laporan lengkap isolasi mo endofit

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI DAN UJI EFEKTIVITAS FUNGI ENDOFIT

SEBAGAI ANTIMIKROBA

OLEH :

KELOMPOK IV

SONIA RANGGA SALU (N 111 10 111)

ARI KURNIAWATI (N 111 10 134)

EVY MUSTIQAWATI (N 111 10 253)

RUDIARFIANSYAH (N 111 10 261)

NATALIA WIJOYO (N 111 10 286)

HARDIYANTI HARAHAP (N 111 10 302)

SULTAN (N 111 10 303)

GOLONGAN JUMAT PAGI

ASISTEN : SHERWIN ARMANDA

MAKASSAR

2011

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Tanaman dan mikroorganisme mempunyai hubungan yang sangat

erat satu sama lain. Mikroorganisme dapat menyerang tanaman sehingga

menyebabkan penyakit pada tanaman induknya, sementara ada pula

mikroorganisme yang bersimbiosis sangat baik dengan tanaman

induknya. Mikroorganisme pada tanaman terdiri dari 2 jenis yaitu

mikroorganisme yang tinggal di permukaan tanaman disebut epifit

(epiphyte) dan mikroorganisme yang tinggal di dalam tanaman disebut

endofit (endophyte). (1:5)

Studi akhir-akhir ini telah banyak dilakukan para peneliti

menggunakan tanaman tropis. Data menunjukkan bahwa tanaman induk

di daerah tropis kaya akan mikroba endofit yang belum diklasifikasikan

dan kemungkinan mengandung generasi dan spesies baru. Hubungan

antara mikroba endofit dan tanaman dalam menghasilkan metabolit

sekunder sangat menarik dipelajari. (1:5)

Dalam bioteknologi, mikroba endofit ini sangat potensial sebagai

penghasil senyawa-senyawa baru berkhasiat obat, metabolit sekunder,

pengontrol biologi dan berbagai senyawa yang bermanfaat. Dengan

demikian diperlukan pengembangan atau penelitian untuk mempelajari

hubungan antara tanaman dan endofitik pada kondisi tropis. (2:1)

I.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

I.2.1 Maksud Percobaan

Mengetahui dan memahami cara mengisolasi mikroba endofit dari

suatu sampel dan pengujian aktivitas antimikrobanya.

I.2.2 Tujuan Percobaan

Mengisolasi fungi endofit dari sampel tanaman Tapak Liman

(Elephantopus scaber) dan menentukan kemampuannya dalam

menghambat pertumbuhan dari mikroorganisme tertentu.

I.3 Prinsip Percobaan

1. Pengambilan dan pengolahan sampel

Sampel tanaman Tapak Liman (Elephantopus scaber) dibersihkan,

disterilkan dengan alkohol 70%, NaOCl 25%, dan air steril, dan

dihancurkan sehingga sampel tanaman tersebut dapat dibuat

pengencerannya, mulai dari 10-1 hingga 10-5.

2. Isolasi dan pemurnian mikroorganisme endofit

Tiga tingkat pengenceran terakhir sampel, yaitu pengenceran 10-3,

10-4, dan 10-5 diisolasi menggunakan metode pengenceran ke dalam

medium PDA (Potato Dextrose Agar) dan diinkubasikan selama 2-5

hari pada suhu kamar, kemudian mikroorganisme terpilih yang

tumbuh kembali diinokulasikan ke dalam medium PDA (Potato

Dextrose Agar) yang baru dengan menggunakan metode gores

untuk mendapatkan koloni terpisah dan diinkubasikan selama 1-3

hari pada suhu kamar, kemudian koloni yang tumbuh terpisah

kembali diinokulasikan dengan metode agar miring ke dalam medium

PDA (Potato Dextrose Agar) hingga diperoleh stok kultur murni

setelah diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar.

3. Peremajaan dan pembenihan

Mikroorganisme dari stok kultur murni diinokulasikan kembali

dengan metode agar miring ke dalam medium PDA (Potato Dextrose

Agar) yang baru dan diinkubasikan selama 1-3 hari pada suhu

kamar, kemudian 1-2 ose koloni diinokulasikan ke dalam medium

PDY (Potato Dextrose Yeast) dan diinkubasi selama 3 hari pada

suhu kamar, kemudian seluruhnya diinokulasikan ke dalam medium

produksi dan diinkubasi selama 7 hari pada suhu kamar sambil

diaerasi pada shaker, lalu sampel diendapkan dengan alat sentrifus

selama 20 menit dengan kecepatan 2500 rpm hingga diperoleh filtrat

dan residunya.

4. Pengujian aktivitas mikroba

Pengujian aktivitas fungi endofit terpilih dari sampel tapak liman

(Elephantopus scaber)dengan menginokulasikan suspensi biakan

Streptococcus mutans dan Escherichia coli ke dalam medium NA

(Nutrient Agar), kemudian filtrat dan residu diuji daya hambatnya ke

dalam medium tersebut dengan paper disk dan diinkubasikan

selama 1 x 24 jam pada suhu 370C, kemudian diamati zona

hambatnya.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Teori Umum

Mikroba endofit (bakteri dan fungi) adalah organisme hidup yang

berukuran mikroskopis yang hidup di dalam jaringan tanaman (xilem dan

floem), daun, akar, buah, dan batang. Mikroba ini hidup bersimbiosis

saling menguntungkan, dalam hal ini mikroba endofitik mendapatkan

nutrisi dari hasil metabolisme tanaman dan memproteksi tanaman

melawan herbivora, serangga atau jaringan yang patogen sedangkan

tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang diperlukan

selama hidupnya. Mikroba endofit spesifik yang diperoleh dari bagian

dalam tanaman diduga mampu menghasilkan sejumlah senyawa bioaktif

yang spesifik yang sama dengan senyawa bioaktif tanaman tanpa harus

mengekstraksi bagian tanamannya sehingga kelangsungan hidup

tanaman tidak terganggu. (1:3)

Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit

sekunder sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang

sangat besar dan dapat diisolasi dari tanaman inangnya tersebut. Dari

sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-

masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri

dari bakteri dan jamur. (1:6)

Beberapa ahli telah mengisolasi dan meneliti endofit dari berbagai

tanaman diantaranya tanaman obat, tanaman, dan tanaman-tanaman

hutan. Bakteri atau fungi tersebut dapat menghasilkan senyawa metabolit

yang dapat bermanfaat bagi manusia sebagai antibiotika

(antifungi/antibakteri), antivirus, antikanker, antidiabetes, antimalaria,

antioksidan, antiimunosupresif, antiserangga, zat pengatur tumbuh, dan

penghasil enzim-enzim hidrolitik seperti amilase, selulase, xilanase,

ligninase, dan kitinase. Manfaat dari endofit lainnya juga dalam fiksasi

nitrogen (N2) pada beberapa tanaman. (2:4)

Fungi endofit adalah fungi yang terdapat di dalam sistem jaringan

tumbuhan, seperti daun, bunga, ranting ataupun akar tumbuhan. Fungi ini

menginfeksi tumbuhan sehat pada jaringan tertentu dan mampu

menghasilkan mikotoksin, enzim serta antibiotika. (3:16)

Asosiasi fungi endofit dengan tumbuhan inangnya, oleh Carrol

(1988) digolongkan dalam dua kelompok, yaitu mutualisme konstitutif dan

induktif. Mutualisme konstitutif merupakan asosiasi yang erat antara fungi

dengan tumbuhan terutama rumput-rumputan. Pada kelompok ini fungi

endofit menginfeksi ovula (benih) inang, dan penyebarannya melalui benih

serta organ penyerbukan inang. Mutualisme induktif adalah asosiasi

antara fungi dengan tumbuhan inang, yang penyebarannya terjadi secara

bebas melalui air dan udara. Jenis ini hanya menginfeksi bagian vegetatif

inang dan seringkali berada dalam keadaan metabolisme inaktif pada

periode yang cukup lama. (3:16)

Ditinjau dari sisi taksonomi dan ekologi, fungi ini merupakan

organisme yang sangat heterogen. Clay (1988) melaporkan, bahwa fungi

endofit dimasukkan dalam famili Balansiae yang terdiri dari 5 genus yaitu

Atkinsonella, Balansiae, Balansiopsis, Epichloe dan Myriogenospora.

Genus Balansiae umumnya dapat menginfeksi tumbuhan tahunan dan

hidup secara simbiosis mutualistik dengan tumbuhan inangnya. Dalam

simbiosis ini, fungi dapat membantu proses penyerapan unsur hara untuk

proses fotosintesis serta melindungi tumbuhan inang dari serangan

penyakit, dan hasil dari fotosintesis dapat digunakan oleh fungi untuk

mempertahankan kelangsungan hidupnya. (3:17)

Banyak kelompok fungi endofit yang mampu memproduksi

senyawa antibiotika yang aktif melawan bakteri maupun fungi patogenik

terhadap manusia, hewan dan tumbuhan, terutama dari genus

Coniothirum dan Microsphaeropsis. Fungi endofit mampu menghasilkan

siklosporin A, yang berpotensi sebagai antifungal dan bahan

imunosupresif. Siklosporin dihasilkan oleh strain Acremonium luzulae

yang diisolasi dari buah strawberry. (3:18)

Senyawa antibiotika lainnya seperti sefalosporin mulanya

dihasilkan oleh satu strain Cephalosporium. Selanjutnya juga ditemukan

pada fungi Anixiopsis, Arachnomyces,Diheterospora, Paecilomyces,

Scopulariopsis dan Spiroidium. (3:18)

Mikroba endofit yang diisolasi dari tumbuhan obat akan memiliki

aktivitas yang lebih besar, bahkan dapat memiliki aktivitas yang lebih

besar dibandingkan aktivitas tumbuhan inangnya. Dilihat dari segi

efisiensi, hal ini sangat menguntungkan, karena siklus hidup mikroba

endofit lebih singkat dibandingkan siklus hidup tumbuhan inangnya,

sehingga dapat menghemat waktu yang dibutuhkan untuk

mendapatkan senyawa tersebut, dan jumlah senyawa yang diproduksi

dapat dibuat dalam skala yang besar dengan menggunakan proses

fermentasi. Di samping itu, ada keuntungan lain yang diperoleh,

yaitu menjaga kelestarian tumbuhan-tumbuhan obat, terutama yang

termasuk jenis tumbuhan langka, agar tidak dieksploitasi secara terus

menerus yang akhirnya akan mengakibatkan kepunahan. (2:6)

Metabolit sekunder merupakan senyawa yang disintesis oleh

suatu mikroba, tidak untuk memenuhi kebutuhan primernya (tumbuh dan

berkembang) melainkan untuk mempertahankan eksistensinya dalam

berinteraksi dengan lingkungannya. Metabolit sekunder yang dihasilkan

oleh mikroorganisme endofit merupakan senyawa antibiotik yang mampu

melindungi tanaman dari serangan hama insekta, mikroba patogen, atau

hewan pemangsanya, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai agen

biokontrol. (3:6)

Senyawa ini juga dapat digunakan sebagai alat pemikat bagi

serangga atau hewan lainnya guna membantu penyerbukan atau

menyebarkan bijinya, dan sebagai alat pelindung terhadap kondisi

lingkungan fisik yang ekstrim seperti intensitas ultraviolet yang tinggi dari

sinar matahari, pencemaran lingkungan secara kimiawi, kekeringan yang

berkepanjangan, atau berkurangnya zat makanan pada tempat

tumbuhnya. (3:7)

Ada beberapa macam metode isolasi yang dapat digunakan untuk

mengisolasi suatu mikroba endofit, yaitu:

1. Isolasi pada agar cawan

Prinsip pada metode ini adalah mengencerankan mikroorganisme

sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari

organisme lainnya. Setiap koloni yang yang tampak pada cawan tuang

tersebut setelah diinkubasi besaral dari sel tunggal. Namun,

pegenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir

mengandung koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan di dalam

cawan.

2. Isolasi Pada Medium Cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme

tidak dapat tumbuh pada cawan (medium padat), tetapi hanya dapat

tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran

dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran,

peluang untuk mendapatkaan satu sel semakin besar.

3. Isolasi Sel Tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel

mikroorganisme yang tidak dapat tumbuh pada agar cawan maupun

medium cair. Sel mikroorganisme dilihat bersamaaan dengan sekitar

100 kalinya kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan

pipet kapiler yang sangat halus ataupun mikro.

II.2 Uraian Bahan

1. Aquadest (4 : 96)

Nama Resmi : Aqua destillata

Nama Lain : Aquadest

RM/BM : H2O/18,02

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berasa, dan

tidak berbau

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan : Sebagai pelarut

2. Alkohol (4 : 65)

Nama Resmi : Aethanolum

Nama Lain : Alkohol

RM/BM : C2H6O/46,00

Pemerian : Cairan tidak berwarna, jernih, mudah menguap,

mudah bergerak, bau khas, rasa panas, mudah

terbakar dengan memberikan nyala biru yang

tidak berasap

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari

cahaya, jauh dari nyala api

Kegunaan : Sebagai antiseptik

3. Agar (4 : 74)

Nama Resmi : Agar

Nama Lain : Agar-agar

Pemerian : Berkas potongan memanjang, tipis seperti selaput,

berlekatan, berbentuk keping, serpih atau butiran,

jingga lemah kekuningan, abu-abu kekuningan

sampai kuning pucat, tidak berwarna, tidak

berbau, berlendir jika lembap

Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air, larut dalam air

mendidih


Kegunaan : Sebagai pengeras medium

4. Dekstrosa (5 : 300)

Nama Resmi : Dextrosum

Nama Lain : Dekstrosa, glukosa

RM/BM : C6H12O6/180,00

Pemerian : Hablur, tidak berwarna, serbuk hablur, butiran

putih, tidak berbau, rasa manis

Kelarutan : Larut dalam air, memberikan larutan berwarna

coklat kekuningan yg bereaksi dengan asam


Kegunaan : Sebagai komposisi medium

5. Natrium klorida (4 : 403)

Nama Resmi : Natrii chloridum

Nama Lain : Natrium klorida

RM/BM : NaCl/58,44

Pemerian : Hablur heksahedral, tidak berwarna, atau serbuk

hablur putih, tidak berbau, rasa asin

Kelarutan : Larut dalam 2,8 bagian air, dalam 2,7 bagian air

mendidih, dan dalam lebih kurang 10 bagian

gliserol P, sukar larut dalam etanol (95%) P



6. Pepton (5 : 721)

Nama Resmi : Pepton

Pemerian : Serbuk; kuning kemerahan sampai coklat; bau

khas tidak busuk

Kelarutan : Larut dalam air; memberikan larutan berwarna

coklat kekuningan yang bereaksi agak asam;

praktis tidak larut dalam etanol (95%) P dan dalam

eter P


7. Ekstrak Beef (5 : 1152)

Kaldu daging sapi konsentrat diperoleh dengan

mengekstraksi daging sapi segar tanpa lemak, dengan cara

merebus dalam air dan menguapkan kaldu pada suhu rendah

dalam ruang hampa udara sampai terbentuk residu kental

berbentuk pasta

Pemerian : Massa berbentuk pasta, berwarna coklat

kekuningan sampai coklat tua, bau dan rasa

seperti daging, sedikit asam

Penyimpanan : Wadah tidak tembus cahaya, tertutup rapat

8. Ext. yeast (4 : 671)

Nama resmi : Ekstrak ragi P

Nama lain : Sari ragi P

Pemerian : Serbuk, kuning kemerahan sampai coklat, bau

khas tidak busuk

Kelarutan : Larut dalam air, membentuk larutan kuning

sampai coklat, berisi asam lemah, tidak

mengandung karbohidrat


9. Pati terlarut (4 : 720)

Nama resmi : Pati larut P

Nama lain : Pati P

Pemerian : Serbuk hablur, putih

Kelarutan : Larut dalam air panas, membentuk larutan agak

keruh


II.3 Uraian Sampel

1. Tapak Liman (Elephantopus scaber) (6)

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Kelas : Angiospermae

Subkelas : Dicotyledoneae

Ordo : Asteridae

Famili : Asterales

Genus : Elephantopus

Spesies : Elephantopus scaber

II.4 Uraian Mikroba

II.4.1 Klasifikasi mikroba

1. Streptococcus mutans (7 : 168)

Kingdom : Protista

Filum : Scotobacteria

Kelas : Bacteria

Ordo : Eubacteriales

Famili : Lactobacillaceae

Genus : Streptococcus

Spesies : Streptococcus mutans

2. Escherichia coli (7 : 174)

Kingdom : Protista

Filum : Protophyta

Kelas : Schyzomycetes

Ordo : Eubacteriales

Famili : Eubacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

II.4.2 Morfologi mikroba

1. Streptococcus mutans (7 : 168)

Sel berbentuk batang, bersifat aerobik, bergerak dengan flagel,

spesies bersifat parasit, terbawa oleh partikel-partikel debu di

udara, mempunyai habitat pada tanah, air, dan lingkungan

akuatik.

2. Escherichia coli (7 : 174)

Batang lurus, 1,1 – 1,5 μm x 2,0 – 6,0 µm, motil dengan flagelum

peritritikus atau non motil, gram negatif. Tumbuh dengan mudah

pada medium nutrien sederhana. Laktosa difermentasi oleh

sebagian besar galur dengan produksi asam dan gas.

BAB III

METODE KERJA

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah autoklaf,

botol pengencer, cawan petri, enkas, erlenmeyer, handspray, jangka

sorong, jarum inokulum, LAF (Laminar Air Flow), lampu spiritus, lumpang

dan alu, paper disk, pinset, sendok tanduk, sentrifus, shaker, spoit, dan

tabung reaksi.

III.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah alcohol

70%, aluminium foil, aquadest, kapas, kertas label, kertas pembungkus,

korek api, medium NA (Nutrient Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), PDY

(Potato Dextrose Yeast), medium produksi, kloramfenikol 30 ppm, dan

sampel Tapak Liman (Elephantopus scaber).

III.2 Cara Kerja


a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan

b. Sampel Tapak Liman (Elephantopus scaber) dibersihkan dan

dipotong-potong kecil

c. Ditimbang sebanyak 10 gram

d. Direndam dalam alkohol selama 20 menit kemudian dibilas dengan

air steril

e. Dihaluskan dalam lumpang dengan alu

f. Dimasukkan ke dalam botol peengencer yang telah terisi 90 mL air

steril hingga diperoleh pengenceran 10-1

g. Diambil 1 mL dari pengenceran 10-1 dan dimasukkan ke dalam

botol pengencer yang telah terisi 9 mL air steril hingga diperoleh

pengenceran 10-2

h. Diulangi langkah sebelumnya untuk membuat pengenceran 10-3,

10-4, dan 10-5



b. Diambil masing-masing 1 mL dari pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5

kemudian diinokulasikan ke dalam cawan petri

c. Dimasukkan medium PDA (Potato Dextrose Agar) ke dalam

masing-masing cawan petri kemudian dihomogenkan

d. Dibungkus ketiga cawan petri tadi dan diinkubasikan selam 2-5 hari

pada suhu kamar

e. Diamati koloni yang tumbuh dan zona hambatnya

f. Dimasukkan medium PDA (Potato Dextrose Agar) dalam cawan

petri dan ditambahkan kloramfenikol 20 ppm kemudian

dihomogenkan dan dibiarkan memadat

g. Diinokulasikan 1 ose koloni terpilih yang memiliki zona hambat

dengan cara digores pada medium PDA (Potato Dextrose Agar)

yang telah memadat

h. Dibungkus dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar

i. Diamati koloni yang tumbuh secara terpisah dari koloni lainnya

j. Dibuat medium PDA (Potato Dextrose Agar) dalam tabung rekasi

dengan metode agar miring

k. Diinokulasikan 1 ose koloni yang terpisah ke dalam medium PDA

(Potato Dextrose Agar) miring yang telah disiapkan

l. Dibungkus dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar

m.Diamati pertumbuhan koloninya hingga diperoleh koloni murni



b. Disiapkan 25 mL medium PDY (Potato Dextrose Yeast)

c. Disuspensikan koloni murni yang diperoleh dengan ±2 mL larutan

NaCl fisiologis

d. Dimasukkan suspensi koloni ke dalam medium PDY (Potato

Dextrose Yeast)

e. Dibungkus dan diinkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar

sambil diaerasi pada shaker

f. Disiapkan 100 mL medium produksi

g. Dimasukkan seluruh medium PDY beserta koloninya ke dalam

medium produksi

h. Dibungkus dan diinkubasikan selama 7 hari pada suhu kamar

sambil diaerasi pada shaker

i. Diendapkan sel fungi dalam medium produksi selama 20 menit

dengan kecepatan 2500 rpm

j. Dipisahkan antara filtrat dengan residu

k. Diukur pH filtrat yang diperoleh



b. Dimasukkan 20 µL suspensi biakan Streptococcus mutans ke

dalam botol coklat

c. Dimasukkan medium NA (Nutrient Agar) secukupnya ke dalam

botol coklat kemudian dihomogenkan

d. Dituangkan ke dalam cawan petri lalu biarkan memadat

e. Diresapkan 20 µL filtrat, residu, dan kloramfenikol 30 ppm (sebagai

control) ke dalam paper disk

f. Dimasukkan masing-masing paper disk ke dalam cawan petri yang

telah terisi medium NA (Nutrient Agar) yang telah memadat dan

diatur posisinya sedemikian rupa

g. Dibungkus dan diinkubasikan secara terbalik selama 1x24 jam

pada suhu 370C

h. Diulangi seluruh langkah sebelumnya untuk biakan Escherichia coli

i. Diamati dan diukur zona hambat dari filtrat, residu, serta kontrol

kloramfenikol

BAB IV

HASIL PENGAMATAN

IV.1 Data Pengamatan

1. Pengujian daya hambat

No. BiakanDaya hambat (mm)

Kontrol Filtrat Residu

1 Streptococcus mutans 13,638,19 8,56

7,025 7,68

2 Escherichia coli 14,719,25 4,648,65 3,9

IV.2 Perhitungan

1. Kontrol (kloramfenikol 30 ppm)

a. Streptococcus mutans

1) 13 + (3,5 x 0,05) = 13,175 mm

2) 13 + (5,5 x 0,05) = 13,275 mm

3) 14 + (9 x 0,05) = 14,045 mm

4) Rata-rata : (13,175 + 13,275 + 14,45) ÷ 3 = 13,63 mm

b. Escherichia coli

1) 15 + (2 x 0,05) = 15,1 mm

2) 16 + (1 x 0,05) = 16,05 mm

3) 13 + (0 x 0,05) = 13 mm

4) Rata-rata : (15,1 + 16,05 + 13) ÷ 3 = 14,71 mm

2. Filtrat


1) Filtrat I

a) 7 + (5,5 x 0,05) = 7,275 mm

b) 9 + (6 x 0,05) = 9,3 mm

c) 8 + (0 x 0,05) = 8 mm

d) Rata-rata : (7,275 + 9,3 + 8) ÷ 3 = 8,19 mm

2) Filtrat II

a) 6 + (8 x 0,05) = 6,4 mm

b) 7 + (9,5 x 0,05) = 7,475 mm

c) 7 + (4 x 0,05) = 7,2 mm

d) Rata-rata : (6,4 + 7,475 + 7,2) ÷ 3 = 7,025 mm

b. Escherichia coli

1) Filtrat I

a) 8 + (0 x 0,05) = 8 mm

b) 9 + (5 x 0,05) = 9,25 mm

c) 10 + (1 x 0,05) = 10,5 mm

d) Rata-rata : (8 + 9,25 + 10,5) ÷ 3 = 9,25 mm

2) Filtrat II

a) 9 + (8 x 0,05) = 9,4 mm

b) 8 + (4 x 0,05) = 8,2 mm

c) 8 + ( 7 x 0,05) = 8,35 mm

d) Rata-rata : (9,4 + 8,2 + 8,35) ÷ 3 = 0,865 mm

3. Residu


1) Residu I

a) 8 + (2,5 x 0,05) = 8,125 mm

b) 10 + ( 7,5 x 0,05) = 10,375 mm

c) 7 + (3,5 x 0,05) = 7,175 mm

d) Rata-rata : (8,125 + 10,375 + 7,175) ÷ 3 = 8,56 mm

2) Residu II

a) 8 + (7 x 0,05) = 8,35 mm

b) 7 + (7,5 x 0,05) = 7,375 mm

c) 7 + (6,5 x 0,05) = 7,325 mm

d) Rata-rata : (8,35 + 7,375 + 7,325) ÷ 3 = 7,68 mm

b. Escherichia coli

1) Residu I

a) 5 + (2 x 0,05) = 5,1 mm

b) 4 + (7 x 0,05) = 4,35 mm

c) 4 + (9,5 x 0,05) = 4,475 mm

d) Rata-rata : (5,1 + 4,35 + 4,475) ÷ 3 = 4,64 mm

2) Residu II

a) 3 + (6 x 0,05) = 3,3 mm

b) 4 + (3 x 0,05) = 4,15 mm

c) 4 + (5 x 0,05) = 4,25 mm

d) Rata-rata : (3,3 + 4,15 + 4,25) ÷ 3 = 3,9 mm

IV.3 Gambar

LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFARMASI UNHAS

Ket : Isolasi sampel 10-3 (anaerob)Medium PDA






Ket : Metode agar miringMedium PDA


Ket : Peremajaan sampelMedium PDY


Ket : Peremajaan sampelMedium produksi


Ket : Pembenihan sampelFiltrat


Ket : Pembenihan sampelResidu


Ket : Uji aktivitas thd S. mutansMedium NA


Ket : Uji aktivitas thd E. coliMedium NA

BAB V

PEMBAHASAN

Mikroba endofit dapat didefinisikan sebagai mikroorganisme yang

hidup secara berkoloni pada jaringan internal tumbuhan tanpa

menyebabkan efek negatif bagi tumbuhan tersebut. Mikroorganisme

endofit dapat berupa bakteri ataupun jamur dan dinilai menjadi sumber

penting bagi zat berkhasiat. Banyak penelitian mengemukakan bahwa

mikroorganisme endofit dapat menghasilkan zat metabolit sekunder yang

sama dengan tumbuhan inangnya. Banyak peneliti percaya bahwa alasan

mengapa mikroorganisme endofit dapat menghasilkan zat yang sama

dengan tumbuhan inangnya adalah karena rekombinasi genetik yang

terjadi antara mikroorganisme endofit dengan tumbuhan inangnya dalam

waktu yang lama. (1:3)

Keuntungan besar dari fakta tersebut tentunya berefek pada

masalah ekonomi. Masalah penyediaan lahan, lamanya waktu menanam,

standardisasi bahan baku dapat teratasi. Sebagaimana mikroorganisme

lainnya, mikroorganisme endofit tidak memerlukan lahan yang luas untuk

dapat menghasilkan zat kimia yang sama dengan tumbuhan inangnya,

selain itu waktu panennya pun lebih cepat. Pertumbuhan mikroorganisme

endofit yang dikontrol di dalam laboratorium memudahkan

standardisasinya. Efek selanjutnya adalah pada turunnya harga produk

yang dihasilkan nantinya. Namun tentunya tidak semua mikroorganisme

endofit dapat menghasilkan zat metabolit sekunder yang sama dengan

inangnya. Oleh karena itu proses penelitian lebih lanjut pun tetap

diperlukan. (1:7)

Mikroorganisme endofit memiliki potensi yang besar untuk

digunakan sebagai sumber zat kimia bahan alam yang memiliki khasiat

farmakologis maupun mengobati penyakit-penyakit infeksius. Meskipun

jalan menuju pemanfaatannya secara optimal masih panjang namun

secercah cahaya harapan tersebut masih ada. (2:6)

Dalam percobaan yang dilakukan, dipergunakan sampel tanaman

Tapak Liman (Elephantopus scaber), dan akan diisolasi fungi yang

bersifat antimikroba. Dalam proses pengisolasian dan pengujian aktivitas

mikroba endofitnya, dilakukan dalam empat tahap, yaitu :




4. Uji aktivitas antimikroba

Pengambilan dan Pengolahan Sampel

Pada tahap ini , sampel tanaman Tapak Liman(Elephantopus

scaber) dibersihkan, dipotong-potong kecil, disterilkan, dan dibuat

pengencerannya dari pengenceran 10-1 sampai pengenceran 10-5.

Sampel di sterilisasi permukaan dengan Alkohol dan NaOCl dengan

tujuan memperoleh mikroba yang betul-betul mikroba endofit dan tidak

tercampur mikroba epifit yang berasal dari luar permukaan tumbuhan.

Alasan penambahan alkohol dan natrium hipoklorit (NaOCl):

1. Penambahan alkohol pertama berguna sebagai surfaktan untuk

melarutkan zat-zat yang bersifat hidrofobik pada permukaan daun

2. Penambahan natrium hipoklorit adalah sebagai sterilisasi

permukaannya

3. Penambahan alkohol kedua berguna untuk menghilangkan sisa

natrium hipoklorit dan untuk menghilangkan alkohol sisa dari untuk

menghilangkan natrium hipoklorit digunakan aquadest atau air

suling sehingga diperoleh biakan.

Isolasi dan Pemurnian Mikroba Endofit

Pada tahap ini, 1 mL dari 3 pengenceran terakhir dimasukkan

kedalam cawan petri. Dan ditambahkan medium PDA dan setelah

diinkubasi koloni terpilih yang memiliki zona hambat kembali

diinokulasikan pada medium PDA hingga diperoleh koloni yang terpisah

kemudian yang diinokulasikan kembali medium PDA miring untuk

diperoleh stok koloni murni.

Peremajaan dan Pembenihan

Pada tahap ini, koloni murni yang diperoleh diinokulasikan ke

medium PDY (Potato Dextrose Yeast). Hal ini bertujuan untuk

meremajakan mikroba yang diperoleh.setelah itu, koloni yang tumbuh

dalam medium PDY diinokulasikan ke dalam medium produksi kemudian

diaerasi pada shaker selama tujuh hari. Hal ini bertujuan untuk

membenihkan mikroba sehingga jumlah sel meningkat atau bertambah

banyak. Setelah diinkubasi, medium produksi tersebut diendapkan untuk

memisahkan antara filtrat ( hasil dari sentrifus yang berada di bagian atas

karena memiliki berat jenis yang ringan dibandingkan residu yang

merupakan sel mikroba dan filtrat ini merupakan hasil metabolit

sekundernya ) dan endapan/residu.

Tujuan diinokulasikan terlebih dahulu ke medium PDY kemudian

ke medium produksi adalah untuk meningkatkan jumlah mikroorganisme

yang didapat. Sementara tujuan dari medium PDY dan medium produksi

diinkubasi sambil dishaker adalah untuk membantu mengeluarkan

senyawa-senyawa yang kita butuhkan dari sampel dan untuk aerasi agar

diperoleh O2 pada medium. Dimana medium produksi mengandung

senyawa polimer rantai panjang, yang bertujuan untuk menghasilkan

eksoenzim dari dalam sel mikroorganisme sehingga akan menjadi

prekursor timbulya metabolit sekunder.

Sedangkan pengendapan dilakukan dengan tujuan untuk

memisahkan filtrat (metabolitnya) dan sel mikroba sebagi residunya dan

kemudiaan yang diambil adalah hasil filtratnya yang didalamnya

terkandung meetabolit-metabolit sekunder.

Pengujian Aktifitas Mikroba

Pada tahap ini, digunakan biakan Streptococcus mutans dan

Escherichia coli untuk pengujian aktifitas mikroba endofit yang diperoleh.

Biakan ini dipilih karena merupakan bakteri yang banyak digunakan dalam

pengujian daya antimikroba karena merupakan bakteri yang memiliki

ketahanan lebih tinggi terhadap bahan kimia yang berupa bahan

antimikroba dibandingkan dengan bakteri lainnya. Pada Medium NA yang

telah berisi biakan dimasukkan paper disk yang masing-masing telah

diresapkan dengan 20 µL endapan/residu. Kemudian setelah diinkubasi

selama 1 x 24 jam pada suhu 370C, diamati daya hambat mikroba endofit

terhadap biakan yang ditanam.

Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, ternyata diperoleh

isolat fungi endofit dari sampel tanaman tapak liman (Elephantopus

scaber) berbentuk bulat yang berwarna putih keabu-abuan dengan

permukaan yang melengkung dan hifa vegetatif yang bersepta dan

tersusun teratur. Dan setelah dilakukan uji aktivitas ternyata isolat tersebut

memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan dari

biakanStreptococcus mutans dan biakan Escherichia coli.

Medium produksi berfungsi untuk membenihkan sel-sel mikroba

yang sebelumnya telah diperbanyak pada medium PDY (Potato Dextrose

Yeast). Selanjutnya, metabolit-metabolit yang ada di dalam sel

mikroorganisme dikeluarkan ke dalam medium produksi yang dibantu

dengan adanya aerasi dengan pengocokan.

Pemaksimalan produksi metabolit-metabolit sekunder dapat

dilakukan dengan pengembangan dan perbaikan faktor-faktor yang

mempengaruhi proses fermentasi. Pada prinsipnya kondisi lingkungan

seperti pH, suhu, dan aerasi, kandungan nutrisi dalam medium juga

sangat mempengaruhi pola pertumbuhan dan proses fermentasi.

Salah satu cara peningkatan produksi metabolit adalah dengan

ultrasonifikasi, yaitu proses pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan

enzim di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih banyak. Proses

pemecahan sel ini dilakukan dengan cara keras, yaitu menggunakan alat

ultrasonikator dengan kuat getaran 16 rms selama 20 menit. Prinsip dari

alat ultrasonikator adalah menggunakan getaran ultrasonifikasi untuk

memecah sel. Selama proses ini, fungi hasil inkubasi harus diletakkan di

dalam beker gelas yang berisi air dingin, hal ini dilakukan untuk

menstabilkan suhu karena proses pemecahan sel dengan metode ini

dapat menghasilkan panas (kalor) sehingga dikhawatirkan akan merusak

enzim ekstraseluler yang dihasilkan.

Senyawa dari sampel daun tanaman Tapak Liman (Elephantopus

scaber) yang berkhasiat sebagai antibakteri dan antiradang adalah

sesquiterpenoid lactone, utamanya terhadap bakteri Staphylococcus

aureus.

BAB VI

PENUTUP

VI.1 Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa

terdapat satu isolat fungi endofit dari tanaman Tapak Liman

(Elephantopus scaber) yang berbentuk bulat yang berwarna putih keabu-

abuan dengan permukaan yang melengkung dan hifa vegetatif yang

bersepta. Isolat fungi tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri

Streptococcus mutans dan Escherichia coli.

VI.2 Saran

Diharapkan kepada asisten agar senantiasa mengawasi praktikan

saat melakukan percobaan.

DAFTAR PUSTAKA

1. Khairani, G. 2010. Isolasi dan Uji Kemampuan Bakteri Endofit

Penghasil Hormon IAA (Indole Acetic Acid) dari Akar Tanaman

Jagung (Zea mays). Medan: Universitas Sumatera Utara.

2. Prihatiningtias, W. dan Mae Sri Hartati W. 2010. Prospek Mikroba

Endofit sebagai Sumber Senyawa Bioaktif. Yogyakarta:

Universitas Gadjah Mada.

3. Haniah, M. 2008. Isolasi Jamur Endofit Dari

Daun Sirih (Piper betle L.) Sebagai Antimikroba Terhadap Escherichia

coli, Staphylococcus aureus, dan Candida albicans. Malang:

Universitas Islam Negeri Malang.

4. Dirjen POM. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta:

Departemen Kesehatan RI.

5. Dirjen POM. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta:

Departemen Kesehatan RI.

6. http://www.plantamor.com

7. Irianto, Koes. 2007. Mikrobiologi, Menguak Dunia Mikroorganisme.

Bandung: Yrama Widya.

LAMPIRAN

I. Komposisi Medium

1. PDA (Potato Dextrose Agar) 4. Medium produksi

Kentang 200 gram Glukosa 20 gram

Dekstrosa 10 gram Dekstrosa 1 gram

Agar 20 gram Pati terlarut 10 gram

Aquadest ad 1000 mL Tepung kedelai 25 gram

2. PDY (Potato Dextrose Yeast) NaCl 2 gram

Kentang 200 gram Extract yeast 1 gram

Dekstrosa 10 gram Aquadest ad 1000 mL

Extract yeast 4 gram

Aquadest ad 1000 mL

3. NA (Nutrient Agar)

Extract beef 3 gram

Pepton 5 gram

Agar 15 gram

Aquadest ad 1000 mL

Dibersihkan, dipotong-potong kecil Disterilkan

Dicelup dlm alkohol 70% selama 1’

Disterilkan

Dicelup dlm NaOCl selama 5’

Disterilkan


Disterilkan


Dihaluskan Ditimbang 10 gram

Dilarutkan dlm 90 mL air steril

Dibuat pengenceran 10-1-10-5

10-1 10-2 10-3 10-4 10-1

Diambil 1 mL dari masing-masing pengenceran

10 mLPDA

Diinkubasi selama 2-5 haripada suhu kamar

Amati koloni dan zona hambat

Diambil 1 ose koloni

10 mLPDA

Diinkubasi selama 3 haripada suhu kamar

Diambil 1 ose koloni terpisah

Agar miring PDA


Stock koloni murni

II. Skema Kerja



Stock koloni murniPDA

1 ose


25 mL PDY

1-2 ose

Diinkubasi selama 3 haripada suhu kamar (shaker)

Pipet 1 mL

100 mL med. produksi

Diinkubasi selama 7 haripada suhu kamar (shaker)

Sentrifuge

Filtrat Residu

Pipet 20 µL



laporan lengkap isolasi mo endofit

Documents