Paparan Hasil Praktikum Teknik Amobilisasi Enzim dan Kinetika Enzim

Oleh kelompok 3 :

Artha Vinsentricia G851130381Ekajayanti Kining G851130141Fitriana Shofia Monisa G851130331Gema Wahyuni G851130391Livia Rhea Alvita G851130131Origenes Boy Kapitan G851130111Riki G851130301Sogandi G851130241Tirta setiawan G851130101Ukhradhia M Safira G851130466

Invertase atau -fruktofuranosida fruktohidrolase menghidrolisis sukrosa menjadi molekul -D-glukosa dan -D-Fruktosa (Barlikova et al. 1991). Enzim ini juga menhidrolisis -fruktan seperti rafinosa menjaedi gula-gula sederhana (Nakano et al. 2004).

Enzim invertase yang dihasilkan oleh Saccharomyces cerevisiae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4.5 dan temperature 30 C (Bergamasco et al. 2000).

Penentuan aktivitas enzim ditentukan dengan menggunakan metode Assay Nelson dan penentuan kadar protein dengan metode Lowry.

Penetuan kinetika enzim dapat menggunakan persamaan Michailes Menten, Line Weaver Burk, Dixon, Hanes, dan Eddie Hofstee.

PENDAHULUAN

Amobilisasi Enzim

Mahalnya harga enzim

Setelah digunakan tidak dapat dipakai

kembali

Enzim mudah larut dalam air sehingga harus dilakukan pemurnian untuk dipakai

kembali.

Teknik Amobilisasi

enzim

Amobilisasi Enzim

Definisi• enzim yang secara fisik dijerap/terlokalisasi

dalam suatu bahan penyangga dan aktivitas katalitiknya tetap dipertahankan

Keuntungan • Untuk mengurangi pengeluaran biaya dalam

proses enzimatik secara kontinu khususnya dalam industri makanan dan minuman

• Bisa digunakan kembali beberapa kali dan tetap aktif

• Pemisahan dan pembentukan kembali enzim mudah dilakukan

• Dapat menurunkan biaya operasi (Bayramolu et al. 2003)

Jenis-jenis teknik amobilisasi

Adsorpsi

Covalent bonding

Cross linking

Entrapment

Entrapment

Alat dan Bahan

Metode

Kesimpulan

Hasil

Alat Dan Bahan

1. Seperangkat alat Gelas

2. Spektrofotometer

3. Shaker incubator

Alat Bahan

1. Akrilamid2. Bis Akrilamid3. TEMED4. Amonium

Persulfat5. Enzim Invertase6. Fraksi I (ekstrak

kasar7. Fraksi 2

(amonium sulfat)8. Buffer asetat9. Sukrosa

Metode Pembuatan Enzim Amobil

Gel Poliakrilamid

(2 mm)

Buffer asetat pH 4,5 + Akrilamid + Bis Akrilamid + Enzim Invertase + TEMED +

Amonium persulfat 10% >> Diaduk , reaksi berlangsung pada suhu dingin

Dicuci munggunakan

buffer

Pencucian 1

Pencucian 2

Pencucian 3

Metode pengujian Aktivitas Invertase

Substrat sukrosa

Potongan Gel enzim amobil Inkubasi Fraksi I Amobil

Fraksi II Amobil

Fraksi III Amobil

Uji aktivitas : reagen folin ciocolteau 660 nm

H A S I L

Sumber enzim Absorbansi [glukosa] (mM)

Unit enzim (unit/mL)

Unit aktivitas (unit)

Rataan (unit)

Blanko (sukrosa) 0 0 - - -Enzim amobil T1 (0.05 mL) 0.089 0.757 7.567 15.135

12.573

Enzim amobil T2 (0.05 mL) 0.144 1.252 12.522 25.045

Enzim amobil T3 (0.05 mL) 0.071 0.594 5.946 11.892

Enzim amobil S1 (0.5 mL) 0.181 1.586 1.586 3.171

Enzim amobil S2 (0.5 mL) 0.639 5.712 5.712 11.423

Enzim amobil S3 (0.5 mL) 0.492 4.387 4.387 8.775

Enzim bebas A1 (0.05 mL) - 0.064 -0.622 -6.216 -12.432

-5.727

Enzim bebas A2 (0.05 mL) - 0.060 -0.586 -5.856 -11.711

Enzim bebas A3 (0.05 mL) - 0.070 -0.676 -6.757 -13.513

Enzim bebas B1 (0.5 mL) 0.078 0.658 0.658 1.315

Enzim bebas B2 (0.5 mL) 0.080 0.676 0.676 1.351

Enzim bebas B3 (0.5 mL) 0.040 0.315 0.315 0.631

Tabel Data Uji Aktivitas Invertase Amobil dan Bebas

CONTOH PERHITUNGAN

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.40

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14f(x) = 0.110964912280702 x + 0.00550877192982456R² = 0.952404476922006

Kurva standar aktivitas

[Glukosa] (mM)

Ab

sorb

an (

A)

PEMBAHASAN

Aktivitas enzim didefinisikan sebagai bertambahnya produk atau berkurangnya substrat per satuan waktu. Pengujian aktivitas invertase kali ini dilihat dari banyaknya produk yang terbentuk yaitu glukosa. Pengujian dilakukan dengan metode Nelson yang memanfaatkan prinsip pengujian gula pereduksi. Penambahan reagen Nelson berguna sebagai pewarna dan selanjutnya segera dipanaskan untuk memperjelas warna yang dihasilkan. Reagen Nelson berisi CuSO4, Ba(OH)2, dan pereaksi tembaga alkali (Bintang 2010). Hasil penambahan kemudian didinginkan sehingga diperoleh padatan berwarna biru hingga biru kehijauan. Semakin tinggi konsentrasi gula pereduksi maka warna hijau semakin dominan. Penambahan fosfomolibdat betujuan untuk melarutkan padatan yang terbentuk sehingga warna biru semakin pekat. Warna yang terlalu pekat dapat dikurangi dengan penambahan akuades.

Berdasarkan data pada tabel, dapat terlihat bahwa konsentrasi glukosa (produk) paling tinggi terdapat pada fraksi amobil S2 yakni sebesar 5.712 mM. Hal ini dikarenakan volume enzim yang digunakan juga besar dan cukup mempengaruhi yaitu sebanyak 0.5 mL. Namun, volume enzim yang besar ternyata mempengaruhi unit aktivitas enzim. Unit aktivitas enzim amobil S1-S3 lebih kecil dibandingkan enzim amobil T1-T3. Hal ini disebabkan peningkatan volume enzim menyebabkan enzim banyak berkumpul sehingga mengurangi kesempatan bagi molekul substrat menempel pada sisi aktif enzim (Meryandini et al 2009).

Rataan unit aktivitas enzim amobil yaitu 12.573 unit lebih besar dibandingkan rataan unit aktivitas enzim bebas yaitu -5.727 unit. Unit aktivitas adalah jumlah substrat yang dihidrolisis per menit. Artinya, enzim amobil memiliki kemampuan menghidrolisis substrat lebih banyak dibandingkan enzim bebas. Hal ini dikarenakan enzim amobil bersifat lebih spesifik dan efektif dalam menghidrolisis substrat dibandingkan enzim bebas yang kemungkinan memiliki lebih banyak pengotor berupa protein atau senyawa lainnya .

PEMBAHASAN

PEMBAHASAN Keuntungan enzim amobil antara lain

dapat digunakan lebih dari satu kali dan mudah dalam proses pemisahan produk. Amobilisasi invertase dengan penyangga poliakrilamid termasuk jenis amobilisasi berdasarkan pembentukan ikatan kovalen (covalent binding) antara dua atom yang berasal dari poliakrilamid dan residu asam amino pada enzim (Gambar 1). Bagian sisi aktif enzim akan berada dalam kondisi terbuka dan siap menangkap substrat.

Selain dengan poliakrilamid, bahan lain juga dapat digunakan untuk mengamobilisasi invertase diantaranya alginat (Tanriseven & Dogan 2001), Nylon-6 microbead (Amaya-Delgado et al 2006) dan Sepabeads (Torres et al 2002).

Gambar 1

Bahan dan Alat 4mM glukosa; 4 mM sukrosa; aquades; reagen fosfomolibdat; 0,2 M buffer asetat pH 4,5; reagen A (2% Na2CO3 dalam 0,1 N NaOH); reagen B (0,5% CuSO4.5H2O dalam 1% Na atau K-tartrat); reagen C (campuran 50 mL reagen A dalam 1 mL reagen B); reagen D (reagen Folin Cioucalteau yang telah diencerkan dengan

air sampai 1 N dalam asam); fraksi protein I dan II tabung reaksi bertutup, water incubator, vortex, spektrofotometer

(UV/Vis), stopwatch, mikropipet

Metode Kinetika Enzim

menambahkan Glukosa masing-masing 0 ; 0,02 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,15 ; 0,2 ; 0,25 ; dan 0,3 mM

8 tabung reaksi uji

campuran

Menambahkan aquades sebanyak: 1 ; 0,98 ; 0,95 ; 0,9 ; 0,85 ; 0,8 ; 0,75 ; dan 0,7 mL

campuran

Menambahkan reagen kurpitartat: 1 mL

campuran

Pembuatan Kurva Standar Gula Reduksi

8 tabung reaksi uji

• Memanakan dalam waterbath selama 20 menit

• Mendinginkan dalam suhu ruangan

• Mengocok dengan vortex

• Mendiamkan tabung selama 5 menit

Campuran terhomogenkan

• Menambahkan 7 mL aquades pada emua tabung

• Mengocok dengan vortex

• Mengukur Absorbansi pada panjang gelombang 510 nM

• Menggunakan tabung 1 sebagai bkanko

• Membuat kurva standar gula reduksiKurva standar gula reduksi

Pengukuran Uji Aktivitas Enzim

9 tabung reaksi uji

• Menambahkan 0,2 M buffer asetat pH 4,5

• Menambahkan aquades masing-masing 0,6 ; 0,55 ; 0,10 ; 0,55 ; 0,10 ; 0,55 ; dan dan 0,10 mL

• Menambahkan masing2 fraksi dgn volume 0; 0,05 ; 0,50 ; 0,05 ; 0,50 ; 0,05 ; dan 0,50 mL

• Menambahkan sukrosa 0,5M maing2 sebanyak 0,20 mL

• Menambahkan reagen kurpitartat

campuran

Mendidihkan semua tabung dalam waterbath selama 10 menit

Mengukur A pada panjang gelombang 510 nM

Absorbansi masing2 tabung

8 tabung reaksi uji

Penentuan Nilai Km dan Vm

• Menambahkan 0,2 M buffer asetat pH 4,5

• Menambahkan sukrosa 0,5M maing2 sebanyak 0 ; 0,02 ; 0,03 ; 0,04 ; 0,05 ; 0,06 ; 0,07 ; dan 0,08 mL

• Menambahkan aquades sampai volume 0,9 mL

• Menambahkan enzim masing2 sebanyak 0,1 mL

• menginkubasi

• Menambahkan reagen kurpitartat masing2 sebanyak 1 mL

• Mendiihkan tabung selama 20 menit

• Mengukur absorbansi pada 510 nMAbsorbansi

masing2 tabung

Penentuan Kadar Protein

8 tabung reaksi uji

• Menambahkan reagen D masing2 sebanyak 0,5 mL

• Mengaduk dengan vortex, dan mendiamkan dalam suhu kamar selama 30 menit

• Mengukur absorbansi pada panjang gelombang 750 nm dan membuat kurva standar BSA

Campuran Homogen

• Menambahkan standar BSA masing-masing 0 ; 0,20 ; 0,40 ; 0,60 ; 0,80 ; dan 1 mL

• Menambahkan sampel protein

• Menambahkan aquades masing-masing 1 ; 0,80 ; 0,60 ; 0,40 ; 0,20 ; dan 0 mL sbg blanko

• Menambahkan reagen C sebanyak 5 mL masing-masing tabung

• Mengaduk dengan vortex, dan mendiamkan dlm suhu ruangan selama 10 menit

Kurva standar BSA

Kurva Standar Aktivitas Enzim

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.40

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14f(x) = 0.110964912280702 x + 0.00550877192982456R² = 0.952404476922006

[Glukosa] (mM)

Ab

sorb

an (

A)

Kurva Standar BSA

0 20 40 60 80 100 1200

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

f(x) = 0.00283428571428571 x + 0.0156190476190476R² = 0.979701064592349

[BSA] (μg/mL)

Ab

sorb

an (

A)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

Kurva Michaelis Menten

[Sukrosa] (mM)

Vo

(m

M/m

enit

)

0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070 0.080 0.090 0.1000

2

4

6

8

10

12

f(x) = 24.9326097540102 x + 8.20604339772413R² = 0.786580296700649

Kurva Line Weaverburk

1/[Sukrosa]

1/V

o

Perhitungan Km dan Vm

• y = 24.93x + 8.206R² = 0.786

• Keterangan:

y = 1/Vo x = 1/[substrat] a = 1/Vmaksb = Km/Vmaks

sehingga,

nilai Vmaks = 1/8.206 = 0.122 mM/menit

Km = Vmaks x b

= 0.122 x 24.93

= 3.04 mM

HasilKadar Protein Metode Lowry

Sampel Absorbansi Konsentrasi Glukosa

Aktivitas Enzim(U/ml)

Aktivitas Total(U)

Blanko 0,000      

Ekstrak Kasar 2,696 24,243 4,848 2,424

Fraksi Amonium Sulfat Encer Kental

  

0,1921,948

  

1,68417,504

  

3,3693,501

  

0,1681,750

Kromatografi Encer Kental

 0,1200,278

 1,0362,459

 2,0720,491

 0,1040,246

Tabel Aktivitas Enzim

Tabel Pemurnian EnzimTahapan

PemurnianAktivit

asTotal(U)

TotalProtein

(mg)

AktivitasSpesifik(U/mg)

TingkatKemurnian

Recovery (%)

Ekstrak Kasar 2,424 2,955 0,820 1 100  

Fraksi Amonium Sulfat

0,959 2,955 0,324 0,395 39,563

Kromatografi 0,175 0,479 0,365 0,445 7,219  

Tabel Kadar ProteinSampel Absorbansi

terukurAbsorbansiterkoreksi

Konsentrasi protein(mg/ml)

Total Protein

(mg)Blanko 0,03

Ekstrak kasar >3 2,97 1477,5 2.955

Fraksi Amonium Sulfat

>3 2,97 1477,5 2,955

Kromatografi 0,524 0,494 239,5

0,479

SARAN

Perlu dilakukan pengujian terhadap penggunaan berulang invertase amobil untuk melihat seberapa efektif invertase amobil jika digunakan lebih dari satu kali.

DAFTAR PUSTAKA • Amaya-Delgado L, Hidalgo-Lara ME, Montes-Horcasitas, MC. 2006.

Hydrolysis of sucrose by invertase immobilized on nylon-6 microbeads. Food Chemistry 99 (2) : 299-304.

• Bintang M. 2010. Teknik Penelitian Biokimia. Jakarta: Erlangga.• Meryandini A, Sunarti TC, Mutia F, Gusmawati NF, Lestari Y. 2009.

Penggunaan xilanase Streptomyces. Sp 45 I-3 amobil untuk hidrolisis xilan tongkol jagung. J.Teknol. dan Industri Pangan 20 (1) : 9-16.

• Tanriseven A, Dogan S. 2001. Immobilization of invertase within calcium alginate gel capsules. Process Biochemistry 36 (11) : 1081-1083.

• Torres R, Mateo C, Fuentes M, Palomo JM, Ortiz C, Fernandez-Lafuente R, Guisan JM. 2006. Reversible Immobilization of Invertase on Sepabeads Coated with Polyethyleneimine: Optimization of the Biocatalyst's Stability. Biotechnol. Process 18 (6) : 1221-1226.