatan fosfodiester.

(Anonimous, 2012)

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia

yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan

senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari

satu generasi ke generasi selanjutnya (Suryo 2004: 57).

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom.

Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional

dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen

danintergen(Campbell dkk.2004:221).

DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan

bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular,

sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier.

DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot

terletak dalam sitoplasma (Jusuf 2001:7).

Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan

Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto

difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice

Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA

merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari

dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki

susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke

3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’

merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’

berakhir dengan gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan

hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen (Sadava

dkk.2004:218--220).

Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa

nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu

gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada

DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi

menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari

dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava dkk.2004:219).

2.4 Manfaat PCR

Manfaat dari PCR yaitu, keragaman genetik tanaman

(kekerabatan), seleksi :

1. Isolasi Gen

Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari

atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa

nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini

bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang

sesuai dengan gen tersebut.

2. DNA Sequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan

teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat

ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang

sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator,

dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi

yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer

(PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan

dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna

fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa

suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

3. Forensik

Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi

dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA

dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan

analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA

yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang

unik bagi setiap orang.

4. Diagnosa Penyakit

PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi

saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan

hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah

tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A

(H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk

lainnya(Clark,2008)

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik

perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada

daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer

oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah

yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya

komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip

dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi

konservatif.

PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua

primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu

memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR

dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan

(templat) yang mengandung DNA-target (yang akan

diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim

DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan

sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua

primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA

komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA

target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus

hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer menempel

pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses

pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida

yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA

polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara

OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang

ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang

dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan

arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA

polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen

dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.

(Mahmuddin,2010)

1. Untuk mengetahui keragaman genetik; Hal ini penting diketahui

untuk proses persilangan, sehingga di dapat varietas unggul, jika

keragaman tinggi maka kekerabatannya akan semakin tinggi, begitu

pula sebaliknya.

2. Seleksi; Untuk memilih tanaman yang sifatnya sesuai dengan yang

diinginkan. Mas (Marker Assisted Selection) : penanda pembantu

seleksi. Keuntungan seleksi dengan PCR yaitu mampu menyeleksi

dalam waktu cepat, tidak perlu menunggu hingga tanaman dewasa.

3. Uji kemurnian benih; Uji perlindungan varietas tanaman agar hak

paten benih tidak dibajak oleh orang lain (Puspita, 2010).

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan + Fungsi

a. Alat

Mikropipet :Untuk mengambil larutan bufer

Oven :Untuk proses inkubasi

Sentrifuge :Untuk memisahkan partikel ringan

dan partikel padat berdasarkan berat molekul.

Vortex :Untuk menghomogenkan larutan

Pistil dan Mortar :digunakan untuk menghaluskan

bahan

Tabung eppendorf :untuk meletakan larutan bahan

sebagai analisa DNA

Lemari Es :Untuk meletakan alkohol

Timbangan Analitik :Menimbang bahan

Camera :Dokumentasi praktikum

Alat Tulis :Mencatat hasil praktikum

Spatula :Memasukkan bahan ke tabung

eppendorf

Tissue :Membersihkan alat

b. Bahan

Nitrogen cair : Melisiskan dinding sel

Alkohol : Sterilisasi alat

Isopropanol : Membantu presipitasi DNA

PVP : menghilangkan fenol

Buffer CATB : menjaga agar DNA tidak rusak

B-mercaptoetanol : menjaga agar DNA tidak rusak

Chisam : Menghilangkan kontam protein

Buffer TE : Untuk melarutkan DNA

Wash buffer : Mencuci DNA

Kubis : sebagai bahan untuk diamati DNA

Rnase : Menjaga DNA agar tidak rusak

3.2 Langkah Kerja + Dokumentasi

3.2.1 Langkah Kerja (Diagram Alir)

Tambahkan 500 mikrolit chisam

Sentrifuge 10.000 rpm selama 10 menit

Ambil supernatan

(bagian atas pada bagian tabung eppendorf)

Tambahkan 500 mikrolit chisam

Sentrifuge 10.000 rpm kembali selama 10 menit

Isopropanol 0,45 x volume

supernatan lalu inkubasi frezzer selama 30 menit

Sentrifuge 10.000 rpm selama 10 menit

Berikan wash buffer 200 mikrolit sebanyak 2 kali lalu

dikeringanginkan

Berikan buffer TE sebanyak 10-50 mikrolit (resuspensi DNA)

Tambahkan Rnase 1 mikrolit inkunasi pada suhu 370 C

Simpan

3.2.2 Dokumentasi

3.3 Analisa Perlakuan

Dalam praktikum bioteknologi dengan materi Isolasi DNA

ada beberapa langkah yang dilakukan . Langkah pertama yaitu

timbang sampel 0,3 g kemudian tambahkan PEP(Polifinil

pirolida) dimana senyawa ini merupakan agen pengikat

polifenol. Kemudian tambahkan N2 cair yang berguna untuk

proses lisis dinding sel . Haluskan jika sudah halus masukkan

dalam tabung ependof. Tambahkan buffer CATB ( Cettil

Trimettil Amonium Bromida) 1000 µl untuk menjaga DNA agar

tidak rusak.

Kemudian tambahkan ß-mercophoethanol untuk

mengaktifkan kerja dari CTAB selain itu juga dapat

menghilangkan kontam dari polisakarida . Lakukan vorteks yang

berfungsi untuk menghomogenkan. Kemudian lakukan inkubasi

dengan menggunakan waterbatt. Lalu tambahkan 500 ml chisam

yang terbuat dari kloroform dan isoamil alcohol dengan

pebandingan 4:1 . Kemudian sentrifuge 1000 rpm sehingga akan

didapatkan supenatan(fase yang paling atas), DNA dan fase

organik(pecahan organel sel). dan ambil supernatan.

Tambahkan 500 ml chisam kemudian sentrifuge 1000 rpm

Kemudian tambahkan iso propanol dingin 0,45 vol kemudian

dilakukan intesifitasi dan lakukan inkubasi pada freezer 30˚.

Sentrifuge 1000 rpm 1o menit dan akan didapatkan

DNA,Debrish, dan Chisam.

Wash buffer 200 ml selama 2 kali dan dikeringanginkan dan

tambahkan buffer TE 10,50 ml untuk resuspensi DNA atau

melarutkan DNA , Tambahkan R.Nase 1 ml dan lakukan

inkubasi dengan suhu 37˚C selama 30 menit dan simpan. Namun

untuk perlakuan ini kami tidak melakukan karena waktunya yang

relatif panjang.

BAB IV

PENUTUP

4.1 Kesimpulan

Isolasi DNA merupakan serangkaian proses yang

dilakukan untuk mendapatkan DNA murni dari suatu

tanaman. Untuk langkah kerja nya terdiri dari beberpa

langkah .

Dalam praktium yang dilakukan dapat disimpulkan

bahwa isolasi DNA murni yang digunakan sebagai bahan

untuk bioteknologi memerlukan biaya yang sangat besar.

Sehingga sangat tidak memungkinkan jika dilakukan

praktikum untuk setiap mahasiswa langsung praktik

mengisolasi secara sendiri-sendiri. Selain itu juga untuk

menghindari kegagalan dalam isolasi agar tak

mengakibatkan isolasi mubazir sehingga terjadi kerugian.

Untuk itu dalam praktikum didampingi dengan asisten.

Hasil praktikum isolasi DNA secara murni ini

walaupun menghabiskan dana yang sangat besar namun

didapatkan hasil yang sangat baik dalam pengisolasian

DNAnya. Sehingga untuk peneliti dalam bidang

bioteknologi tidak merasa dirugikan dengan hasil yang

maksimal.

4.2 Saran

Perlu adanya perlengkapan alat lagi atau fasilitas

untuk praktikum sehingga praktikum dapat berjalan dengan

efektif

Semangat terus !!!

DAFTAR PUSTAKA

Aditya.2010. Definisi Isolasi DNA.http://sharkest-

aditya.blogspot.com/2010/03/isolasidna.html#!/2010/03/isolas

i-dna.html.

Fatimah, Nur. Tanpa Tahun. Uji Kuantitatif DNA. PBT ahli pertama.

Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier

Academic Press. California.

Mahmuddin, 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR).

http://mahmuddin.wordpress.com/2010/08/31/polymerase-

chain-reaction-pcr/. Diakses tanggal 30 November 2012.

Puspita, 2010. Isolasi DNA. http:// puspitt.multiply.com/

journal/item/14/ISOLASI_DNA?&show_interstitial=1&u=%2

Fjournal%2Fitem.

Windiastika, gati. Tanpa Tahun. Metode Uji Kualitatif DNA Dengan

Elektroforesis Gel Agarosa. Balai Besar Perbenihan dan Proteksi

Tanaman Perkebunan Surabaya. Surabaya

Anonymous,a,2012.DefinisiPCR(http://arifin.blogspot.com/definisiP

CR/09/10/2010) Diakses 29 November 2012

Anonymous,b,2012.UjiKualitasDNA(http://June’sblogspot.com/17/0

5/2008)Diakses 29 November 2012

Chawla,H.S.2003.Plant Biotechnology : A Practical Approach.

Science publisher.Inc Plymouth

Clark, W. dan K. Christopher. 2008. An Introduction to DNA :

Spechtrophotometry, Degradation, and the “Frangekel”

Eksperimen http://www. zoo. utoronto. ca/ able/ volumes/ vol-

22/5-clark. pdf. Tanggal akses 20 Oktober 2007.

Harahap. 2007. spektrofotometer panjang gelombang 230.

jurnal.farmasi.ui.ac.id/pdf/2006/v03n02/hayun0302.pdf. tanggal

akses 26 Maret 2008.

LAMPIRAN

Ini merupakan hasil pengujian kuantitas dari hasil