ISOLASI DNA BUAH

Oleh:

Nama : Annisa Dwinda FatimahNIM : B1J011082Kelompok : 1 Rombongan : II Asisten : Marsekal Muhammad Karana

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara

seluler. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat

herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetic

(DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA

dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada tumbuhan (Faatih, 2009).

Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam

rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi

total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan

tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA,

dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang

mengandung DNA/RNA total (Faatih, 2009).

DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki oleh suatu

organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein dan RNA

(Weaver, 1999). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari molekul lain

seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti sehingga strukturnya dapat

terlihat dengan jelas. Tujuannya adalah mengidentifikasi dan mengkarakterisasi DNA

yang dibutuhkan untuk proses analisis biomolekuler lainnya. Tahap-tahap dalam

isolasi DNA tanaman yaitu pengambilan sampel (jaringan), lisis dinding sel dan

membran sel, purifikasi serta presipitasi (Kephart 1999).

Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaan untuk mendapatkan

data, baik tekniknya maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai kemudahan

pelaksanaan, ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas, dan dana (Karp et al.

1997). Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas tinggi merupakan satu kaidah

dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam pencandraan sidik

jari DNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode yang

umum digunakan dalam ekstraksi DNA genom tanaman yang banyak mengandung

polisakarida dan senyawa polifenol (Lumaret et al. 1998). 

B. Tujuan

Tujuan praktikum kali ini adalah untuk mengisolasi DNA kromosom buah

dan mengetahui prinsip serta proses isolasi DNA buah.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Bahan yang digunakan adalah buah strawberry (Fragraria vesca), buah

papaya (Carica papaya), buah alpukat (Persea americana), buah mangga (Mangifera

indica), buah naga (Hylocereus undatus), deterjen cair, NaCl (garam dapur), etanol

absolut, akuades, dan tenderizer.

Alat yang digunakan adalah kantung plastik, tabung ependorf, corong plastik,

pipet plastik, sarung tangan, saringan (kain), dan kamera digital.

B. Metode

1. Dua buah masing-masing dimasukkan ke dalam plastik.

2. Buah di dalam kantung plastik dihancurkan dengan cara diremas-remas.

3. Ke dalam kantung yang berisi buah, ditambahkan 50 ml larutan ekstraksi (900 ml

akuades, 100 mL deterjen, 2 sendok teh garam dapur).

4. Larutan yang sudah tercampur disaring, ditambahkan tenderizer, dan dimasukkan

ke dalam tabung ependorf.

5. Ditambahkan larutan etanol absolut dan kabut yang terbentuk diamati.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

B. Tabel 1. Pengamatan Isolasi DNA Buah

Kelompok BuahKabut Putih

(+) (-)

1 Strawberry + +

2 Alpokat - -

3 Pepaya - -

4 Mangga + +

5 Buah Naga + +

Gambar 1. DNA Strawberry (+) Gambar 2. DNA Strawberry (+)

Gambar 3. DNA Pepaya (-) Gambar 4. DNA Pepaya (-)

Gambar 5. DNA Alpukat (-) Gambar 5. DNA Buah Naga (+)

Gambar 6. DNA Mangga (+)

C. Pembahasans

Buah yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA buah ini antara lain buah

strawberry, buah alpokat, buah pepaya, buah mangga, dan buah naga. Dua buah

tersebut masing-masing dimasukkan ke dalam kantung plastik. Kemudian, buah di

dalam plastik dihancurkan dengan cara meremas-merasnya dengan tangan. Buah

yang sudah hancur dimasukkan larutan ekstraksi sebanyak 50 ml. Larutan ekstraksi

terdiri dari 900 ml akuades, 100 ml deterjen, dan 2 sendok teh garam dapur. Buah

dalam plastik kemudian diremas kembali untuk mencampurkannya dengan larutan.

Setelah tercampur, larutan disaring menggunakan corong plastik dan kain saring.

Larutan yang sudah tersaring ditambahkan dengan tenderizer dan dimasukkan ke

dalam tabung ependorf. Etanol dingin kemudian ditambahkan sampai volumenya 1,5

ml. kabut putih yang terbentuk dalam tabung ependorf selanjutnya diamati.

Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain kantung plastik yang

berfungsi sebagai tempat untuk menghancurkan buah. Corong plastik dan kain kasa

berfungsi untuk menyaring larutan yang sudah tercampur dengan buah. Sarung

tangan digunakan untuk mencegah DNAse yang ada di kulit merusak DNA. Selain

itu, sarung tangan juga menjaga agar terhindar dari bahan-bahan mutagenik dan

karsinogenik. Pipet plastik digunakan untuk memindahkan larutan. Tabung ependorf

berfungsi untuk sentrifugasi dan kamera digital berfungsi untuk mendokumentasikan

hasil pengamatan.

Berdasarkan pengamatan, didapatkan hasil bahwa isolasi DNA strawberry

kedua-duanya memiliki hasil positif. Begitu juga pada buah mangga dan buah naga.

Namun, pada buah pepaya dan alpokat menunjukkan hasil negatif. Hasil positif

ditunjukkan dengan adanya kabut putih yang terbentuk. Sebaliknya, hasil negatif

ditunjukkan dengan tidak adanya kabut putih yang terbentuk. Tidak terbentuknya

kabut putih tersebut diduga karena buah yang belum benar-benar hancur atau buah

belum tercampur sempurna dengan etanol dingin absolut. Hasil yang positif sesuai

dengan pernyataan Jamilah (2005) bahwa pada saat penambahan etanol, larutan akan

tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di

bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena etanol

memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air.

Sel makhluk hidup memiliki dinding sel pada bagian luarnya, sehingga untuk

mengeluarkan materi DNA dari inti, dinding sel harus dipecah terlebih dahulu

dengan cara mekanik ataupun enzimatik yang biasa disebut sebagai proses isolasi

DNA. DNA merupakan bahan penyusun gen dan makromolekul beruntai ganda

berbentuk heliks yang berfungsi sebagai pewarisan sifat yang menyimpan beragam

materi genetik. Tiap molekul DNA terdiri atas dua rantai panjang yang masing-

masing tersusun dari empat jenis penyusun kimiawi yang disebut nukleotida

(Campbell et al.2002). DNA genom merupakan seluruh materi genetik yang dimiliki

oleh suatu organisme termasuk di dalamnya DNA yang berinteraksi dengan protein

dan RNA (Weaver, 1999). Isolasi DNA adalah pemisahan molekul DNA dari

molekul lain seperti dinding sel, membran sel, dan membran inti sehingga

strukturnya dapat terlihat dengan jelas. Tujuannya adalah mengidentifikasi dan

mengkarakterisasi DNA yang dibutuhkan untuk proses analisis biomolekuler lainnya.

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1) Isolasi sel; (2) Lisis

dinding dan membran sel; (3) Ekstraksi dalam larutan; (4) Purifikasi; dan (5)

Presipitasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi

dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan

berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi

yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan

terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang

bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm

(rotation per minute) atau 3000 rpm. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal

yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses

selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan

memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel

yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA (Rogers and Bendich, 1994).

DNA hasil isolasi perlu dimurnikan terlebih dahulu. Pemurnian DNA

bertujuan untuk memperoleh DNA yang terbebas dari kontaminasi senyawa dan

makromolekul lain. Tahapan yang dilakukan untuk memperoleh DNA murni yaitu

membebaskan DNA dari dinding dan membran sel, disosiasi kompleks DNA-protein

dengan cara denaturasi atau proteolisis, serta pemisahan DNA dari berbagai

makromolekul lain (Ausubel et al., 1990). Pemurnian DNA dilakukan dengan

menambahkan etanol ke dalam larutan yang mengandung DNA. Penambahan etanol

dapat menyebabkan terjadinya pengendapan DNA (Sudjadi, 2008). DNA juga dapat

diendapkan dengan larutan isopropanol, namun larutan ini lebih sulit menguap

dibandingkan dengan etanol sehingga memerlukan waktu yang lebih lama dalam

proses evaporasi.

Tahap yang paling penting dalam mengisolasi DNA adalah tahap pemecahan

dinding sel untuk mengeluarkan DNA. Menurut Taylor et al. (1993), kegagalan

dalam memecahkan semua dinding sel dari suatu jaringan dapat mempengaruhi hasil

akhir isolasi DNA. Selain itu, selama penggerusan perlu ditambahkan nitogen cair

untuk menjaga suhu tetap dingin sehingga DNA tidak rusak. Menurut Rogers and

Bendich (1994), penambahan deterjen cair berfungsi melisis sel, mendenaturasi

protein, dan memisahkan karbohidrat dari asam nukleat yang disebabkan perbedaan

kelarutan. Fungsi dari penambahan garam yaitu untuk menghilangkan protein dan

karbohidrat karena garam dapat menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi.

Penambahan garam juga dpat digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+

yang dikandung oleh garam mampu memblokir dengan kutub negatif fosfat DNA.

Dalam hal ini penambahan garam bisa dikatakan dapat membantu dalam hal

pemekatan DNA (Dollard, 1994). Penambahan NaCl konsentrasi tinggi juga

dilaporkan dapat meningkatkan kelarutan polisakarida dalam etanol, secara efektif

mengurangi presipitasi tambahan pada polisakarida dan DNA (Sahasrabudhe &

Deodhar, 2010).

Purifikasi genom DNA tergantung pada seberapa kali pencuciannya. Tiga kali

pencucian dengan sentrifugasi singkat cukup untuk purifikasi DNA dan membuang

nuclease endogen atau protein lain. Penggunaan etanol dingin untuk presipitasi DNA

meningkatkan hasil isolasi DNA (Sahasrabudhe & Deodhar, 2010). Penambahan

etanol dingin berfungsi untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand-

strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang benang putih

yang terapung di atas filtrat. Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel

sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedua larutan (Jamilah, 2005).

Pada saat penambahan etanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan

pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada

dibagian dasar tabung karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil

dibandingkan air (Jamilah, 2005). Akuades pada larutan ekstraksi berfungsi sebagai

pelarut.

Menurut Syafaruddin dan Santoso (2011), seiring dengan berkembangnya

ilmu pengetahuan yang mampu mendukung akselerasi kemajuan dari seleksi untuk

mendapatkan karakter yang diinginkan, berbagai metode seleksi dengan

memanfaatkan isolasi DNA juga berkembang, antara lain adalah seleksi dilakukan

pada tingkat gametofit dan sporofit, seleksi secara in vitro, dan seleksi tingkat

molekuler. Metode PCR dengan menggunakan sepasang primer, yang meliputi :

STSs (Sequence-Tagged Sites) dan (SCARs) Sequence Characterized Amplified

Regions, DALP (Direct Amplification of Length Polymorphism), SSRs (Simple

Sequence Repeats), IFLP (Intron Fragment Length Polymorphism), ESTs (Expressed

Sequence Tags), RAMP (Random Amplified Microsatellite Polymorphism) dan

REMAP (Retroposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), AFLP (Amplified

Fragment Length Polymorphism) dan modifikasinya, SSCP (Single Strand

Conformation Polymorphism) dan melacak beberapa sifat QTL (Quantitative Trait

Locus). Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik yang digunakan untuk tujuan

ilmiah, medis atau forensik, seperti pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau

tanaman untuk tujuan diagnostik. Di sisi lain, ilmu forensik perlu memulihkan DNA

untuk identifikasi individu (misalnya bagi pencuri, kecelakaan atau korban perang),

penentuan ayah atau identifikasi hewan.

IV. KESIMPULAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan sebelumnya dapat diambil kesimpulan

bahwa:

1. Hasil isolasi DNA buah strawberry (Fragraria vesca), buah mangga

(Mangifera indica), dan buah naga (Hylocereus undatus) adalah positif, yang

artinya terdapat kabut putih pada tabung ependorf. Sedangkan hasil isolasi DNA

buah papaya (Carica papaya) dan buah alpukat (Persea americana) adalah

negatif.

2. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi sel, lisis dinding dan

membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.

B. Saran

Untuk praktikum selanjutnya sebaiknya lebih dimaksimalkan lagi waktu

praktikumnya.

DAFTAR REFERENSI

Ausubel FM et al. 1990. Current Protocols in Molecular Biology. Kanada, John Willey & Sons.

Campbell NA, JB Reece, and LG Mitchell. 2002. Biologi. Ed ke-5. Lestari R, EIM Adil, N Anita, Andri, Wibowo WF, W Manulu, penerjemah; Safitri A, L simarmata, HW Hardani, editor. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology Fifth Edition.

Dollard. 1994. Personality And Psychotherapy: An Analysis In Terms Of Learning, Thinking And Culture. New York: McGraw-Hill.

Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom Isolation and Digestion of Chromosomal DNA. Sains dan Teknologi, 10(1), 61-67.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang.

Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, and T. Hodgkin. 1997. Molecular Tool in Plant Genetic Resources Conservation: A Guide to The Technologies. IPGRI Technical Bulletin no. 2.

Kephart D. 1999. Rapid Isolation of genomic DNA from small quantities of human tissue. http://www.promega.com/profiles/203/ProfilesinDNA_203_07.pdf. Diakses pada tanggal 18 Mei 2013.

Lumaret, R., H. Michaud, J.P. Ripoll, and L. Toumi. 1998. Chloroplast DNA Extraction Procedure For Species High In Phenolics And Polysaccharides. p. 15-17. In A. Karp, P.G. Isaac, and D.S. Ingram (Eds.). Molecular Tool for Screening Biodiversity. Chapman and Hall, London.

Rogers, S.O. and Bendich, A.J. 1994. Extraction of total celluler DNA from plants, algae, and fungi. Plant Mol Biol DI: 1-81.

Sahasrabudhe, A., & Deodhar, M. 2010. Standardization of DNA Extraction and Optimization of RAPD-PCR. International Journal of Botany, 6(3), 293-298.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta, Kanisius.

Syafaruddin dan T. J. Santoso. 2011. Optimasi Teknik Isolasi dan Purifikasi Dna Yang Efisien dan Efektif Pada Kemiri Sunan (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw). Jurnal Littri 17(1), Maret 2011. Hlm. 11 – 17.

Taylor BH, Manhart JR, Amasino RM. 1993. Isolation and Characterizations of Plants DNA, Methods in Plant Moleculer Biology and Biotechnology. London: CRC Pr.

Weaver, R.F. 1999. Molecular Biology. WCB McGraw-Hill Publisher. USA.