pembahasan isolasi dan inokulasi

8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi

1/14

Inokulasi (penanaman bakteri) merupakan pekerjaan memindahkan bakteri

dari medium yang lama ke medium yang baru minta banyak ketelitian. Untuk

itu terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang ada sangkut-

paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril, ini untuk

menghindari kontaminasi yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak kitainginkan (Dwidjaseputro, 1998).

Untuk meumbuhkan suatu biakan bakteri dalam media steril sejumlah sel-sel

(inokulum) dipindahkan (diinokulasi) kedalam media dengan perlakuan

khusus untuk mempertahankan kemurnian dari biakan. Pada waktu inokulasi,

jarum yang digunakan untuk memindahkan mikroba harus dipijarkan diatas

api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini

menghancurkan setiap bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum

atau alat pemindah (Sutedjo, 1997).

Prinsip dari isolasi mikrobaadalah memisahkan satu jenis mikroba dengan

mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini

dapa dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, karena dalam

media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap

pada tempatnya. Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan

secara individu karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal ditempatnya

(Sutedjo, 1997).

Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan,

dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat, benang, serupa

akar, serupa kumparan. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring berkisar

bentuk dan tepi koloni dan sifat itu dinyatakan dengan pedang, seperti duri,serupa tasbih, serupa titik, serupa batang, dan serupa akar (Volk W.A.F

Wheeter., 1998).

Pengertian dan Tujuan Pengenceran

Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke

dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu

untuk mengurangi kepadatan kepadatan bakteri yang ditanam (Fais, 2009).

Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau

memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam

larutan sehingga volume larutan menjadi berubah (Nurohaianah et al, 2007).

Macam Metode Penanaman beserta Kelebihan dan Kekurangannya

Menurut Fais (2009), metode penanaman ada dua yaitu :

Dari deskripsi yang singkat ini mengenai ciri ciri nutrisi bakteri haruslah

dikenal dua langkah penting bagi intensitasnya. Di laboratorium (1) inokulasi

penanaman penting bagi suatu medium dengan kandungan nutrisi yang

sesuai (2) inkubasi medium yang sudah diinokulasi pada keadaan fisik

(Waluyo, 2005).

Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya

kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber

bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai


2/14

contoh fage koli yang dijumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari

limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi

bahan sumbernya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel

bakterinya (Adams, 2000).

Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari

suatubiakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah

metode cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip

pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan

anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat

diamati (Afrianto, 2004).

Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain

digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural

morfologi, fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu

spesies (Dwidjoseputro, 2005).

Metode cawan tuang

Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran

mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar

yang telah dicairkan dan didinginkan ( 50 oC ) yang kemudian dicawankan.

Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umunya tidak

diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap

sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung

koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode inimemboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang

tinggi.

Metode cawan gores memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan

waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan

yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan

gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan

terisolasinya mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan

yang umum sekali dilakukan oleh para mahasiswa yang baru mulai

mempelajari mikrobiologi ialah tidak memanfaatkan permukaan medium

dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme

menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu

banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan (Ratna,

1990).

Menurut Dwidjoseputro (1980), sifat-sifat koloni yang tumbuh pada

agar-agar lempengan, pada agar-agar miring dan pada tusukan gelatin

adalah sebagai berikut :

1. Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk,

permukaan dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat

berbenang, tak teratur, serupa akar, serum kumparan. Permukaan kolonidapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul


3/14

membukit dan timbul berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang

berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang bergerigi, ada yang

berbenang-benang dan ada yang keriting.

2. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat ini berkisar pada bentuk dan

tepi koloni dan sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : serupa pedang,serupa duri, serupa tasbih, serupa titik-titik, serupa batang dan serupa akar.

3. Sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat mengencerkan

gelatin. Karena itu, maka bentuk-bentuk koloninya juga berbeda-beda.

Lagipula bentuk koloni yang tidak dapat mengencerkan gelatin. Bila dilihat

dari samping koloni yang tidak mengencerkan gelatin dapat serupa pedang,

tasbih, bertonjol-tonjol dan berjonjot. Jika bakteri mampu mengencerkan

gelatin, maka bentuk koloninya dapat serupa kawah, serupa mangkuk, serupa

corong, pundi-pundi dan berlapis.

Setelah mikroba ditumbuhkan pada media agar tabung maupun cawan dan

estelah inkubasi akan terlihat pertumbuhan bakteri dengan berbagai macam

bentuk, ukuran, sifat, dan berbagai ciri khas yang lain. Ciri-ciri ini akan

mengarahkan ke sifat-sifat mikroba tersebut pada media pertumbuhan,

sehingga pengamatan morfologi ini sangat penting untuk diperhatikan

(Ratna,1990).

Bakteri yang memiliki flagella sering kali membentuk koloni yang menyebar

terutama jika menggunakan lempengan agar basah, untuk mencegah

menyebarnya koloni maka harus digunakan agar benar-benar kering (Djida,

N., 2000).

Inokulasi adalah menanam inokula secara aseptic kedalam media steril baik

pada media padat maupun media cair. Inokula merupakan bahan yang

mengandung mikroba atau biakan mikroba baik dalam keadaan cair maupun

padat. Teknik aseptis sangat diperlukan untuk memindahkan biakan dari

suatu tempat ke tempat lainnya. Dengan teknik aseptis berusaha mencegah

terjadinya kontaminasi dengan biakan yang mungkin bersifat pathogen. Untuk

menunjang pekerjaan secara aseptis perlu dipahami mengenai teknik kerja

aseptis, teknik dekontaminasi, serta penyelesaian pekerjaan secara cepat

dan efisien, (Wesley A Volk, 1998)

Untuk mendapatkan koloni bakteri sebagai sumberbiakan ada dua tehnik

yang dapat dipakai yaitu metode piringan goresan dan metode piringan

Tuangan. Pirngan tenmpat bahan yang mengandung bakteri disebarkan

terdiri atas zat makanan seperti kaldu sapi yang telah dipadatkan dengan

menambah agar-agar berasal dari gangang laut yang larut dalam air mendidih

dan menjadi padat jika di padatkan, (Wesley A Volk, 1998)

1. Perhitungan Bakteri

Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji

kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga(uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap.


4/14

Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor

penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan

menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak

langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup

akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagijumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang

dilakukan pada percobaan ini (Penn, 1991).

2. Metode Standar atau viable plate count

perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah

mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count).

Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan

petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan

jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara

kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991).

1. Berdasarkan kekeruhannya, Mikroba dalam suatu bahan cair dapat

dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan sel bakteri didalam suatu

medium cair akan meningkatkan kekeruhan media, yang akan mempengaruhi

jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium(Rukmi, MG.I.,

A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008).

2. Berdasarkan jumlah lempeng total (plate count).

Berdasarkan lempeng total, Cara ini adalah cara yang paling umum

digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan

jumlah koloni yang tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampelsecara seri, dengan kelipatan 1 : 10. Masing-masing suspensi pengenceran

ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri

akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24

jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat

digunakan alat colony counter yang biasanya dilengkapi dengan pencatat

elektronik. (Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008).

3. Metode analisa spektrofotometer

Beer dan lambert menemukan hukum yang menerangkan interaksi bahan

kimia dengan gelombang cahaya (elektromagnetik), yang disimpulkan dalam

hukum Beer-Lambert menyebabkan berkembangnya analisis kimia dengan

menggunakan alat instrumentasi yakni spektrofotometer (P Tipler 1991).

Suatu spektrofotometer standar terdiri atas spektrofotometer untuk

menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi yaitu bersifat

monokromatik serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk mengukur

intensitas berkas monokromati, penggabungan bersama dinamakan

sespektrofotometer. Penggabungan alat optik ini merupakan elektronika sifat

kimia dan fisiknya dan detektor yang digunakan secara langsung mengukur

intensitas dari cahaya yang dipancarkan (It) dan secara tidak lansung cahaya


5/14

yang diabsorbsi (Ia). Kemampuan ini bergantung pada spektrum

elektromagnetik yang diabsorb (serap) oleh benda.

Fungsi alat spektrofotometer dalam laboratorium adalah mengukur

transmitans atau absorbans suatu contoh yang dinyatakan dalam fungsi

panjang gelombang.Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun

campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk

akan dipantulkan, sebagian di serap dalam medium itu, dan sisanya

diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam

nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Studi

spektrofotometri dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual yang

lebih mendalam dari absorbsi energi. Hukum Beer menyatakan absorbansi

cahaya berbanding lurus dengan dengankonsentrasi dan ketebalan

bahan/medium.

Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :

a. Sumber Cahaya

Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran

radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa

untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah

lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini

mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah

35020 nanometer (nm).

b. Monokromator Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk

menguraikan cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjanggelombang tertentu

(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).

c. Cuvet

Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat

contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars,

plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1

cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa

atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca

mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk

pengukuran di daerah sinar tampak (visible).

d. Detektor

Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya

pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi

sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam

bentuk jarum penunjuk atau angka digital.

Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk

menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.

Spektrofotometer akan mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan

membandingkan ke intensitas cahaya sebelum melewati sampel (Io). Rasio


6/14

disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase (% T)

sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T

Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu spektrofotometer single-beam

dan spektrofotometer double-beam. Perbedaan kedua jenis spektrofotometer

tersebut hanya pada pemberian cahaya, dimana pada single-beam, cahayahanya melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai

absorbansi dari larutan yang dimasukan. Berbeda dengan single-beam, pada

spektrofotometer double-beam, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan

dengan larutan yang diinginkan dalam satu kali proses yang sama. Prinsipnya

adalah dengan adanya chopper yang akan membagi sinar menjadi dua,

dimana salah satu melewati blanko (disebut juga reference beam) dan yang

lainnya melewati larutan (disebut juga sample beam). Dari kedua jenis

spektrofotometer tersebut, spektrofotometer double-beam memiliki

keunggulan lebih dibanding single-beam, karena nilai absorbansi larutannya

telah mengalami pengurangan terhadap nilai absorbansi blanko. Selain itu,

pada single-beam, ditemukan juga beberapa kelemahan seperti perubahan

intensitas cahaya akibat fluktuasi voltase (anonim, 2011).

4. Pengenceran bakteri

Dalam perhitungan jumlah mikroorganisme ini seringkali digunakan

pengenceran. Di dalam laboratorium, pengenceran di lakukan dengan botol

pengenceran seperti lazimnya pada SPC, namun dapat pula menggunakan

tabung reaksi. Pada pengenceran dengan menggunakan botol cairan terlebihdahulu dikocok dengan baik sehingga kelompok sel dapat terpisah.

Pengenceran sel dapat membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah

mikroorganisme yang benar. Namun pengenceran yang terlalu tinggi akan

menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang umumnya relatif

rendah (Hadioetomo, !996).

Pada metode perhitungan cawan dilakukan pengenceran yang bertingkat

yang mana ditujukan untuk membentuk konsentrasi dari suatu suspensi

bakteri. Sampel yang telah di encerkan ini di hitung ke dalam cawan baru

kemudian di tuang ke mediumnya (metode tuang). Kemudian setelah

diinkubasi selama 24- 48 jam, amati koloni yang tumbuh dan koloni yanng

diamati hanyalah koloni yang berjumlah 30- 300 koloni (Gobel, 2008).

Tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi

bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada

pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak

menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan pada

pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil

uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi

bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkansampai diperoleh tingkat pengenceran yang lebih tinggi sehingga nilai


7/14

maksimum dapat dihitung. Metoda pengenceran yang paling mudah dengan

melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 tabung

pengenceran sekali gus ( Fridaz, Srikandi, 1992 ). Beberapa cara

penghitungan jumlah mikrobia yaitu cara penghitungan pada lempeng

pembiakan, cara menghitung langsung (metode kaca objek), metode ukurkekeruhan, metode turbidimetri dan nefelometri serta dengan jumlah

perkiraan terdekat (JPT). Cara penghitungan pada lempeng pembiaakan

disebut juga metode penghitungan bakteri hidup atau metode penghitungan

koloni. Penghitungan koloni dilakukan penyimpanan pada suhu yang sesuai.

Oleh karena itu, suatu bakteri dapat tumbuh menjadi satu koloni yang

terhitung mewakili jumlah bakteri hidup yang terdapat dalam tiap volum

pengenceran yang digunakan. Dalam hal ini pun, bahan pemeriksaan jika

perlu harus diencerkan untuk menghindari jumlah koloni terlalu banyak

sehingga tidak dapat dihitung. Hasil hitungan yang dapat diandalkan adalah

antara 30-300 koloni pada tiap lempeng pembiakan ( Agus, Esti, 2011 ).

Pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu

senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim

dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam

suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat

konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan (Brady,1999).

Dalam pembuatan larutan dengan konsentrasi tertentu sering dihasilkan

konsentrasi yang tidak kita inginkan. Untuk mengetahui konsentrasi yangsebenarnya perlu dilakukan standarisasi. Standarisasi sering dilakukan

dengan titrasi. Zat-zat yang didalam jumlah yang relative besar disebut

pelarut (Baroroh, 2004).

Serial Dilution adalah pengenceran bertahap dari suatu zat dalam larutan.

Biasanya faktor pengenceran di setiap langkah adalah konstan, sehingga

dalam perkembangan geometris dari konsentrasi dalam mode logaritmik.

media pertumbuhan yang akan digunakan sesuai dengan sifat bakteri

tersebut. Kehadiran mikrobia pada makanan dapat bersifat menguntungkan

Pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu

senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim

dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam

suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat

konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan (Brady,1999).

Dalam pembuatan larutan dengan konsentrasi tertentu sering dihasilkan

konsentrasi yang tidak kita inginkan. Untuk mengetahui konsentrasi yang

sebenarnya perlu dilakukan standarisasi. Standarisasi sering dilakukan

dengan titrasi. Zat-zat yang didalam jumlah yang relative besar disebut

pelarut (Baroroh, 2004).

Serial Dilution adalah pengenceran bertahap dari suatu zat dalam larutan.Biasanya faktor pengenceran di setiap langkah adalah konstan, sehingga


8/14

dalam perkembangan geometris dari konsentrasi dalam mode logaritmik.

Sebuah pengenceran sepuluh kali lipat serial dapat 1 M, 0,1 M, 0,01 M, 0,001

M. .. Pengenceran serial digunakan untuk menciptakan solusi yang sangat

akurat diencerkan serta solusi untuk percobaan menghasilkan kurva

konsentrasi dengan skala logaritmik. Sebuah pengenceran sepuluh kali untuksetiap langkah ini disebut pengenceran logaritmik atau log-pengenceran,

pengenceran (100,5 kali lipat) 3.16 kali lipat disebut pengenceran setengah-

logaritmik atau setengah-log pengenceran, dan pengenceran (100,25 kali

lipat) 1,78 kali lipat disebut pengenceran seperempat-seperempat-logaritmik

atau pengenceran log. Pengenceran serial yang banyak digunakan dalam

ilmu pengetahuan

Pengenceran yang dilakukan dalam percobaan ini adalah pengenceran

decimal yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 dan 10-6. Dan yang diplating dan

diamati adalah pengenceran 10-5 dan10-6. Hal ini karena diperkirakan

koloni yang dibentuk oleh sampel bakteri berada pada jumlah yang

dapat dihitung pada pengenceran tersebut. Selain itu, untuk perhitungan

jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan

secara desimal. Pada penanaman bakteri dibutuhkan kondisi aseptik

atau steril, baik pada alat maupun proses, untuk menghindari

kontaminasi, yaitu masuknya mikroba yang tidak diinginkan. (Fardiaz,

1993). Media KNA digunakan karena media KNA merupakan media yang

paling cocok untuk kultur bakteri. Selanjutnya cawan petri diinkubasikan

selama 2 x 24 jam pada suhu 37 C. inkubasi dilakukan selama 2 x 24

jam karena jumlah mikroba maksimal yang dapat dihitung langsung olehmata.

Metode cawan petri / plate count metode dengan penaksiran jumlah

kepadatan bakteri secara tidak langsung dan penghitungan bakterinya hanya

yang hidup saja yang mati tidak. Dalam metode ini dilakukan pengenceran

yang berseri 101-1010 agar populasi dapat terbaca, pengenceran yang

menghasilkan 30-300 bakteri saja yang dapat dibaca dan dikatakan berhasil

karena bila kuarang dari 30 untuk alasan statistic tidak dapat diterima bila

lebih dari 300 kemungkinan ada koloni yang terlalu padat, terlalu dekat satu

dengan yang lainya. Kelebihan metode ini perhitungan lebih meyakinkan

karena yang dihitung bakteri yang hidup saja, dapat menghitung jasad renik

lain sekaligus serta mengidentifikasi dan mengisolasi jasad renik mengetahui

pertumbuhan jasad renik tersebut namun kekurangannya butuh waktu yang

lama, media serta kondisi inkubasi yang berbeda menghasilkan data yang

berbeda, membutuhkan media yang padat kering agar metode berhasil, dan

terkadang hasil perhitungan tidak menunjukan hasil sebenarnya karena sel

mungkin membuat koloni lain.

1. Berdasarkan jumlah koloni (Plate count)


9/14

Cara ini yang paling umum digunakan untuk perhitungan jumlah mikrobia.

Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahan dengan kelipatan 10

(Jutono dkk, 1980).

Menurut Jutono (1980), tidak semua jumlah bakteri dapat dihitung. Ada

beberapa syarat perhitungan yang harus dipenuhi, yaitu :1. Jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika memang tidak

ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300.

2. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas

petridish, koloni tersebut dikenal sebagai spreader.

3. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang bertururt-

turut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran

sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2 hasilnya dirata-rata,

tetapi jika lebih besar dari 2 yang dipakai jumlah mikrobia dari hasil

pengenceran sebelumnya.

4. Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata.

Dalam perhitungan jumlah mikroorganisme ini seringkali digunakan

pengenceran. Pada pengenceran dengan menggunakan botol cairan terlebih

dahulu dikocok dengan baik sehingga kelompok sel dapat terpisah.

Pengenceran sel dapat membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah

mikroorganisme yang benar. Namun pengenceran yang terlalu tinggi akan

menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang umumnya relatif

rendah (Hadioetomo, 1990).

Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk pada

cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung. Dimana jumlah terbaikadalah antara 30 sampai 300 sel mikrobia per ml, per gr, atau per cm

permukaan (Fardiaz, 1992). Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah

sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, makin sedikit

sedikit jumlah mikrobia, dimana suatu saat didapat hanya satu mikrobia pada

satu tabung. Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikrobia

maksimal yang dapat dihitung, optimal setelah masa tersebut yaitu akhir

inkubasi. Selama masa inkubasi, sel yang masih hidup akan membentuk

koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata (Waluyo, 2004).

Pada perhitungan bakteri secara langsung menggunakan pengenceran

bakteri 10-3 untuk bakteri susu atau 10-4 untuk bakteri tanah karena dalam

pengenceran tersebut bakteri yang ada dalam medium dapat dihitung,

populasinya tidak padat dan juga tidak sedikit. Populasi bakteri yang padat

dapat mempersulit perhitungan karena bakteri yang ada tumpang tindih dan

polulasi yang sedikit kurang mewakili jumlah bakteri yang ada secara

keseluruhan. Jadi pengenceran tersebut antara suspensi yang diambil dari

pengenceran terdahulu untuk diencerkan kembali, jumlah bakteri yang ada

lebih memencar satu sama lain dan mudah dihitung. Bakteri susu dengan

pengenceran 10-3 setelah penghitungan didapat hasil 9,95 x 1011 mm3 dan

untuk bakteri tanah dengan pengenceran 10-4 dengan penghitungan didapathasil 4,25 x 109 mm3.


10/14

Perhitungan jumlah bakteri secara langsung memiliki kelebihan dan

kekurangan. Kelebihannya, adalah waktunya yang digunakan singkat,

penghitungannya lebih mudah, tidak membutuhkan bahan yang banyak.

Sedangkan kekurangannya adalah tidak dapat membedakan sel hidup dan

mati dan sel yang berukuran kecil sulit dilihat dengan mikroskop.

Pada percobaan ini spreader terjadi karena pengenceran suspensi tanah

yang kurang encer sehingga bakteri yang terikut masih sangat banyak

sehingga tidak bisa dihitung dan harus diencerkan lagi. Selain faktor

pengenceran, kualitas dari bahan juga dapat menyebabkan spreader, kualitas

bahan yang jelek dapat menyebabkan banyaknya mikrobia yang ada

sehingga karena faktor pengencerannya kurang bakteri yang diinokulasikan

ke dalam petridish menjadi bertumpuk sehingga tidak dapat dihitung

jumlahnya dan mengalami spreader.

Perhitungan jumlah bakteri secara langsung maupun secara tidak langsung

dipengaruhi oleh beberapa faktor, yakni :

2. Faktor pengenceran, semakin tinggi pengenceran suatu suspensi maka

akan semakin sedikit jumlah bakteri yang dikandung atau tidak ada

sama sekali

3. Temperatur dan pH, berkaitan dengan pertumbuhan bakteri pada suhu dan

pH optimum4. Komposisi medium, medium yang digunakan untuk penanaman harus

sesuai dengan bakteri yang akan dihitung

5. Segi teknis yaitu Alat yang digunakan dan tingkat ketelitian dalam

penghitungan.

Untuk melaporkan suatu analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang

disebut Standard Plate Count yang menjelaskan cara menghitung koloni

pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah

koloni dalan suatu contoh.

Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut :

1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni

antara 30 sampai 300.

2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan

koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai

satu koloni.

3. suatu deretan (rantai) kolini yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung

sebagai satu koloni.

Sedangkan data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan

sebagai berikut :


11/14

1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama

dibelakang koma dan angkan kedua dibelakang koma. Jika angka ketiga

sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi

pada angka kedua.

2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkanangka kurang dari 30 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada

pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai

kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang

sebenarnya harus dicantumkan.

3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan

angka lebih besar dari 300 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada

pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih

dari 300 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang

sebenarnya harus dicantumkan.

4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan

jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan

terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2,

yang digunakan adalaha rata-ratanya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi

dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih besar dari 2, yang

dilaporkan hanya hasil terkecil.

5. Jika digunakan dua cawan Petri (duplo) per pengenceran, data yang

diambil harus dari kedua cawan tersebut, meskipun salah satunya tidak

memenuhi syarat diantara 30 dan300.

Koloni adalah kumpulan dari mikrobia yang memilki kesamaan sifat-sifat

seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu

diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah

(Dwidjoseputro, 1978) :

1. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya serupa suatu titik, namun ada

pula yang melebar sampai menutup permukaan medium.

2. Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang. Ada yang tepinya

rata, ada yang tidak rata.

3. Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata saja dengan permukaan

medium, ada pula yang timbul yaitu menjulang tebal di atas permukaan

medium.

4. Halus kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada

yang permukaannya kasar dan tidak rata.

5. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat, ada yang

permukaannya suram.

6. Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan.

7. Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang keras dan

kering.


12/14

Keuntungan menggunakan perhitungan secara tidak langsung ialah metode

tersebut hanya dapat menghitung jumlah mikroorganisme yang hidup atau sel

yang hidup. Tidak seperti perhitungan secara langsung, seluruh

mikroorganisme baik yang mati maupun hidup dihitung seluruhnya (Lay1994).

Kelemahan utama metode tersebut adalah keselektifannya sehingga hasil

perhitungan kadang kala menjadi bias. Kondisi pertumbuha bakteri, termasuk

komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu, dan Ph, sangat

menentukan jenis bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada.

Tidak ada satu kondisi yang universal untuk membuat seluruh

mikroorganisme dapat tumbuh dengan baik. Contoh yang alami, misalnya

pada tanah yang mengadung berbagai jenis microorganisme, tidak mungkin

untuk menghitung semua mikroorganisme yang terkandung didalamnya

dengan cara viable plating tersebut. Kekurangan tersebut dapat menjadi

suatu keunggulan jika kita ingin menghitung populasi mikroorganisme

spesifik. Sebagai contoh, kita dapat mendesain prosedur yang selektif untuk

menghitung bakteri koliform atau kelompok mikroorganisme fisiologis lainnya

(Harmita 2006).

Sedangkan perhitungan secara tidak langsung dapat dilakukan dengan

beberapa cara yaitu:

6. Penentuan volume total

Cara ini adalah semacam modifikasi penentuan hematokrit pada pengukuranvolume total butir-butir darah, misalnya 10 ml biakan dimasukkan ke dalam

tabung reaksi khusus (tabung hopklins) yang bagian bawahnya berupa

silinder dan bergaris ukuran (Hadietomo, 1990).

5. Metode turbidometri

Teknik ini sudah dipakai sebagai cara mengukur keker han suspensi atas

dasar penyerapan dan pemencaran cahaya yang dilintaskan, sehingga yang

mengandung lebih dari 107-108 sel/ml, tampak lebih keruh oleh mata

telanjang. Suatu volume biakan yang telah ditakar ditempatkan dalam tabung

khusus yang jernih dengan diameter tertentu (Hadietomo, 1990).

c. Metode MPN (Most Probable Number)

Most Probable Number dalam bidang kesehatan masyarakat dari mikrobiologi

pangan, dipergunakan secara luas untuk menghitung jumlah bakteri yang ada

dalam bahan pangan. Media ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri

patogenik dalam jumlah sedikit yang terdapat dalam bahan pangan. Metoda

ini berdasarkan atas pengenceran. Apabila suatu larutan yang mengandung

sel-sel mikroorganisme diencerkan terus-menerus, akhirnya akan diperoleh

suatu larutan dimana tidak dijumpai sel lagi yaitu dikatakan steril (Buckle dkk,

1985).


13/14

Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana

perhitungan dilakukan berdasarkan pada jumlah tabung yang positif yaitu

yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu

tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati

timbulnya kekeruhan, atau timbulnya gas di dalam tabung kecil (tabungDurham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik

pembentukan gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga

tau lima seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan

ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih

banyak. (Fardiaz, 1992)

d. Metode perhitungan cawan

Metode perhitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel

yang hidup dapat berkembang menjadi koloni. Jadi jumlah koloni yang

muncul pada cawan adalah indeks bagi jumlah mikroorganisme yang

terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasai dari metode ini adalah

mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut.

Setelah inkubasi, jumlah semua koloni diamati untuk memenuhi persyaratan

statistik. Cawan yang dipilih untuk menghitung koloni adalah cawan yang

mengandung antara 30 sampai 300 koloni. Organisme yang terdapat dalam

sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk

dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Waluyo, 2007).

Berdasarkan kekeruhan (turbiditas/turbidimetri)

Salah satu metode cepat yang digunakan untuk menghitung massal seladalah melalui perhitungan kekeruhan (turbidity). Kekeruhan dapat diukur

dengan menggunakan fotometer atau spertofotometer. Pengukuran

kekeruhan ini didasarkan atas pertikel-pertikel kecil yang menyebarkan

cahaya lengsung secara propisional (sampai batas-batas tertentu) dengan

konsentrtasinya. Zat cahaya melewati tabung yang berisi suspensi mikroba,

maka cahaya akan dihamburkan (Pelezar, 1989).

Pada percobaan penghitungan populasi jamur tanah dengan metode plat

pengenceran. Untuk mengisolasi jamur tanah pengenceran yang digunakan

adalah pengenceran 10-4 dan 10-5. Pengenceran ini dimaksudkan untuk agar

partikel-partikel tanah tidak ikut. Pada penentuan populasi jamur tanah media

agar yang digunakan adalah PDA yang telah diberi antibiotik. Prinsip dari

isolasi mikroba adalah memisahkan suatu jenis mikroba dengan mikroba lain

yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat

dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, karena dalam

media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap

pada tempatnya. Media yang digunakan dalam isolasi ini harus sesuai

dengan mikroorganisme yang akan kita ketahui populasinya. Karena kalau

tidak sesuai agarnya maka mikroorganisme tidak akan tumbuh. Jika sel-seltersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tepat yang terpisah,


14/14

maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi

suatu koloni yang terpisah, sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya.

Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu

karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi bila sel-

sel tersebut di pisahkan dengan cara pengenceran, kemudian di tumbuhkandalam media padat dan di biarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut

selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri yang

terpisah.

pembahasan isolasi dan inokulasi

Documents