elektroforesis gel laporan praktikum tek kim

Click here to load reader

Post on 24-Nov-2015

271 views

Category:

Documents

9 download

Embed Size (px)

DESCRIPTION

sip

TRANSCRIPT

ELEKTROFORESIS GEL

I.TUJUAN

1. Mempelajari teknik elektroforesis gel untuk mengetahui ukuran fragmenDNA tanaman, darah dan plasmid.2.Mengetahui dan memahami prinsip kerja elektroforesis gel.

II.TEORI

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Bowen 2000: 1).Elektroforesis gel adalah teknik memisahkan suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut untuk melewati medium berisi gel dibantu dengan tenaga listrik (Anonim ?: 1).Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Bowen 2000: 1).Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug & Cummings 1994: 215).Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen 1999: 280).Aplikasi elektroforesis dapat digunakan dalam uji paternitas dan identifikasi pelaku kejahatan (DNAfingerprinting).Elektroforesis juga berperan dalamhuman genome project(Anonim ?: 3).Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbelldkk.2002: 396--397).Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:1.Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.2.Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.3.Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.(Davisdkk. 1994: 151).Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:1.Ukuran Molekul DNAMolekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.2.Konsentrasi gelSemakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA.Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.3.Bentuk molekulMolekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.4.Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul.Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.5.Pori-pori gelSemakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.6.VoltaseSemakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.7.LarutanbufferelektroforesisBuffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA.(Wolfe 1993: 127;Bowen 2000: 3-4).Markeradalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya.Markerberfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.MarkerDNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi.Marker-markerDNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contohmarkerDNA adalah lambdaHindIII.Markertersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb.Penggunaan DNAmarkertersebut dikarenakan molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran 110--20.000 pb.(Birren & Lai 1993: 82; Martin 1996: 77).Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:1.Comb: digunakan untuk membentukwellpada gel agarosa.2.Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.3.Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa.4.Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromidayang bersifat karsinogenik danBrom Fenol Blue.Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkanBrom Fenol Blueberfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren & Lai 1993: 79--81).Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNAfinger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA (Russell 1994: 299--310 & 500--501; Fairbanks & Andersen 1999: 278).

III.ALAT, BAHAN DAN CARA KERJA

A.ALAT

Alat yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah aparatus elektroforesis yang terdiri daritray, comb, chamberdan sumber listrik; sarung tangan karet; mikropipet dan tips; alat dokumentasi gel (gel doc) merek BIORAD tipe XR.

B.BAHAN

Bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel adalah bubuk agarosa 1 gr;running buffer;loading buffer; parafilm; sampel DNA (produk PCR); Etidium bromida (EtBr); DNA marker (lambda DNA/Hind III).

C.CARA KERJA

1.Gel agarose dibuat (telah dilakukan oleh asisten) dengan campuran 2 gr agarose + 200 ml 1x TBE, dididihkan dan ditambahkan etidium bromida 2L dicampur dengan baik, kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengancombnya dan dibiarkan sampai mengeras.2.Gel dimasukkan kedalamelectrophoresis chamberdan ditambahkan larutanrunning bufferserta etidium bromida.3.Sampel DNA hasil PCR dicampurkan denganloading bufferkemudian dimasukkan ke dalamwellpada gel dengan menggunakan mikropipet.4.Marka DNA dimasukkan.5.Penutupelectrophoresischamberdipasang danpower supplydinyalakan.6.Setelah pewarna bergerak sampai bagian ujung gel, gel dikeluarkan dan dilihat dengan sinar UV.

IV.HASIL PENGAMATANA.SAMPEL DNA TANAMAN

Agarose 0,8%, 100 volt, 1l/ml EtBr

Keterangan :A. DNA MarkerB. WellC. DNA tanamanD. Gel

B. SAMPEL DNA DARAH

Agarose 1%, 100 volt, 1l/ml EtBr

Keterangan:A. DNA MarkerB. DNA darahC. WellD. Gel

C.SAMPEL DNA PLASMID

Gal Agarose 1%, 100 volt, 0,1l/ml EtBr

Keterangan:A. DNA MarkerB. DNA plasmidC. WellD. Gel

V.PEMBAHASAN

Praktikum elektroforesis gel menggunakan gel agarosa.Gel agarosa diperoleh dari rumput laut dan biasanya digunakan dalam konsentrasi 0,5--2%.Alasan memakai agarosa dibandingkan poliakrilamida adalah agarosa mudah untuk disiapkan karena proses pembuatannya mudah.Gel agarosa dibuat dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutanbuffer, kemudian dipanaskan dan tunggu sampai mengeras.Gel agarosa juga bersifat non-toxic(Bowen 2000: 1).Selain itu praktikum elektroforesis gel juga menggunakan alat-alat yang mempunyai fungsi dan peranan masing-masing.Alat-alat tersebut adalah mikropipet, apparatus elektroforesis, power supply, sumber sinar UV, dan sarung tangan lateks.Mikropipet berfungsi untuk memindahkan sampel dan larutan lainnya daritubeke dalamwell-wellpada aparatus elektroforesis.Apparatus elektroforesis terdiri atascomb(sisir) yang membentukwell(sumur) pada gel agarosa,trayyang merupakan wadah cetakan gel, danchamberyang merupakan medium tempat berlangsungnya proses elektroforesis.Power Supply (DC)sebagai sumber energi untuk aparatus elektroforesis.Sumber Sinar UV berfungsi untuk membantu mengamati hasil band yang tampak sehingga terlihat lebih jelas. Sarung tangan lateks berfungsi untukmelindungi tangan agar tidak bersentuhan langsung dengan etidium bromida yang bersifat karsinogenik atau penyebab kanker (Birren & Lai 1993: 79--81).Praktikum elektroforesis gel dimulai dengan pembuatan gel agarosa.Praktikan tidak melakukan pembuatan gel agarosa karena dilakukan oleh asisten praktikum.Secara umum, proses pembuatan gel agarosa dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan larutanbuffer, dipanaskan di dalammicrowave, tambahkan etidium bromida, dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengancomb-nya dan tunggu sampai mengeras.Bubuk agarosa yang digunakan sebanyak 1 gr dan larutanrunning bufferTBE (Tris- Borate- EDTA) sebanyak 100 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Bowen 2000: 3).Penambahan etidium bromida dilakukan dengan tujuanmewarnai asam nuk