LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI 1

ISOLASI DNA

Disusun Oleh :

KELOMPOK 3 (A)

1. Nur’azmi Ayuningtyas (I11111009)

2. Prisa Dwicahmi (I11111010)

3. Heriyanto Andreas (I11111019)

4. Leo Rinaldi (I11111023)

5. Isma Resti Pratiwi (I11111029)

6. Agnes Widyaningsih (I11111008)

7. Syarifi (I11111072)

8. Maria Enjelina (I11111077)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS TANJUNGPURA

ii

2011/2012

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas limpahan

berkat, rahmat, dan hidayah-Nya lah, laporan modul Biologi Molekuler ini dapat

diselesaikan tepat pada waktunya.

Pembuatan laporan ini berguna untuk memenuhi tugas terstruktur

modul Modul Biologi Molekuler dalam semester Genap pada program studi

Pendidikan Kedokteran Universitas Tanjungpura.

Pada proses penulisan laporan ini sampai dengan selesainya, penulis

banyak mendapatkan bantuan berupa dorongan dari semua pihak, maka pada

kesempatan ini tak lupa penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada:

1. dr. Delima Fajar Liana, selaku koordinator penanggung jawab modul.

2. dr. Virhan Novianry, selaku narasumber dalam modul ini.

3. Kak Lala, selaku asisten laboratorium.

4. Orang tua penulis yang selalu memberi semangat dari jauh dan do’a.

5. Teman-teman penulis yang telah memberi banyak saran dan dorongan

bagi penulis.

6. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Penulis menyadari sebagai manusia biasa, tentu tak luput dari

kesalahan dan kekurangan dalam penulisan laporan ini. Maka dari itu penulis

sangat mengharapkan kritik dan saran demi perbaikan penulisan laporan ini.

Akhirnya penulis berharap semoga laporan ini dapat memberikan

manfaat bagi kita semua. Amin.

Pontianak, Mei 2012

iii

Penulis

DAFTAR ISI

COVER i

KATA PENGANTAR ii

DAFTAR ISI iii

BAB I PENDAHULUAN 1

LATAR BELAKANG 1

TUJUAN 1

MANFAAT 2

BAB II DASAR TEORI 3

SALIVA 3

DNA 5

BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM 7

ALAT DAN BAHAN 7

CARA KERJA 7

BAB IV HASIL PRAKTIKUM 10

BAB V PEMBAHASAN 11

BAB VI KESIMPULAN 16

DAFTAR PUSTAKA 17

iv

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Sampai awal tahun 70an, DNA merupakan molekul seluler yang paling

sulit dianalisis, karena strukturnya yang panjang dan secara kimiawi monoton.

Sebagai materi genetik suatu organisme, nukleotida hanya dapat dianalisis secara

tidak langsung melalui analisis urutan protein dan RNA melalui analsis genetik.

Kini menjadi hal yang mungkin untuk mengisolasi suatu region spesifik dari suatu

genome, yaitu total informasi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme; dan

untuk memproduksi jumlah kopi yang tidak terbatas dari region tersebut, atau

untuk mendeterminasi urutan nukleotida dari region tersebut hanya dalam

semalam, dengan kecepatan pembacaan 1000 nukleotida per detik.

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan

pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan

bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari

materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA

manusia dapat diisolasi melalui saliva..

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.

Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan

teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.

Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah

tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu

supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002:

115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu

komponen dari campuran. Pada praktikum kali ini, kami akan mencoba untuk

mengisolasi DNA pada saliva.

1.2. Tujuan

2

Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA dari saliva dengan

menggunakan kit Wizard® Genomic DNA Purification.

1.3. Manfaat

Memberikan kesempatan kepada Mahasiswa Untan untuk menerapkan

pengetahuan mereka dalam isolasi DNA.

3

BAB II

DASAR TEORI

2.1. SALIVA

Saliva merupakan salah satu dari cairan di rongga mulut yang diproduksi

dan diekskresikan oleh kelenjar saliva dan dialirkan ke dalam rongga mulut

melalui suatu saluran. Saliva terdiri dari 98% air dan selebihnya adalah elektrolit,

mukus dan enzim-enzim. Saliva diekskresi hingga 0.5 – 1.5 liter oleh tiga kelenjar

liur mayor dan minor yang berada di sekitar mulut dan tenggorokan untuk

memastikan kestabilan di sekitar rongga mulut.

KELENJAR SALIVA

Kelenjar-kelenjar saliva mayor terletak agak jauh dari rongga mulut dan

sekretnya disalurkan melalui duktusnya kedalam rongga mulut. Kelenjar saliva

mayor terdiri dari kelenjar parotis yang terletak dibagian bawah telinga

dibelakang ramus mandibula, kelenjar submandibularis yang terletak dibagian

bawah korpus mandibula dan kelenjar sublingualis yang terletak dibawah lidah.

Selain itu terdapat juga kelenjar saliva minor yang terdiri dari kelenjar labial,

kelenjar bukal, kelenjar Bladin-Nuhn, kelenjar Von Ebner dan kelenjar

Weber. 3,15,19.

KOMPOSISI SALIVA

Komponen-komponen saliva, yang dalam keadaan larut disekresi oleh

kelenjar saliva, dapat dibedakan atas komponen organik dan anorganik. Namun

demikian, kadar tersebut masih terhitung rendah dibandingkan dengan serum

karena pada saliva bahan utamanya adalah air yaitu sekitar 99.5%. Komponen

anorganik saliva antara lain : Sodium, Kalsium, Kalium, Magnesium, Bikarbonat,

Khlorida, Rodanida dan Thiocynate (CNS), Fosfat, Potassium dan Nitrat.

Sedangkan komponen organik pada saliva meliputi protein yang berupa enzim

amilase, maltase, serum albumin, asam urat, kretinin, musin, vitamin C, beberapa

4

asam amino, lisosim, laktat, dan beberapa hormon seperti testosteron dan

kortisol.

FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI SEKRESI SALIVA

Kelenjar saliva memproduksi saliva hampir setengah liter setiap hari.

Beberapa faktor mempengaruhi sekresi saliva dengan merangsang kelenjar saliva

melalui cara-cara berikut:

1. Faktor mekanis yaitu dengan mengunyah makan yang keras atau permen

karet.

2. Faktor kimiawi yaitu melalui rangsangan seperti asam, manis, asin, pahit

dan pedas.

3. Faktor neuronal yaitu melalui sistem syaraf autonom baik simpatis maupun

parasimpatis.

4. Faktor Psikis yaitu stress yang menghambat sekresi saliva.

5. Rangsangan rasa sakit, misalnya oleh radang, gingivitis, dan pemakaian protesa

yang dapat menstimulasi sekresi saliva.

FUNGSI FISIOLOGI

Saliva mempunyai fungsi yang sangat penting untuk kesehatan rongga

mulut karena mempunyai hubungan dengan proses biologis yang terjadi dalam

rongga mulut. Secara umumnya saliva berperan dalam proses perlindungan pada

permukaan mulut, pengaturan kandungan air, pengeluaran virus-virus dan produk

metabolisme organisme sendiri dan mikro-organisme, pencernaan makanan dan

pengecapan serta diferensiasi dan pertumbuhan sel-sel kulit, epitel dan saraf.

FUNGSI NON FISIOLOGI

Saliva dapat berperan sebagai anti-kabut (anti-fog). Penyelam skuba selalu

melapisi kaca mata menyelam mereka dengan selapis tipis saliva untuk

menghidari kabut. Selain itu saliva juga berperan efektif sebagai agen pembersih

untuk memelihara lukisan. Cotton swab yang dilapisi saliva disapukan pada

lukisan untuk membuang kotoran yang melekat pada lukisan tersebut.

2.2. DNA

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan

secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas.

Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi

sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas

berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA

mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat

yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan

sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak

memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot

berbentuk linier dan memiliki protein histon.

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan

pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan

bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari

materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan.

DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu

sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.

DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu

DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel

berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang paling

sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut beserta

akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh.

Darah (whole blood) dan sumsum tulang mamalia mengandung baik sel-

sel berinti (sel darah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah). Untuk

mengisolasi DNA dari darah dan sumsum tulang, sel darah merah yang tidak

mengandung DNA genom harus dilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan dari sel

darah putih. Sel-sel darah putih yang sudah dipisahkan kemudian dilisiskan

dengan bantuan bahan pengawet DNA yaitu, deterjen anionik yang dapat

melarutka komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga dapat mengurangi

6

aktivitas Dnase yang terdapat di dalam sel. Bila perlu dapat ditambahkan Rnase

untuk menyingkirkan kontaminasi RNA.

7

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1. Alat dan bahan

3.1.1. Alat

1. Microcentrifuge tube 1,5 ml

2. Micropipet 0,5 - 10 µl,10 - 100 µl,100 – 1000 µl

3. Tip biru

4. Tip kuning

5. Tip putih

6. Vortex

7. Microcentrifugator

8. Inkubator

9. Spuit disposable 5 ml

3.1.2. Bahan

1. Wizard ® Genomic DNA purification kit 100 isolations A1120, yang

terdiri dari:

a. Cell lysis solution

b. Nuclei Lysis solution

c. Protein precipitation solution

d. DNA Rehydration Solution

2. RNase Solution

3. Isopropanol

4. Alkohol 70%

5. Saliva

3.2. Cara Kerja

1. Masukan 90 µl cell lysis solution ke dalam tabung microcentrifuge steril

2. Tambahkan 300 µl sel mukosa pipi dan tabung diputar bolak-balik 5-6

kali untuk homogenasi

8

3. Inkubasi campuran diatas selama 10 menit dalam suhu ruang (bolak –

balik 2-3 kali selama inkubasi)

4. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2

menit

5. Buang supernatan tanpa menganggu pellet

6. Tambahkan 600 µl cell lysis solution ke pellet dan vortex sebentar

7. Ulangi tahap 4 dan 5 sampai pellet terlihat putih

8. Tambahkan 300 µl nuclei lysis solution ke pellet. Pipet larutan 5-6 kali

untuk melisiskan sel mukosa pipi dan inti sel. Larutan harus benar-benar

jadi kental. Jika masih terlihat butiran-butiran kecil setelah pencampuran,

inkubasi campuran tersebut pada suhu 37ºC sampai butiran tersebut

hilang.

9. Optional tambahkan 1,5 µl RNase solution dan campurkan dengan cara

membolak-balik tabung. Inkubasi campuran pada suhu 37ºC Selama 15

menit, lalu dinginkan pada suhu ruang.

10. Tambahkan 100 µl protein precipitation solution ke dalam lisate dan

vortex selama 20 detik. Setelah di vortex akan terlihat butiran-butiran

protein halus.

11. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit pada suhu

ruang. Akan terlihat pellet dengan warna coklat terang. Bila supernatan

masih berwarna coklat, ambil supernatan tersebut, pindahkan ke tabung

microcentrifuge bersih, ulangi langkah 10 dan 11.

12. Pindahkan supernatan ke dalam tabung microcentrifuge bersih yang

sudah berisi 300 µl isopropanol.

13. Bolak-balik tabung secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih

halus (DNA)

14. Untuk optimalisasi, simpan tabung pada suhu -20ºC selama 1 jam.

15. Sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 3

menit akan terlihat pellet putih

16. Buang supernatan, cuci dengan 400 µl alcohol 70% dingin

17. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu

ruang, sampai DNA berubah menjadi transparan.

18. Buang supernatan, kering anginkan DNA pada suhu ruang.

19. Larutkan DNA dengan 100 µl rehydration solution

9

20. Rehidrasi DNA pada suhu 65ºC selama 1 jam atau suhu 4ºC Overnight

21. Simpan DNA pada suhu -20ºC

10

BAB IV

HASIL PRAKTIKUM

Sampel diambil dari Ibu. Pada tahap ke lima praktikum setelah

disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit didapatkan sedikit

pelet di dasar tabung falcon. Pada tahap ke delapan karena masih terdapat

butiran-butiran kecil setelah pencampuran( Nuclei Lysis Solution 300µl ke pellet)

maka larutan diinkubasi pada inkubator selama 10 menit hingga butirannya

hilang. Pada tahap ke sepuluh setelah penambahan 100 µl protein precipitation

solution ke larutan dan di vortex selama 20 detik terlihat butiran-butiran protein

halus. pada tahap ke tiga belas setelah penambahan isopropanol dan tabung di

bolak-balik tidak terdapat benang-benang putih halus (DNA) pada praktikum

kelompok kami dikarenakan DNA nya tidak sebanyak sampel pada darah. Pada

tahap ke lima belas setelah disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama

3 menit terlihat pellet putih lalu supernatan dibuang pelletnya ditambah alkohol

70%. Terakhir DNA tersebut disimpan di suhu -20 oC untuk proses PCR dan

Elektroforesis nantinya.

11

BAB V

PEMBAHASAN

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan

secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas.

Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan

berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan

kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain

itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan

sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA

nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari

organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot.

DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan

DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings

1994: 315–316; Raven & Johnson 2002: 94).

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan

pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa

purin dan pirimidin. ‘Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang

memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C)

dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan

dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika

Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen.

Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa,

satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003:

176–178). Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat

herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi

genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. (Human Genome Project 2005: 1)

12

DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. DNA

manusia dapat diisolasi melalui saliva. Saliva terdiri atas Komponen anorganik

saliva antara lain : Sodium, Kalsium, Kalium, Magnesium, Bikarbonat, Khlorida,

Rodanida dan Thiocynate (CNS), Fosfat, Potassium dan Nitrat. Sedangkan

komponen organik pada saliva meliputi protein yang berupa enzim amilase,

maltase, serum albumin, asam urat, kretinin, musin, vitamin C, beberapa asam

amino, lisosim, laktat, dan beberapa hormon seperti testosteron dan kortisol.

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA

eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular,

sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Pada

isolasi DNA, pengerjaannya harus sangat hati-hati karena DNA sangat mudah

rusak oleh enzim DNAse yang terdapat pada kulit, saliva maupun air mata

pemeriksa. Oleh karena itu selama pengerjaan harus mengenakan sarung

tangan dan berbicara sesedikit mungkin. Buffer lysis dan Proteinase-K disini

dipakai sebagai reagen pelisis supaya komponen DNA dalam sitoplasma sel bisa

keluar dan diisolasi. Phenol digunakan untuk mengendapkan komponen protein

lain yang tidak dikehendaki sedangkan etanol 70% sebagai pencuci hasil isolasi.

Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan

presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi

berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal

sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi

yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di

dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang

bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Kimball

2005: 4; Lewiston 2002:1–3; LPCH 2005: 2).

Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu:

1. Melisiskan sel dengan cell lysis solution

2. Melisiskan inti dengan nuclei lysis solution juga menguraikan atau

merusakkan molekul RNA dengan Rnase solution

3. Mempresipitasikan protein dengan protein precipitation solution

4. Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh.

13

Tahap pertama yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan

pelisis sel (cell lysis solution), putar bolak-balik 5-6 kali untuk homogenasi.

Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu ruangan selama 10 menit. Setelah

dilakukan inkubasi, saliva yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu

disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm. Sentifugasi ini

bertujuan untuk memisahkan bagian sel dengan sitoplasma. Selanjutnya

supernatan yang terbentuk dibuang. Lanjutkan kembali dengan sentrifugasi

selama 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm. Sentrifugasi kedua ini berfungsi

untuk memisahkan bagian DNA dari inti sel.

Tahap selanjutnya yaitu pelisisan inti sel menggunakan nuclei lysis solution,

larutan pelisis sel darah putih ini terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl

Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit

hancur (Rybicki & Purves 2005: 1; Harley 2005: 410).

Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan

sel dari zat-zat lainnya; Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan RNAse dan

diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan untuk

mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur.

Tahap berikutnya yaitu presipitasi; Tahap presipitasi dilakukan dengan cara

meneteskan larutan presipitasi protein (protein precipitation solution) dan

kemudian divortex selama 20 detik yang bertujuan untuk menghomogenkan

larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan

dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki

kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap.

Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 3 menit dengan

kecepatan 15000 rpm. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke

dalam tabung berisi isopropanol dingin. Pemberian isopropanol bertujuan untuk

visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali dengan kecepatan

13000 rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar

tabung. Keringkan DNA pada suhu ruang, kemudian larutkan DNA dengan

rehydration solution dengan maksud untuk mengawetkan DNA, kemudian

rehidrasi DNA pada suhu 650C selama 1 jam, dan simpan DNA dalam suhu -

200C(Harley 2005: 409–410; Lewiston 2002: 1–2).

4.3 Fungsi Bahan Praktikum

14

Isolasi DNA merupakan cara ataupun metode yang digunakan untuk

memisahkan DNA dari sel , baik dari inti, mitokondria, maupun kloroplas.

Kit Wizard DNA Purification (Promega) terdiri dari :

a. Cell lysis solution adalah senyawa larutan konsentrasi tinggi (hipertonis). Bila

bercampur dengan sel maka akan terjadi proses osmosis yang

mengakibatkan sel akan mengalami lisis

b. Nuclei lysis solution adalah senyawa yang mengandung detergen digunakan

untuk melisiskan barier sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia

yang mampu merusak dinding dan membran sel. Karena pada detergen

mengandung sodium dodesil sulfat ( SDA ) yang dapat menyebabkan

hilangnya molekullipid pada membran sel sehingga struktur membrane akan

rusak dan melisiskan isi sel.

c. Protein Presipitation solution adalah senyawa yang mengandung amonium

asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya

senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga

menyebabkan protein mengendap.

d. DNA rehydration solution berfungsi untuk pengawetan DNA

e. RNAse Solution adalah senyawa yang berisi enzim pemutus RNA.

Fungsi dari penambahan isopropanol yaitu untuk mengikat strand DNA yang

telah terkumpul. Strand strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak

sebagai benang benang putih yang terapung diatas filtrat. Selain itu alkohol juga

berfungsi mempurifikasi DNA.

Alkohol 70 % yang ditambahkan dalam keadaan dingin, karena pada alcohol

yang dingin dapat membentu mempercepat proses mempurifikasi DNA. Selain itu

jika alkohol yang dingin yang diberikan maka konsentrasi DNA yang akan terikat

oleh alkohol tersebut akan semakin pekat.

4.4 Analisis Percobaan

DNA dapat diperoleh dari sel yang mengandung inti seperti pada sampel:

darah, serum/plasma, jaringan, akar rambut, sperma. Teknik utama dari isolasi

DNA adalah:

1. Penghancuran dinding sel.

2. Lisis sel dengan menggunakan deterjen keras (SDS atau Triton X).

15

3. Membersihkan debris sel dengan proteinase.

4. Pencucian dengan menggunakan alkohol.

Teknik isolasi DNA memiliki beberapa tahap, yaitu:

1. Penghancuran membran sel dengan Cell Lysis Solution (CLS)

2. Penghancuran membran inti dengan Nuclei Lysis Solution (NLS)

3. Pengendapan protein dengan Protein Precipitation Solution (PPS)

4. Pencucian DNA dengan isopropanol dan alkohol 70%

5. Rehidrasi DNA dengan Rehidration Solution

Tujuan sentrifugasi:

1. Sentrifuge pertama bertujuan untuk memisahkan nukleus dari sitoplasma

2. Sentrifuge kedua bertujuan untuk memisahkan DNA dari isi nukleus

Sentrifuge ketiga bertujuan untuk mengendapkan protein yang telah dipresipitasi

16

BAB VI

KESIMPULAN

Isolasi DNA merupakan tahap awal dalam proses identifikasi DNA,

sampel yang dapat diambil dalam isolasi dna bisa dari sel mukosa pipi ( Saliva )

dan darah vena, untuk pengindentifikasian haruslah teliti agar hasil yang

didapatkan bisa akurat.

17

DAFTAR PUSTAKA

Faatih, Mukhlissul. 2009. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi, Volume 10 No.

1; 61-67. Surakarta: UMS

Pedjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI

Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Penerbit Erlangga

Buku Penuntun Praktikum (BPP), Modul Biologi Molekuler, FKUI, 2010-2011