BAB I

PENDAHULUAN

Human Immunodeficiency virus (HIV) adalah lentivirus yang dapat menyebabkan

sindrom berkurangnya kekebalan tubuh atau disebut juga AIDS (acquired immunodeficiency

sindrom). Menurut data oleh UNAIDS bahwa setidaknya terdapat 34 juta orang (31,6 juta – 35,2

juta) hidup dengan HIV, bahkan 2,7 juta diantaranya (2,4 juta – 2,9 juta) terdiagnosa merupakan

pasien dengan inveksi baru, menurut data akhir tahun 2010.

Terapi antiretrovirus menjadi strategi utama untuk infeksi HIV. Keberhasilan juga telah

dicapai pada penanganan infeksi HIV, dan lebih dari dua-lusin obat antiretrovirus telah dapat

mencapai beberapa tahapan yang jelas pada siklus replikasi virus tersebut. Namun, toksisitas

obat, resistensi obat , interaksi obat yang merugikan, dan diiringi dengan ketaatan pasien yang

minim, masih menjadi faktor utama yang menyebabkan terjadinya kegagalan terapi. Oleh karena

itu, pencarian akan ide obat baru dengan mekanisme aksi baru, toksisitas rendah, aktivitas obat

yang tinggi, dan kemampuan toleransi obat yang baik masih menjadi isu menarik pada

penanganan HIV.

Tanaman obat memainkan peranan penting dalam mendukung penanganan kesehatan di

dunia. Menurut World Health Organization (WHO), 80% dari populasi pedesaan di Negara-

negara berkembang sebagian besar memanfaatkan tanaman obat lokal yang tersedia untuk

penanganan kesehatan primer yang mereka butuhkan. Akhir-akhir ini juga banyak variasi produk

alami yang berasal dari tanaman obat, seperti ribosom penginaktivasi protein, alkaloida,

flavonoid, lignin, polisakarida dan sebagainya, yang telah diketahui dapat menghambat enzim-

enzim dan protein unik yang krusial untuk siklus hidup HIV, termasuk penghambat enzim

integrase atau protease. Oleh karena itu pemilihan senyawa agen anti-HIV potensial dari

tanaman-tanaman obat mungkin akan menjadi cara yang cepat dan efektif untuk pencarian obat.

Cemara adalah pohon dari genus Pinus, dari family Pinaceae. Setidaknya terdapat sekitar

115 spesies pohon cemara, walaupun beberapa data menyebutkan diantara 105 sampai 125

spesies. Buah pohon cemara dari beberapa spesies cemara telah digunakan selama bertahun-

tahun dalam pengobatan bronchitis, batuk, asma dan banyak penyakit lain dalam pengobatan

tradisional masyarakat Cina. Peneliti menemukan bahwa ekstrak atau isolate pada buah pohon

1

cemara dari beberapa spesies Pinus, family Pinaceae diketahui memiliki efek antiviral,

antitumor dan aktivitas immunopotensial.

Aktivitas anti-HIV signifikan pada ekstrak atau isolat buah pohon cemara dari Pinus

nigra Arnold, Pinus parvifloria Sieb. et Zucc dan Pinus elliottii var. Elliottii menunjukan bahwa

buah pohon cemara merupakan agen terapeutik yang potensial dan ideal untuk penanganan

AIDS. Pinus yunnanensis masih termasuk dalam genus Pinus dan family pinaceae sebagian

besar tersebar dibagian barat daya Cina, akan tetapi masih belum ada artikel yang mencatat

apakah ekstrak buah pohon cemara dari Pinus yunnanensis memiliki aktivitas anti-HIV. Pada

pembahasan kita ini, aktivitas anti-HIV pada ekstrak buah pohon cemara (YNS-PY-F) dari Pinus

yunnanensis telah dievaluasi dan mekanismenya juga telah dieksplorasi.

2

BAB II

HASIL DAN PEMBAHASAN

2.1 Sitotoksisitas dan Aktivitas Anti-HIV

Kemanjuran obat dan keamanan obat diumpamakan bagaikan dua sisi yang berbeda dari koin

yang sama, jadi hal tersebut harus dievaluasi secara bersamaan. Dalam pembahasan kali ini

sitotoksisitas dan aktivitas anti-HIV in vitro telah terevaluasi secara bersamaan pula.

Sitotoksisitas pada sel C8166 dan sel MT-4 telah dievaluasi dengan uji MTT. Untuk

mengevaluasi aktivitas anti-HIV dari ekstrak buah pohon cemara (YNS-PY-F) dari Pinus

yunnanensis, pengujian efek sitopatik (syncytia assay), perhitungan produksi p24 dan uji MTT

digunakan dalam pembahasan kali ini.

Sitotoksisitas dan aktivitas anti-HIV pada YNS-PY-F telah di ringkas di Tabel 1. Uji

sitotoksisitas menunjukan bahwa YNS-PY-F memiliki sitotoksisitas yang rendah pada sel C8166

dan sel MT-4, dengan CC50s masing-masing; 438.73µg/mL dan 922.47µg/mL (Tabel 1, Gambar

1). Uji syncytia menunjukan bahwa YNS-PY-F berpotensi menghambat efek sitopatik yang

disebabkan oleh strain HIV yang berbeda, termasuk sumbangan laboratorium; strain HIV-1IIIB

dan HIV-1RF, HIV-1A17 resisten RT inhibitor nonnukleosida dan strain HIV-1AO18 resisten

inhibitor nukleosida, dan HIV-2ROD, dengan indeks selektifitas (SI) masing-masing; 457.01,

286.75, 498.56, 60.93 dan 71.11 (SI = CC50/EC50)

Tabel 1. Sitotoksisitas dan aktivitas anti-HIV dari YNS-PY-F. CC50 merupakan konsentrasi yang

dapat menghambat 50% dari keangsungan hidup sel. EC50 adalah konsentrasi efektif yang dapat

menghambat 50% dari produksi virus serta aktifitas enzymnya

Sampel Sel Strain HIV/enzyme Assay CC50 (µg/mL) EC50 (µg/mL) SI

YNS-PY-F C8166 HIV-1IIIB CPE 438.73 0.96 457.1

p24 3.98 110.23

HIV-1RF CPE 1.53 286.75

p24 9.48 46.28

HIV-1A17 CPE 0.88 498.56

p24 4.04 108.60

HIV-1AO18 CPE 7.20 60.93

3

p24 9.79 44.81

HIV-2ROD CPE 6.17 71.11

H9/HIV-1IIIB CPE 7.60 57.73

MT-4 HIV-1IIIB MTT 922.47 2.22 415.53

- RT ELISA - 4.60 -

AZT C8166 HIV-1IIIB CPE 1120.84 1.30 862,184.62

p24 1.94 577,752.58

HIV-1RF CPE 2.95 379,945.76

p24 6.48 172,969.14

HIV-1A17 CPE 4.22 265,601.90

p24 4.11 272,710.56

HIV-2ROD CPE 3.07 365,094.46

HIV-1IIIB MTT 358.50 0.85 421,764.71

NVP C8166 HIV-1AO18 CPE - 61.70 -

p24 - 42.14 -

T20 C8166 H9/HIV-1IIIB CPE - 14.96 -

PFA - RT ELISA - 1.03 -

Aktivitas inhibitor dari YNS-PY-F pada HIV kemudian ditegaskan dengan perhitungan

produksi antigen p24 dengan metode ELISA. Seperti pada uji syncytia, YNS-PY-F memiliki

aktivitas inhibitor yang poten terhadap produksi antigen p24 dari empat strain HIV-1dalam sel

C8166 dengan EC50s masing-masing 3.98µg/mL, 9.48µg/mL, 4.04µg/mL dan 9.79µg/mL (Tabel

1, Gambar 1).Yang mengesankan adalah bahwa YNS-PY-F dapat menghambat replikasi akut

dari strain HIV-1 tersebut secara in vitro. Aktivitas inhibitor pada HIV-1IIIB yang menyebabkan

sitolisis dalam sel MT-4 juga telah diuji dengan metode MTT, hasilnya menunjukan bahwa

YNS-PY-F berpotensi menghambat HIV-1IIIB yang menyebabkan sitolisis dalam sel MT-4

dengan nilai EC50 2.22µg/mL dan dengan SI 415.53, yang mana hasil tersebut lebih tinggi

dibandingkan dengan ekstrak buah cemara dari Pinus parviflora Sieb et Zucc. dan Pinus elliottii

var. Elliottii, dengan SI masing-masing 14 dan 18

4

Gambar 1. Sitotoksisitas dan aktivitas anti-HIV dari YNS-PY-F. Sitotoksisitas pada sel C8166

dan sel MT-4 telah diukur dengan uji MTT (A); aktivitas inhibitor pada HIV-1IIIB, HIV-1RF,

HIV-1A17, HIV-1AO18, dan HIV-2ROD dalam sel C8166 telah diukur dengan uji reduksi syncitia

(B); aktivitas inhibitor replikasi akut HIV-1IIIB, HIV-1RF, HIV-1A17 dan HIV-1AO18 pada sel C8166

diukur dengan penghitungan produksi antigen p24 (C); aktivitas inhibitor pada HIV-1IIIB yang

menyebabkan cytolysis pada sel MT-4 diukur dengan uji MTT (D). Data-data yang ditunjukan ini

adalah representative dari paling sedikit dua kali eksperimen

Hasil menunjukan bahwa ekstrak buah cemara dari Pinus yunanensis memiliki aktivitas

antiviral yang signifikan terhadap strain HIV yang berbeda dengan sedikit perbedaan EC50-nya.

Perbedaan EC50 munkin disebabkan oleh perbedan sensitifitas dari strain virus yang berbeda

terhadap ekstrak buah cemara. Yang menarik disini adalah nilai EC50 dari YNS-PY-F memiliki

aktivitas antiviral yang lebih poten terhadap HIV-1A17 daripada HIV-1AO18, meskipun kedua strain

virus tersebut keduanya merupakan strain resisten RT inhibitor. Ini mungkin dapat menjelaskan

perbedaan tempat mutasi mereka dalam domain RT virus, karena tempat mutasinya yang

5

berbeda menyebabkan sensitifitas yang berbeda pula terhadap obat, sehingga HIV-1A17 resisten

terhadap inhibitor RT nonnukleosida, sementara HIV-1AO18 resisten terhadap inhibitor RT

nukleosida.

2.2 Inhibisi pada fusi HIV-1dan Aktivitas Reverse Transkriptase

Mengingat bahwa YNS-PY-F memiliki aktivitas anti-HIV poten terhadap strain HIV yang

berbeda, dalam hal ini mekanisme anti-HIV nya akan lebih dijelaskan. Proses masuknya HIV,

termasuk proses attachment virus dan fusi membran yang dianggap sebagai target menarik untuk

intervensi kemoterapi, seperti misalnya, menghalangi masuknya virus menuju ke sel target yang

mengarah kepada penekanan infektivitas virus atau replikasi dan sitotoksisitas yang disebabkan

oleh kontak antara virus dan sel. Sampai saat ini, hanya terdapat dua obat penghambat masuknya

HIV yang dipasarkan; inhibitor fusi enfuvirtide dan antagonis CCR5 maraviroc. HIV-1 reverse

transkriptase dikenal untuk terapi infeksi HIV-1 dan AIDS karena tidak ada enzim manusia yang

setara dan esensial pada infeksi HIV-1 dan juga perkembangan penyakitnya. Meskipun lebih dari

sepuluh penghambat reverse transkriptase telah disetujui oleh US Food and Drug Administration,

pencarian generasi baru inhibitor RT HIV masih mendesak karena resistensi obat. Dalam dua

tahun terakhir, sebuah angka yang menarik, struktur yang beragam, senyawa berukuran kecil,

telah ditemukan dengan skrining virtual dan dapat berinteraksi dengan HIV-1 reverse

transkriptase.

Buah Cemara dari spesies Pinus yang lain, dikenal kaya akan lignin-karbohidrat

kompleks (LCCs) dan ekstrak utama dari buah cemara yang di ekstraksi dengan air panas adalah

LCC. LCCs menunjukan aktivitas anti-HIV yang lebih tinggi satu tingkat dari tannin dan

flavonoid, dan aktivitas anti-HIV yang dihasilkan oleh LCCs meliputi penghambatan absorbsi

HIV menuju ke penetrasinya ke dalam sel, dan penghambatan enzim reverse transkriptase dan

protease. Buah cemara dari Pinus yunnanensis juga memiliki lignin-karbohidrat kompleks yang

melimpah, dan komponen utama yang dihasilkan dari ekstraksi buah cemara dengan air panas

juga adalah lignin-karbohidrat kompleks (LCC). Oleh karena itu kami menginvestigasi apakah

YNS-PY-F, ekstrak dengan air panas dari Pinus yunnanensis dapat menghambat fusi virus antara

sel normal dan sel yang telah terinfeksi HIV-1, juga menghambat aktivitas rekombinan reverse

transkriptase HIV-1. Penghambat fusi envuvirtide (T20) digunakan sebagai kontrol pada

6

penetapan/uji fusi, sedangkan penghambat reverse transkriptase foscarnet sodium (PFA)

digunakan sebagai kontrol uji aktivitas reverse transkriptase .

Seperti yang kami harapkan, hasil uji fusi sel ke sel menunjukan YNS-PY-F berpotensi

menghabat fusi antara sel normal C8166 dan sel H9 yang kronis terinfeksi dengan sel HIV-1IIIB

dengan EC50 mulai 7.60 µg/ml (Tabel 1, Gambar 2 A), artinya YNS-PY-F dapat menghambat

masuknya HIV ke dalam sel. Penghambatan aktivitas rekombinan HIV-1 reverse transkriptase

juga dideteksi dengan metode ELISA menggunakan kit komersial (PFA). Hasil menunjukan

bahwa YNS-PY-F secara signifikan menghambat aktivitas reverse transkriptase HIV-1 dengan

EC50 4.60 µg/ml (Tabel 1, Gambar 2B), artinya YNS-PY-F dapat menjadi penghambat reverse

transkriptase yang potensial.

Gambar 2. Efek inhibitor YNS-PY-F pada fusi dari sel ke sel dan aktivitas RT. Aktivitas

inhibitor pada fusi sel C8166 yang tidak terinfeksi dan sel H9 yang kronis terinfeksi HIV-1 IIIB

diukur dengan uji syncytia (A); aktivitas inhibitor pada rekombinan reverse transkriptase HIV-1

yang diukur dengan metode ELISA (B). data yang ditunjukan mewakili setidaknya dua kali

percobaan independen.

Ekstrak ini (YNS-PY-F) menunjukan dua aktivitas yakni menghambat masuknya virus

sekaligus menghambat aktivitas reverse transkriptase. Akan tetapi tidak menunjukan bahwa ada

beberapa senyawa aktif lainnya yang dapat memungkinkan aktivitas tersebut, selain komponen

utama ekstrak tersebut yaitu lignin-karbohidrat kompleks, dan laporan sebelumnya menunjukan

bahwa mekanisme aksi anti-HIV dari LCC meliputi menghambat absorpsi dan penetrasinya ke

dalam sel dan menghambat aktivitas reverse transkriptase, dan hasilnya konsisten dengan laporan

sebelumnya.

7

Lignin-karbohidrat kompleks memiliki sifat farmakologis yang beragam, seperti

antitumor, anti-mikroba, antiparasit, antivirus, dan aktivitas potensiasi imun. LCC, sebagai

komponen utama pada ekstrak buah cemara, selain aktivitas anti-HIV, ekstrak mungkin memiliki

sifat farmakologi lainnya. Kegiatan anti-HIV nya yang manjur, dan tingkat toksisitasnya yang

rendah secara in vitro menunjukan bahwa ekstrak buah cemara dari Pinus yunnanensis mungkin

dapat menjadi obat pilihan alternatif untuk infeksi HIV, namun kegiatan anti-HIV secara in vivo

harus dievaluasi lebih lanjut

2.3 Efek pada Translokasi Integrase HIV-1 Menuju ke Nukleus

Kestabilan dalam infeksi HIV-1 membutuhkan perantara efisien yang menyebabkan

bersatunya genom retrovirus ke dalam DNA inang. Perantaraan yang efisien tersebut

dimediasikan oleh enzim integrase (IN) virus. IN memiliki sinyal lokalisasi nuklear (NLS) yang

banyak terletak pada residu 161 dan 173. Setelah transkripsi, IN berpindah menuju ke nukleus

sel inang dalam bentuk preintegrasi kompleks (PIC) yang stabil, yang mengandung genom

transkrip virus dan sejumlah virion serta protein seluler seperti MA, Vpr, dan LEDGF/p75.

Perjalanan PIC menuju ke nukleus diduga dimediasi oleh IN HIV-1, baik melalui jalur alpha

importin ataupun transportin 3 (TNPO3/transportin-SR2). Oleh karena itu, Translokasi IN HIV-1

menuju ke nukleus sel inang memainkan peran penting dalam siklus hidup dan replikasi HIV-1.

Inhibisi pada translokasi IN menuju nukleus akan menyebabkan kegagalan replikasi virus. D77,

salah satu devirat asam benzoate juga telah diketahui dapat menghambat translokasi IN ke

nukleus dengan mengganggu interaksi antara IN dengan LEDGF/p75.

Untuk mengetahui apakah YNS-PY-F memiliki efek penghambatan pada translokasi IN

HIV-1, digunakan metode berbasis skrining gambar pada, dan D77 digunakan sebagai kontrol

positif dalam uji ini. Namun hasilnya menunjukan bahwa YNS-PY-F tidak berpengaruh pada

translokasi integrase HIV-1 ke nukleus, bahkan pada 200 mg/ml, sama seperti kontrol negatif

( sel yang diperlakukan dengan tidak diberikan obat) (Gambar 3A). Pada sel HeLa yang

diperlakukan dengan YNS-PY-F 200 mg/ml , EGFP-IN kebanyakan terletak di nukleus sel

(Gambar 3C).sementara EGFP-IN kebanyakan terdapat pada sitoplasma sel dalam percobaan

dengan kontrol positif D77 pada 100 µg/ml (Gambar 3B).

8

Gambar 3. Efek dari YNS-PY-F pada perjalanan nuklear integrase HIV-1 dalam sel HeLa.(A)

Kontrol negatif : EGFP-IN kebanyakan terdistribusi di nukleus sel HeLa; (B) D77 100 µg/ml:

EGFP-IN kebanyakan terdistribusi di sitoplasma sel HeLa; (C) YNS-PY-F 200 µg/ml : EGFP-IN

kebanyakan terdistribusi di nukleus sel HeLa. Skala bar adalah 25 µm

2.4 Efek pada SDF-1α yang menyebabkan internalisasi CXCR4

Reseptor cemokin CXCR4 dan CCR5, terdapat pada Sel-T dan sel Makrofag, reseptor

cemokin tersebut merupakan dua ko-reseptor utama masuknya HIV ke dalam sel. Berbagai

upaya telah dilakukan untuk mengembangkan kelas baru agen anti-HIV yang menjadikan ko-

reseptor sebagai target terapi alternatif tambahan sesuai standar HAART. Saat ini ada terdapat

dua jenis inhibitor masuknya HIV: antagonis CCR5 dan inhibitor fusi HIV. Meskipun banyak

antagonis CXCR4 yang telah dipelajari, perkembangannya baru sampai tahap praklinis, dan

tidak dilanjutkan selama pengembangan. Makadari itu pencarian ide baru tentang inhibitor

masuknya HIV difokuskan pada antagonis CXCR4 dan penghambatan proses attachment-nya.

Mengetahui bahwa YNS-PY-F berpotensi menghambat fusi HIV pada sel C8166 yang tidak

terinfeksi dan sel H9 yang kronis terinfeksi HIV-1IIIB, dan sel line yang digunakan untuk uji

aktivitas anti-HIV adalah menggunakan sel-T, kami selanjutnya menyelidiki pengaruh CXCR4

menggunakan pengujian yang berbasis skrining fluoresens. SDF-1 dan CXCR4 diyakini

merupakan pasangan ligan-reseptor yang relatif ‘monogami’, karena itu kami mengunakan SDF-

1α untuk menyebabkan internalisasi CXCR4.

EGFP-CXCR4 diangkut ke sitoplasma pada sel 293T setelah diinkubasi dengan SDF-1α

yang merupakan ligan alami CXCR4 (Gambar 4A), senyawa kontrol positif AMD3100

signifikan memblokir SDF-1α yang menyebabkan internalisasi CXCR4, EGFP-CXCR4 masih

didistribusikan kebanyakan pada membrane sel 293T (Gambar 4B), sementara EGFP-CXCR4

terdistribusi kebanyakan di sitoplasma sel 293T yang diobati dengan YNS-PY-F 200 µg/ml

9

(gambar 4C). Hasilnya menunjukan bahwa YNS-PY-F tidak dapat menghambat SDF-1α yang

menyebabkan internalisasi CXCR4, dengan kata lain, YNS-PY-F tidak dapat digunakan sebagai

antagonis CXCR4.

Gambar 4. Efek dari YNS-PY-F pada SDF-1α yang menyebabkan internalisasi CXCR4. (A)

Kontrol negatif : EGFP-CXCR4 kebanyakan terdistribusi di sitoplasma sel 293T yang

diperlakukan dengan SDF-1α; (B) AMD3100 10 µm : EGFP-CXCR4 kebanyakan masih

terdistribusi di membrane sel 293T yang diperlakukan dengan SDF-1α dan AMD3100; (C) YNS-

PY-F 200 µg/ml : EGFP-CXCR4 kebanyakan terdistribusi di sitoplasma sel 293T yang

diperlakukan dengan SDF-1α dan YNS-PY-F. skala bar adalah 25 µm.

10

BAB III

METODE KERJA

3.1. Bahan Tanaman dan Prosedur Ekstraksi

Buah cemara kering dari Pinus yunnanensis dikumpulkan dari Yangbi County, Dali

Prefektur Profinsi Yunnan, China, pada bulan April 2009. Bahan tanaman diidentifikasi oleh

Xiao-Kuang Ma (Sekolah Farmasi Universitas Dali, Cina). Sebuah spesimen berlabel

BBP2010012PY di simpan di Sekolah Farmasi Universitas Dali. Buah kering dan bubuk kering

Pinus yunnanensis (10,0 kg) direndam dengan larutan etanol 95% ( 25L) selama 24 jam dalam

tiga tahap dan kemudian di saring. Residunya diekstraksi dengan air mendidih selama 2 jam

dalam tiga tahap dan kemudian di ekstraksi dengan NaOH 1% pada suhu kamar, dan akhirnya

disaring. Kemudian filtrat disesuaikan keasamannya dengan penambahan asam asetat, dan

kemudian disaring. Kemudian filtrat diendapkan dengan dengan etanol 1 banding 3, dan

kemudian di saring. Lalu filtrat diendapkan lagi dengan etanol yang lebih banyak dengan

perbandingan 1 banding 5, dan kemudian disaring lagi. Endapannya kemudian dicuci secara

berurutan dengan etanol anhidrat dan etil eter, kemudian di uapkan dibawah tekanan pada suhu

40o C, akhirnya 2,06 g ekstrak diperoleh dan dikodekan sebagai YNS-PY-F. Komponen hasil

utama dari ekstrak buah cemara dari Pinus yunnanensis dengan air panas adalah lignin-

karbohidrat kompleks (LCC). Struktur lignin-karbohidrat kompleks ditampilkan pada gambar 5.

3.2. Reagen dan Bahan Kimia

MTT, AZT (3’-azido-3’-deoxythymidine) dan AMD3100 dibeli dari Sigma. Horseradish

peroksidase (HRP) cap kambing, anti-IgG manusia dibeli dari Perusahaan Bioteknologi Dingguo

(Beijing, China). SDF-1α dibeli dari R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). p5F1 dan antibodi

monoklonal (McAb) terhadap p24 HIV-1 dibuat oleh laboratorium kami. Envufurtide (T20) dan

paketan uji reverse transkriptase yang dibeli dari Roche (Basel, Swiss). Nevirapine (NVP) dibeli

dari ChemPasific (Baltimore, MD, USA). Sedangkan D77 adalah sumbangan dari Shen Xu

(Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai,Cina)

11

Gambar 5. Struktur lignin-karbohidrat kompleks. Pada lignin-karbohidrat kompleks, karbohidratnya

merupakan bagian polisakarida.

3.3. Plasmid, Sel dan Virus

Plasmid pTRE2hyg-EGFP-C-IN dan sel 293T dengan CXCR4-GFP dipersembahkan oleh

David Chi Cheong (The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, Cina), sel-sel termasuk

sel C8166 dan sel MT-4 dipertahankan di Gibco lengkap RPMI-1640 (dengan 10% panas-

pelemahan dan penginaktifasian FBS). Sel HeLa dan sel 293T dipertahankan dalam DMEM

(dengan 10% panas- inaktifasi FBS). Virus laboratorium yang diturunkan dari strain HIV-1 IIIB

12

dan HIV-1RF, strain HIV-1A17 resisten RT inhibitor nonnukleosida dan strain HIV-1AO18 resisten

inhibitor nukleosida, dan HIV-2ROD yang diperoleh dari NIH AIDS Program Penelitian dan

Referensi Reagent (USA). 50% dosis infeksi kultur jaringan HIV (TCID50) ditentukan dengan

metode Reed dan Muench. Semua virus disimpan dalam aliquot kecil pada -70o C.

3.4. Uji Sitotoksisitas

MTT digunakan untuk menguji sitotoksisitas dari YNS-PY-F pada sel C8166 dan sel

MT-4. Singkatnya, sel-sel di tanam pada cawan sumuran-96 (mikropalet) (4x104 per sumur)

dengan tidak adanya variasi gradien konsentrasi YNS-PY-F dalam rangkap tiga, dan kemudian

diinkubasi selama 3 hari (C8166) atau 7 hari (MT-4) pada suhu 37oC dalam 5% CO2

dilembabkan di inkubator. Kemudian MTT (5 mg/ml dalam PBS) masing-masing ditambahkan

dengan seksama. Setelah inkubasi selama 4 jam, 100µl dari 50% DMF/ 20% SDS ditambahkan

dan kemudian cawan diinkubasi semalaman pada suhu 37oC. AZT digunakan sebagai kontrol

positif. Cawan di identifikasi dengan menggunakan Bio-Tek Elx 800 ELISA reader pada

595/630 µm. Konsentrasi sitotoksik 50% (CC50) kemudian dihitung.

3.5. Inhibisi YNS-PY-F pada HIV yang menyebabkan Efek Sitopatik

Efek Inhibisi YNS-PY-F pada HIV yang menyebabkan efek sitopatik diperiksa dengan

menghitung jumlah syncytia dibawah mikroskop terbalik. Singktnya, sel-sel C8166 (4x1044 per

sumur), yang terinfeksi virus HIV-1IIIB, HIV-1RF, HIV-1A17, HIV-1AO18 dan HIV-2ROD pada

multiplisitas infeksi (M.O.I = 0,15), ditanam di cawan sumuran-96. Volume akhir nya pada

setiap sumur mikropalet adalah 200µl, setelah 3 hari kultur, efek sitopatik (CPE) diukur dengan

menghitung jumlah syncytia. AZT digunakan sebagai kontrol positif. 50% konsentrasi efektif

(EC50) kemudian dihitung.

3.6. Efek pada Replikasi HIV Dalam Keadaan Infeksi Akut.

Efek Inhibisi YNS-PY-F pada HIV-1 dalam keadaan infeksi akut selanjutnya diperiksa

oleh kuantifikasi produksi p24 oleh ELISA seperti dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, sel-sel

C8166 yang terinfeksi HIV-1IIIB, HIV-1RF, HIV-1A17,dan HIV-1AO18 (M.O.I =0,15) didiamkan

pada suhu 37oC dalam 5% kadar CO2 dengan udara yang dilembabkan selama 2 jam untuk

13

memungkinkan absorbsi virus, sel-sel kemudian dicuci selama 3 kali dengan PBS 100µl yang

telah ditanam dengan 100 µl variasi gradient konsentrasi YNS-PY-F dan diinkubasi pada 37oC,

dalam 5% kadar CO2 yang dilembabkan dalam inkubator selama 4 hari. Kemudian, 90 µl

supertanants dikumpulkan masing-masing dan dicampur dengan 10 µl dari Tirton X-100 5%.

Ekspresi p24 HIV-1 diuji dengan uji ELISA. AZT digunakan sebagai kontrol positif.

3.7. Efek pada HIV-1IIIB yang Menyebabkan Sitolisis pada Sel MT-4

Efek Inhibisi pada HIV-1 yang menyebabkan lisis pada sel MT-4 telah dijelaskan

sebelumnya. Singkatnya, sel MT-4 yang terinfeksi atau tidak terinfeksi HIV-1IIIB (M.O.I = 0.15)

yang telah ditanam dengan 100 µl variasi gradient konsentrasi YNS-PY-F dan diinkubasi selama

7 hari pada suhu 37oC, dalam 5% kadar CO2 yang dilembabkan dalam inkubator. Viabilitas sel

dinilai dengan MTT seperti telah dijelaskan diatas. AZT digunakan sebagai control positif.

3.8. Efek pada Fusi sel ke sel

Fusi sel ke sel antara sel C8166 dan sel H9 yang terinfeksi kronis dengan HIV-1 IIIB telah

dihitung dibawah mikroskop seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, sel-sel

C8166 (3x104) di ko-kultur-kan dengan sel H-9 yang kronis terinfeksi dengan HIV-1IIIB (1x104)

pada ada atau tidaknya YNS-PY-F dengan variasi gradient konsentrasi. Setelah diinkubasi pada

suhu 37oC dalam 5% CO2 pada udara lembab diinkubasi selama 6 jam, jumlah syncytia dihitung

dibawah mikroskop. Enfuvirtide (T20) digunakan sebagai control positif.

3.9. Efek pada HIV-1 Rekombinan Aktivitas Reverse Transkriptase (RT)

Aktifitas reverse transkriptase (RT) pada HIV-1 diukur dengan kit ELISA RT

menggunakan paket komersial yang tersedia (Roche) sesuai dengan instruksi atau cara

pemakaian dari pabriknya. Singkatnya larutan HIV-RT rekombinan, YNS-PY-F diencerkan

dalam buffer lisis dan campuran reaksi yang berurutan ditambahkan masing-masing dalam

modul lempeng, kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37oC kemudian larutan anti-DIG-

POD ditambahkan, diikuti oleh substrat ABTS. Foskarnet sodium (PFA) digunakan sebagai

kontrol positif. Absorbansi pada 405 nm/ 490 nm (A405/490) diukur menggunakan alat pembaca

mikropalet (ELISA, Bio-Tek ELx 800, Winooski, VT, USA). Intensitas sinyal yang dihasilan

berbanding lurus dengan aktivitas RT.

14

3.10. Efek pada Translokasi Integrase (IN) HIV-1 Menuju Nukleus

Sel HeLa di kultur dan dipelihara dalam media Dulbecco’s modified Eagle (DMEM)

ditambahkan dengan serum janin sapi (FBS) 10%, 100 mg/ml G418. 100 U/ml streptomycin-

penicilin (invitrogen) pada suhu 37oC dalam inkubator dengan kadar CO2 5%. Duapuluh empat

jam sebelum transfeksi, sel-sel HeLa ditanam di cawan dengan media DMEM yang mengandung

FBS 10%. Vector ekspresi EGFP-C-IN ditransfeksikan ke sel HeLa menggunakan reagen

Lipofectamine 2000 (invitrogen, Carlsbad, NM, USA) sesuai dengan instruksi cara pemakaian

dari pabriknya. Medianya telah dihapus 5 jam setelah transfeksi. Media segar yang mengandung

ekstrak buah cemara ditambahkan pada konsentrasi akhir 200 µg/ml, 24 jam setelah transfeksi,

sel difiksasi dengan paraformaldehide 4% dalam PBS pada suhu kamar selama 15 menit.

Pengambilan gambarnya dilakukan dengan mikroskop Leica DMI4000. D77 digunakan sebagai

kontrol positif.

3.11. Efek pada SDF-1α yang Menyebabkan internalisasi CXCR4

Sel 293T yang merupakan sel line yang stabil mengekspresikan CXCR4-GFP yang talah

dikultur dan dipelihara di dalam DMEM ditambahkan dengan FBS 10%, 2mM HEPES dan

streptomycin-penicilin 1%. Sel yang tumbuh secara eksponansial ditanam dalam cawan dan

kemudian dikultur selama 24 jam. Kemudian media kultur dihapus, dan media kultur segar yang

mengandung ekstrak buah cemara di tambahkan pada konsentrasi akhir 200 µg/ml. Ekstrak buah

cemara tersebut diinkubasi dengan sel selama 20 menit, kemudian SDF-1α yang merupakan

ligan alami CXCR4 ditambahkan pada konsentrasi akhir 10 nM, dan diinkubasi selama 40 menit.

Penggambaran fluorosens dilakukan untuk memonitor ekspresi CXCR4-GFP dan

internalisasinya. Gambarnya diambil menggunakan mikroskop fluoresens Leica DMI4000.

AMD31000 digunakan sebagai kontrol positif.

15

BAB IV

PENUTUP

4.1. Kesimpulan

Untuk pengetahuan kita, data kami menunjukan untuk pertamakalinya bahwa ekstrak

buah cemara dari Pinus yunnanensis memiliki aktivitas inhibitor ampuh terhadap strain virus

HIV-1IIIB dan HIV-1RF, strain HIV-1A17 resisten inhibitor RT nonnukleosida dan strain HIV-1AO18

resisten inhibitor nukleosida dan HIV-2ROD, dan mekanisme anti-HIV termasuk menghambat

masuknya HIV dan menghambat reverse transkriptasenya. Aktivitas anti-HIV yang poten dan

sitotoksisitasnya yang rendah secara in vitro mengindikasikan bahwa ekstrak buah cemara dari

Pinus yunnanensis berpotensi untuk menjadi pengobatan alternatif pada infeksi HIV, namun,

aktivitas anti-HIV dan toksisitasnya secara in vivo kedepannya harus dievaluasi.

4.2. Saran

Dasar teori dan protokol-protokol mengenai metode pengujian dalam penyusunan tulisan

ini tidak dijelaskan secara terperinci sehingga penting untuk mengetahuinya secara lebih

mendalam dari literatur-literatur yang ada.

16

UCAPAN TERIMAKASIH

Penelitian ini didukung sebagian dan difasilitasi oleh Program Saintifik dan Teknologi Cina

(2009ZX09501-029; 2012ZX10001-006; 2012ZX10001-007), program 973 (2009CB522306),

dan National Natural Science Foundation China (No.30860365; No.81102483).

17

DAFTAR REFERENSI

1. Adamson, C.S.; Freed, E.O. Novel approaches to inhibiting HIV-1 replication. Antiviral Res. 2010, 85, 119–141.

2. Cos, P.; Maes, L.; Vanden Berghe, D.; Hermans, N.; Pieters, L.; Vlietinck, A. Plant substances as anti-HIV agents selected according to their putative mechanism of action. J. Nat. Prod. 2004, 67, 284–293.

3. de Clercq, E. Current lead natural products for the chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Med. Res. Rev. 2000, 20, 323 349.

4. Zhang, X.; Huang, N.; Zheng, Y.T. Advances in the study of anti-HIV natural compounds derived from traditional Chinese medicines (in Chinese). Acta Pharm. Sin. 2010, 45, 141–153.

5. Sakagami, H.; Kawazoe, Y.; Komatsu, N.; Simpson, A.; Nonoyama, M.; Konno, K.; Yoshida, T.; Kuroiwa, Y.; Tanuma, S. Antitumor, antiviral and immunopotentiating activities of pine cone extracts: Potential medicinal efficacy of natural and synthetic lignin-related materials (review). Anticancer Res. 1991, 11, 881–888.

6. Lai, P.K.; Donovan, J.; Takayama, H.; Sakagami, H.; Tanaka, A.; Konno, K.; Nonoyama, M. Modification of human immunodeficiency viral replication by pine cone extracts. AIDS Res.Hum. Retr oviruses 1990, 6, 205–217.

7. Tamura, Y.; Lai, P.K.; Bradley, W.G.; Konno, K.; Tanaka, A.; Nonoyama, M. A soluble factorinduced by an extract from Pinus parviflora Sieb etZucc can inhibit the replication of H uman-immunodeficiency-virus in vitro. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 1991, 88, 2249–2253.

8. Ebe rhardt, T.L.; Young, R.A. Assessment of the antiHIV activity of a pine cone isolate. Planta Med. 1996, 62, 63–65.

9. Satoh, K.; Kihara, T.;Ida,Y.; Sakag ami, H.; Koyama, N.; Premanathan, M.; Arakaki, R.; Nakas hima, H.; Komatsu, N.; Fujimaki, M.; et al. Radical modulation activity of pine cone extracts of Pinus elliottii var. Elliottii. Anticancer Res. 1999, 19, 357–364. Molecules 2012, 17 6928

10. Li, N.; Fu, L.K. Notes on gymnosperms. 1. Taxonomic treatments of some Chinese conifers. Novon 1997, 7, 261–264.

11. Young, R.C.; Friedman, M.A.; Schilsky, R.L.; Sigal, E.V. Drug safety and drug efficacy: Two sides of the same coin. Clin. Cancer Res. 2007, 13, 2533–2534.

12. Este, J.A. Virus entry as a target for anti-HIV intervention. Curr. Med. Chem. 2003, 10, 1617–1632.

13. Garcia-Sosa, A.T.; Sild, S.; Takkis, K.; Maran, U. Combined approach using ligand efficiency, cross-docking, and antitarget hits for wild-type and drug-resistant Y181C HIV-1 reverse transcriptase. J. Chem. Inf. Model. 2011, 51, 2595–2611.

14. Cichero, E.; Fossa, P. Docking-based 3D-QSAR analyses of pyrazole derivatives as HIV-1 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. J. Mol. Model. 2012, 18, 1573–1582.

15. Mao, Y.; Li, Y.; Hao, M.; Zhang, S.; Ai, C. Docking, molecular dynamics and quantitative structure-activity relationshipstudies for HEPTs and DABOs as HIV-1 reverse transcriptaseinhibitors. J . Mol. Model. 2012, 18, 2185–2198.

16. Sakagami, H.; Kushida, T.; Oizumi, T.; Nakashima, H.; Makino, T. Distribution of lignin-carbohydrate complex in plant kingdom and its functionality as alternative medicine. Pharmacol. Ther. 2010, 128, 91–105.

18

17. Zhou, P.; Lin, F.; Liu, J.; Lv, Y.J.; Li, H.Z.; Liu, G.M. Determination of carbohydrate content in lignin-carbohydrate complex from pine cone of Pinus yunnanensis Franch (in Chinese). Lishizhen Med. Mater Med. Res. 2011, 22, 1820–1821.

18. Lesbats, P.; Botbol, Y.; Chevereau, G.; Vaillant, C.; Calmels, C.; Arneodo, A.; Andreola, M.L.; Lavigne, M.; Parissi, V. Functional coupling between HIV-1 Integrase and the SWI/SNF Chromatin remodeling complex for efficient in vitro integration into stable nucleosomes. PLoS Pathog. 2011, 7, e1001280.

19. Esposito, D.; Craigie, R. HIV integrase structure and function. Adv. Virus Res. 1999, 52, 319–333.

20. van Maele, B.; Debyser, Z. HIV-1 integrated: An interplay between HIV-1 integrase, cellular and cellular and viral. AIDS Rev. 2005, 7, 26–43.

21. Maertens, G.; Cherepanov, P.; Pluymers, W.; Busschots, K.; de Clercq, E.; Debyser, Z.; Engelborghs, Y. LEDGF/p75 is essential for nuclear and chromosomal targeting of HIV-1 integrase in human cells. J. Biol. Chem. 2003, 278, 33528–33539.

22. Levin, A.; Hayouka, Z.; Friedler, A.; Loyter, A. Transportin 3 and importin alpha are required for effective nuclear import of HIV-1 integrase in virus-infected cells. Nucleus 2010, 1, 422–431.

23. Levin, A.; Armon-Omer, A.; Rosenbluh, J.; Melamed-Book, N.; Graessmann, A.; Waigmann, E.; Loyter, A. Inhibition of HIV-1 integrase nuclear import and replication by a peptide bearing integrase putative nuclear localization signal. Retrovirology 2009, 6, 112.

24. Du, L.; Chen, J.; Yang, L.M.; Zheng, Y.T.; Tang, Y.; Shen, X.; Jiang, H.L. D77, one benzoic acid derivative, functions as a novel anti-HIV-1 inhibitor targeting the interaction between integrase and cellular LEDGF/p75. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 375, 139–144.

25. Murakami, T.; Yamamoto, N. Role of CXCR4 in HIV infection and its potential as a therapeutic target. Future Microbiol. 2010, 5, 1025–1039. Molecules 2012, 17 6929

26. Dong, C.Z.; Tian, S.; Madani, N.; Choi, W.T.; Kumar, S.; Liu, D.; Sodroski, J.G.; Huang, Z.; An, J. Role of CXCR4 internalization in the anti-HIV activity of stromal cell-derived factor-1alpha probed by a novel synthetically and modularly modified-chemokine analog. Exp. Biol. Med. (Maywood) 2011, 236, 1413–1419.

27. Liu, G.J.; Wang, J.P.; Xiao, J.C.; Zhao, Z.W.; Zheng, Y.T. Preparation and characterization of three monoclonal antibodies against HIV-1 p24 capsid protein. Cell. Mol. Immunol. 2007, 4, 203–208.

28. Wang, R.R.; Gu, Q.O.; Yang, L.M.; Chen, J.J.; Li, S.Y.; Zheng, Y.T. Anti-HIV-1 activities of extracts from the medicinal plant Rhus chinensis. J. Ethnopharmacol. 2006, 105, 269–273.

29. Wang, R.R.; Gu, Q.; Wang, Y.H.; Zhang, X.M.; Yang, L.M.; Zhou, J.; Chen, J.J.; Zheng, Y.T. Anti-HIV-1 activities of compounds isolated from the medicinal plant Rhus chinensis.J. Ethnopharmacol. 2008, 117, 249–256.

30. Zhang, X.J.; Yang, G.Y.; Wang, R.R.; Pu, J.X.;Sun, H.D.; Xiao, W.L.; Zheng, Y.T. 7,8-Secolignans from Schisandra wilsoniana and Their anti-HIV 1 activities. Chem. Biodivers. 2010, 7, 2692–2701.

31. Xiao, W.L.; Wang, R.R.; Zhao, W.; Tian, R.R.; Shang, S.Z.; Yang, L.M.; Yang, J.H.; Pu, J.X.; Zheng, Y.T.; Sun, H.D. Anti-HIV-1 activity of lignans from the fruits of Schisandra rubriflora. Arch. Pharm. Res. 2010, 33, 697–701.

32. Wang, Y.H.; Tang, J.G.; Wang, R.R.; Yang, L.M.; Dong, Z.J.; Du, L.; Shen, X.; Liu, J.K.; Zheng, Y.T. Flazinamide, a novel beta-carboline compound with anti-HIV actions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, 355, 1091–1095.

19

33. Wang, Q.; Ding, Z.H.; Liu, J.K.; Zheng, Y.T. Xanthohumol, a novel anti-HIV-1 agent purified from Hops Humulus lupulus. AntiviralRes.2004, 64, 189–194.

20