Pokok Bahasan:

Aplikasi bioteknologi II: Isolasi Gen Resisten terhadap Penyakit CVPD

Sub Pokok Bahasan: Isolasi gen resisten dari tanaman jeruk yang tahan terhadap serangan

penyakit CVPD

Isolasi Gen dengan metode T-DNA Tagging menggunakan vektor

Agrobacterium tumefaciens

Transformasi genetik pada tanaman jeruk secara in vitro dan in planta.

TIK: Mahasiswa mengetahui dan memahami aplikasi bidang bioteknologi

Mahasiswa memahami teknik isolasi gen resisten terhadap penyakit CVPD

dengan metode T-DNA Tagging menggunakan vektor Agrobacterium

tumefaciens.

Mahasiswa memahami teknik transformasi genetik pada tanaman jeruk

secara in vitro dan in planta.

Waktu: 2x (2x50 menit)

14

I. Pendahuluan

Berbagai jenis tanaman jeruk yang dibudidayakan secara ekonomis

diketahui peka terhadap serangan penyakit CVPD. Jenis-jenis tanaman jeruk

budidaya yang peka terhadap serangan CVPD untuk selanjutnya disebut tanaman

jeruk CVPDs. Tanaman jeruk Garut dan jeruk Tejakula yang sangat terkenal

sekarang sudah sangat sulit ditemukan dilapangan dan kalaupun ditemukan telah

terinfeksi berat oleh penyakit CVPD. Dewasa ini belum ditemukan cara

pengendalian penyakit CVPD ini secara baik, karena berbagai kendala yang masih

dihadapi seperti belum dapat dibiakkannya patogen penyebab penyakit pada

media buatan, sehingga sulit untuk melakukan kharakterisasi terhadap sifat-sifat

patogennya akibatnya sulit untuk mengetahui mekanisme infeksi tanaman oleh

patogen yang pada akhirnya sulit untuk merumuskan teknik pengendaliannya.

Di lain pihak dilaporkan beberapa jenis tanaman jeruk, terutama tanaman

jeruk yang tidak dibudidayakan secara ekonomis dan beberapa tanaman

kerabatnya, diketahui ada yang toleran terhadap penyakit CVPD. Jenis tanaman

jeruk dan kerabatnya yang toleran CVPD ini untuk selanjutnya disebut tanaman

jeruk CVPDr. Diantaranya “Seedless lime” (jeruk nipis tanpa biji), Tahiti lime,

Triphachia trifoliata (jeruk kinkit), dan Poncirus trifolia (karatachi). Tanaman

jeruk yang toleran CVPD (CVPDr) diyakini mengandung gen atau gen-gen yang

produknya sanggup mematahkan infeksi oleh patogen CVPD (L. asiaticum) atau

sanggup menolak penularan patogen yang dibawa oleh serangga vektor D. citri.

Berdasarkan informasi ini, pertama; Wirawan, dkk, 2000, menguji ulang

ketahanan terhadap CVPD dari beberapa jenis tanaman CVPDr dengan cara

penularan penyakit menggunakan vektor serangga Diaphorina citri. Seleksi

dilakukan secara sangat ketat yaitu baik secara visual dengan mengamati gejala

yang muncul maupun menggunakan deteksi PCR (Polimerase Chain Reaction)

terhadap keberadaan patogen pada tanaman yang diuji. Kemudian dari tanaman-

tanaman CVPDr yang terseleksi dilakukan mutasi, dengan metode transformasi

menggunakan sistem Agrobacterium tumefaciens baik secara in vitro maupun

secara in planta.

Secara in vitro transformasi genetik dilakukan melalui kultur sel, potongan

daun, ruas ranting muda (internode stem), biji, dan potongan kecambah steril dari

15

tanaman CVPDr (dalam hal ini digunakan jeruk kinkit dan karatachi). A.

tumefaciens LBA (pAL4404, pIB121) diinokulasikan kepada bahan-bahan

tanaman tersebut untuk kemudian ditumbuhkan pada media kultur jaringan

(MTO atau MTOK). Transformasi secara in planta dilakukan dengan

menginokilasikan A. tumefaciens LBA (pAL4404, pIB121) pada pucuk tunas

yang dipotong pada bibit muda tanaman jeruk kinkit atau karatachi.

Binary Ti Plasmid pIB121, mengandung fragmen DNA yang terdiri dari

gen untuk ketahanan terhadap kanamisin, dan gen ß-glucuronidase (GUS) yang

diklon “downstream” 35S CaMV promoter (Jefferson, et al, 1987; Ohta, et al,

1990; Wirawan and Kojima, 1996). A. tumefaciens akan mentransfer fragmen

DNA ini ke dalam sel-sel tanaman jeruk kinkit atau karatachi yang dapat dideteksi

dengan media seleksi yang mengandung kanamisin, dan deteksi PCR

menggunakan sekuen gen GUS sebagai primernya serta dengan mendeteksi

ekspresi gen GUS pada transforman yang dihasilkan. Mutasi dengan sistem A.

tumefaciens pada genom tanaman CVPDr (kinkit atau karatachi) menginaktifkan

gen-gen yang termutasi yang diantaranya adalah gen atau gen-gen yang

bertanggungjawab pada toleransi tanaman terhadap serangan penyakit CVPD.

Dengan demikian loci gen-gen ini dapat diidentifikasi dan diisolasi serta dapat

klon untuk dikharakterisasi sifat-sifatnya dan dimanfaatkan dalam penanganan

penyakit CVPD.

Transforman atau mutan tanaman jeruk CVPDr yang dihasilkan

diinokulasi dengan Diaphorina citri infektif (membawa bakteri L. asiaticum,

penyebab CVPD). Mutan-mutan yang menunjukkan gejala serangan CVPD

(disebut CVPDr-s) diseleksi dan keberadaan L. asiaticum pada mutan tanaman

jeruk CVPDr-s dideteksi dengan metode PCR menggunakan sekuen 16S ribosomal

DNA yang spesifik untuk L. asiaticum sebagai primer. Loci gen-gen toleran

CVPD diisolasi dari mutan tanaman CVPDr-s ini menggunakan metode inverse

PCR (IPCR) atau plasmid rescue.

Wild type target DNA dari tanaman induk dideteksi dan diisolasi

menggunakan metode PCR menggunakan primer yang dirumuskan berdasarkan

sekuen dari flanking DNA produk IPCR. Konfirmasi terhadap hasil PCR ini

16

dilakukan dengan metode Southern Blot menggunakan fragmen flanking DNA

atau produk PCR diatas sebagai probe.

Penelitian dilakukan berdasarkan pengalaman penelitian sebelumnya

dalam mentrasfer gen acvB yang diisolasi dari khromosom A. tumefaciens strain

A208 (DDBJ accession number D13800 (Wirawan, et al, 1993) ke dalam sel-sel

tanaman tembakau dan tomat dapat menunjukkan hasil yang sangat baik.

Disamping itu hasil penelitian Moore dan kawan-kawan menunjukkan bahwa

transformasi tanaman jeruk menggunakan sistem Agrobacterium ini dapat berhasil

dengan baik (Moore, et al, 1992).

II. Uji ketahanan terhadap serangan penyakit CVPDBeberapa jenis tanaman jeruk dan kerabatnya yang diuji ulang ketahanan

atau kepekaannya terhadap serangan penyakit CVPD. Beberapa tanaman ini

sebelumnya dilaporkan sebagai toleran terhadap serangan penyakit CVPD (De

Lange, et al, 1985; Nariani, 1981; Tirtawidjaya, 1981). Hampir semua tanaman

yang diuji menunjukkan gejala serangan penyakit CVPD artinya tidak tahan

terhadap penyakit CVPD, seperti yang ditunjukkan oleh tanaman Kemuning

(Murraya Paniculata), jeruk siem Kintamani, jeruk keprok Tejakula, Nagami

kinkan, Sour Orange dan lainnya. Analisis PCR untuk mendeteksi patogen

penyebab penyakit CVPD memastikan bahwa tanaman-tanaman tersebut peka

terhadap serangan penyakit CVPD. Tanaman jeruk kinkit, jeruk nipis tanpa biji

dan karatachi (Poncirus trifolia) menunjukkan ketahanan terhadap serangan

penyakit CVPD. Sehingga kemudian diputuskan untuk memilih jeruk kinkit dan

karatachi sebagai tanaman toleran yang diteliti lebih lanjut.

Kemuning (Murraya paniculata) bahkan sangat disenangi oleh serangga

vektor D. citri dan menunjukkan gejala serangan penyakit CVPD lebih cepat

dibandingkan dengan tanaman lainnya. Sehingga kemuning banyak digunakan

sebagai tanaman indikator dan tanaman yang digunakan untuk memelihara

serangga vektor D. citri.

17

Tahap-Tahap Prosedur Isolasi Gen Resisten Penyakit CVPD

a. Uji ketahanan tanaman jeruk kinkit dan karatachi serta tanaman jeruk

budidaya (siem dan keprok) terhadap serangan penyakit CVPD dengan cara

penularan mengunakan serangga vektor D. citri

b. Deteksi PCR untuk memastikan serangan penyakit CVPD pada tanaman

yang diuji.

c. Jeruk kinkit dan karatachi dipilih sebagai tanaman yang toleran terhadap

serangan penyakit CVPD (CVPDr)

d. Transformasi genetik secara in vitro atau in planta pada tanaman jeruk

kinkit dan karatachi

e. Seleksi transforman (tanaman yang termutasi)

f. Uji ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD untuk tanaman-tanaman

termutasi (transforman)

g. Seleksi yang menjadi peka terhadap serangan penyakit CVPD (CVPDr-s)

h. Inverse PCR (IPCR) untuk isolasi flanking DNA termutasi dari mutan

tanaman jeruk kinkit CVPDr-s .

i. Kloning produk IPCR (flanking DNA termutasi) pada vektor plasmid

j. Sekuen fragmen DNA produk IPCR

k. Formulasi primer untuk deteksi wild type target DNA yang mengandung

gen untuk ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD

l. Deteksi dan isolasi serta kloning wild type target DNA yang mengandung

gen untuk ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD

m. Analisis sekuen klon wild type target DNA yang mengandung gen untuk

ketahanan terhadap serangan penyakit CVPD dan penentuan ORF (open

reading frame) dari gen gen untuk ketahanan terhadap serangan penyakit

CVPD (gen CVPDr)

n. Over expression (produksi protein) gen CVPDr pada sel Escherichia coli

o. Analisis fungsi protein yang dihasilkan oleh gen CVPDr dalam mekanisme

ketahanan tanaman terhadap serangan penyakit CVPD

p. Pembuatan tanaman jeruk transgenik menggunakan gen CVPDr

q. Uji ketahanan tanaman jeruk transgenik dengan gen CVPDr terhadap

serangan penyakit CVPD

18

III. Transformasi Genetik Tanaman Jeruk Tahan CVPD

1. Bakteri dan Kondisi Biakan

Bakteri dan plasmid, yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai

berikut; Bakteri Escherichia coli HB 101 digunakan untuk membawa plasmid

pRK2013, suatu helper plasmid yang digunakan dalam proses konjugasi

triparental mating (Wirawan and Kojima, 1996). Agrobacterium tumefaciens

strain LBA 4404 dengan binary Ti plasmid, pAL4404 dan pBI121 atau pMW24

digunakan dalam transformasi genetik tanaman jeruk kinkit dan karatachi. Bakteri

dipelihara pada LB, YEB atau AB minimal media. Konsentasi antibiotik yang

digunakan dalam media (mg/liter) adalah sebagai berikut; kanamisin (100),

ampisilin (50) dan karbenisilin (500) (Kang, et al, 1992; Kang, et al, 1994).

2. Transformasi Genetik Melalui Kultur in vitro

Bagian tanaman (explant) jeruk kinkit atau karatachi yang digunakan adalah

potongan daun, potongan batang (internode stem), potongan buah muda

(immature fruit), biji dan potongan kecambah steril. Media yang digunakan dalam

kultur jaringan ini adalah media LS, MTO+ atau MSO+ (untuk penumbuhan

kalus) dan media MS104 atau MTOK (untuk penumbuhan shoot/ perbanyakan)

dengan 0,4 % agar. Untuk menumbuhkan akar digunakan rooting media yang

merupakan media MSO dengan 0,3 % agar dan dengan kanamisin dan

karbelisilin. Sedangkan jenis agar yang digunakan dalam penelitian ini adalah

Gellum Gum agar.

Bagian tanaman yang masih segar pertama-tama dicuci dengan aquades,

kemudian direndam pada larutan sodium hipokhlorida 5 % dan 1 % masing-

masing secara berurutan selama 5 menit. Setelah itu potongan tanaman ini dicuci

dalam aquades steril sebanyak 3 kali. Air yang masih melekat pada bagian

tanaman tersebut dihilangkan dengan cara menempelkannya pada kertas tissue

steril. Setelah cukup kering bagian tanaman tersebut dipotong-potong. Untuk ruas

batang (internode stem) dan daun potongan dibuat sangat pendek yaitu antara 0,2

– 0,5 cm. Sedangkan untuk buah muda (immature fruit), satu buah dapat dibagi

menjadi 3 – 4 potongan. Untuk eksplan dari kecambah steril tidak dilakukan

19

sterilisasi lagi. Setelah dilakukan inokulasi dengan A. tumefaciens strain LBA

(pAL4404, pBI121 atau LBA (pAL4404, pMW24) potongan-potongan tanaman

tersebut ditaruh/ditanam pada media yang sesuai dalam botol.

3. Transformasi Genetik secara in planta

Dengan metode ini bibit tanaman dikecambahkan dari biji. Inokulasi

dapat dilakukan melalui embryo biji atau melalui pucuk kecambah tanaman jeruk

kinkit atau karatachi atau nipis tanpa biji. Transformasi melalui embryo

dilakukan dengan menyuntikkan atau melukai embryo dengan jarum suntik lalu

diolesi dengan A. tumefaciens strain LBA (pAL4404, pBI121 atau LBA

(pAL4404, pMW24) yang dikultur pada media LB agar dengan kanamisin 100

ppm. Biji yang telah diinokulasi ditanam pada media tanah steril dan dipelihara

dalam rumah kaca. Transformasi melalui meristem tunas, dilakukan dengan

memotong pucuk muda tunas atau kecambah yang ditanam pada media tanah

steril, lalu pada ujung tanaman yang telah terpotong tersebut diolesi dengan A.

tumefaciens strain LBA (pAL4404, pBI121 atau LBA (pAL4404, pMW24) yang

dikultur pada media LB agar dengan kanamisin 100 ppm. Tanaman yang telah

diinokulasi dipelihara dalam rumah kaca untuk dilakukan pengamatan dan seleksi

transforman. Transformasi genetik dengan sistem in planta, menghasilkan

tanaman transforman yang sebagian besar adalah chimera (tidak seluruh sel atau

jaringan tertransformasi).

4. Mekanisme transformasi genetik A. tumefaciens

Plasmid pBI121, pIG121 atau pMW24 yang dipelihara dalam sel A.

tumefaciens 4404 (pAL4404) digunakan untuk mentransformasi sel-sel tanaman

jeruk kinkit atau karatachi. Mekanisme tingkat molekul proses transfer gen

dengan vektor A. tumefaciens dapat diringkas sebagai berikut; fragmen DNA

NptII-GUS akan terpotong menjadi DNA satu rantai (ssDNA) yang kemudian

pada ujung 5’ dari ssDNA tersebut berikatan protein VirD2 dan protein VirE2

menjadi selubungnya (coat protein). Kompleks DNA-protein ini disebut T-

komplek yang akan bergerak dan pada periplasma protein AcvB akan berikatan

20

pada komplek ini dan mentransfernya keluar sel A. tumefaciens dan masuk ke

dalam sel tanaman.

Fragmen NptII-GUS berintegrasi ke dalam genom sel tanaman sehingga tanaman

transgenik ini dapat tumbuh pada media dengan kanamisin dan ekspresi gen GUS

juga dapat dideteksi dari tanaman transgenik ini.

Plasmid pMW24 mempunyai konstruksi yang sama dengan pBI121, tetapi

gen GUS pada pBI121 diganti dengan gen acvB. Keberadaan gen acvB ini

diperlukan untuk meningkatkan frekuensi transformasi, karena protein AcvB

berperan dalam proses transfer DNA ke dalam sel tanaman.

5. Tahapan Kerja Transformasi in vitro

Transformasi tanaman jeruk kinkit dilakukan sebagaimana berikut. Sel-sel

A. tumefaciens yang dikultur selama 18 jam pada media LB atau AB (cair) dengan

kanamisin 100 ppm dipanen dengan sentrifuge, kemudian sel-sel bakteri ini dicuci

3 kali menggunakan media MS cair (steril). Sel-sel bakteri ini kemudian

disuspensi dalam media MS cair dan siap digunakan untuk mentransformasi sel-

sel tanaman jeruk kinkit atau karatachi pada media. Inokulasi bagian-bagian

tanaman jeruk kinkit atau karatachi sebagaimana dijelaskan diatas dapat dilakukan

dengan dua cara yaitu ; 1. dengan merendam selama 5 – 10 menit potongan-

potongan tanaman tersebut dalam suspensi Agrobacterium sebelum ditempatkan

pada media kultur jaringan, atau, 2. dengan menempatkan terlebih dahulu

potongan-potongan tanaman tersebut ke dalam media kemudian bagian tanaman

yang terpotong ditetesi 2 – 3 tetes suspensi A. tumefaciens menggunakan jarum

suntik (syringe).

Inokulasi juga dilakukan menggunakan kultur padat A. tumefaciens, LBA

(pAL4404, pBI121 atau LBA (pAL4404, pMW24). Biakan bakteri pada media

padat ini diambil menggunakan tusuk gigi steril lalu dioleskan pada ujung

potongan atau bagian eksplan yang dilukai.

Eksplan yang telah diinokulasi ditanam pada media (dalam botol) kemudian

dipelihara pada suhu 25 – 28 0C dan 16 jam penerangan dengan cool-white

fluorescent light (Gynheung, 1985; Moore, et al, 1992). Setelah 5 – 7 hari

potongan-potongan tanaman yang tetap hijau dipindahkan ke media yang

21

mengandung kanamisin 100 ppm untuk menseleksi sel-sel yang tertransformasi

dan karbenisilin 500 ppm untuk mencegah pertumbuhan vektor Agrobacterium

pada media. Pertumbuhan kalus dan atau shoot diamati secara periodik sampai

beberapa minggu.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa eksplant dari potongan buah muda,

hanya sanggup membentuk kalus dengan tingkat keberhasilan yang sangat rendah.

Kalus yang dihasilkan ini tidak dapat bermultiplikasi membentuk tunas (shoot).

Sedangkan eksplant dari potongan kecambah steril (internode stem), merupakan

eksplant terbaik untuk menghasilkan tunas atau kalus, dan kegagalan karena

kontaminasi sangat kecil.

Media terbaik untuk pertumbuhan tunas adalah MTOK, dan untuk

pertumbuhan kalus adalah MTO+ atau MSO+. Eksplant yang ditanam pada media

MTOK, umumnya membentuk kalus (pada minggu 1-2) dan kemudian dari kalus

ini akan tumbuh tunas yang banyak (bergerombol). Untuk eksplant yang

ditransformasi dengan A. tumefaciens, seleksi transforman akan baik dilakukan

setelah pertumbuhan tunas ini. Tunas yang tumbuh bergerombol tersebut,

kemudian ditanam secara individu pada media MTOK dengan 100 ppm

kanamisin. Tunas yang bertahan tumbuh adalah tunas yang yang telah mengalami

transformasi (transforman). Tunas tanaman jeruk yang dihasilkan kemudian

secara bertahap dipindahkan dan dipelihara dalam media tanah steril untuk

kemudian diuji ketahanannya terhadap serangan penyakit CVPD. Tanaman yang

menunjukkan gejala serangan CVPD kemudian diseleksi dan akan dilakukan

analisis lanjutan yaitu dengan analisis PCR untuk mendeteksi keberadaan patogen

CVPD pada tanaman yang menunjukkan gejala tersebut.

6. Analisis Jaringan Transforman

Shoot yang dihasilkan dari kultur jaringan yang telah diseleksi

menggunakan media yang mengandung kanamisin 100 ppm diuji lebih lanjut

apakah telah benar-benar tertransformasi oleh fragmen DNA dari plasmid pBI121

atau pMW24. Pengujian ini dikerjakan baik dengan cara uji aktivitas gen GUS

maupun uji PCR dengan mengamplifikasi fragmen DNA gen GUS (1,3 kb)

22

menggunakan DNA template yang diisolasi dari daun atau potongan shoot yang

telah digunakan dalam uji aktivitas gen GUS sebelumnya.

Adapun uji aktifitas gen GUS dikerjakan sebagai berikut; Ujung batang

shoot yang dihasilkan dipotong pendek kemudian segera ditempatkan dalam

microtiter plate yang berisi 23 µl pewarna 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-

glucuronide (1 mg/ml) dalam buffer 0,1 M NaPO4, pH 7,0 dengan 10 mM

Na2EDTA pada setiap wellnya (Jefferson, 1987). Potongan shoot ini direndam

selama 4 – 5 jam pada suhu 37 0C sebab perendaman yang lebih lama akan

menghasilkan banyak kesalahan hasil. Jaringan tanaman ini kemudian dicuci

dengan 100 µl campuran 95 % etanol dan asam asetat (3:1, v/v). Bagian-bagian

yang mengandung aktivitas gen GUS akan terlihat dengan jelas. Sebagai kontrol

negatif digunakan jaringan yang tidak ditransformasi.

Bagian tanaman yang tidak diinokulasi dengan Agrobacterium (non-

transformed plant) kenyataannya tidak dapat tumbuh membentuk kalus atau shoot

pada media dengan kanamisin, atau kalaupun shoot dapat tumbuh tetapi tidak

dapat bertahan lama dan kemudian mati. Pada tanaman jeruk kinkit untuk lebih

memberikan bukti bahwa shoot yang dihasilkan benar-benar transformed shoot,

dilakukan uji lanjutan yaitu uji aktifitas enzim -glucuronidase (GUS).

Ditemukan 63.8 % shoot menunjukkan aktifitas enzim -glucuronidase (GUS+).

Menurut Jordan and McHughen, 1988, banyaknya shoot atau tanaman yang

tahap hidup pada media dengan kanamisin dapat disebabkan oleh adanya proteksi

dari transformed sel kepada non-transformed sel sehingga sel-sel non-transformed

dapat tumbuh pada media dengan kanamisin. Hal lain yang kami pikirkan adalah

adanya kemungkinan sel-sel bakteri vektor (A. tumefaciens) yang masih bertahan

hidup pada media yang dapat menginaktifkan kanamisin pada media, sehingga

non-transformed sel dapat tumbuh.

Beberapa tanaman yang menunjukkan aktivitas GUS+ dianalisis lebih lanjut

dengan PCR menggunakan sekuen gen GUS sebagai primer. Hasil penelitian ini

menunjukkan bahwa semua tanaman yang diuji, positif mengandung gen GUS

yang berarti bahwa semua tanaman yang diuji adalah tanaman yang telah

tertransformasi (transformed plants). Tanaman tranforman yang dihasilkan secara

bertahap ditanam di pot dengan media tanah steril untuk kemudian dipelihara

23

dalam rumah kaca dan siap untuk diuji ketahanannya terhadap serangan penyakit

CVPD.

IV. Uji Ketahanan Tanaman Transforman terhadap Serangan

Penyakit CVPDUji ketahanan tanaman transforman terhadap serangan penyakit CVPD

dilakukan untuk menyeleksi tanaman transforman jeruk kinkit yang berubah

menjadi peka terhadap CVPD atau disebut tanaman CVPDr-s. Tanaman CVPDr-s

menunjukkan bahwa tanaman tersebut telah termutasi pada gen yang berperan

dalam ketahanan tanaman terhadap penyakit CVPD. Sehingga untuk

mendapatkan gen tahan penyakit CVPD (gen CVPDr) dapat dilakukan dengan

mengisolasi fragmen DNA yang termutasi pada tanaman CVPDr-s.

Uji ketahanan tanaman transforman terhadap serangan penyakit CVPD

dilakukan dengan penularan penyakit CVPD menggunakan serangga vector D.

citri. Tanaman diletakkan dalam kurungan dan diberikan beberapa ekor serangga

vector yang infektif (yang mengandung bakteri penyebab penyakit CVPD).

Pengamatan dilakukan selama 6-12 bulan.

Pengamatan terhadap 767 tanaman transforman yang diuji ketahanannya

terhadap CVPD, ditemukan ada 2 tanaman yang menunjukkan gejala yang sangat

mirip gejala serangan penyakit CVPD. Analisis PCR yang dilakukan terhadap

gejala serangan ini menunjukkan hasil yang positif, artinya tanaman transforman

jeruk kinkit ini memang terserang penyakit CVPD. Analisis PCR terhadap gejala

serangan ini dilakukan 2-3 kali untuk lebih meyakinkan dan mendapatkan

konsistensi hasil sambil menunggu tanaman menjadi lebih besar. Hasil

pengulangan ini menunjukkan bahwa gejala serangan penyakit yang diamati

memang benar serangan penyakit CVPD. Tanaman terebut kemudian dianalisis

lebih lanjut guna mengisolasi fragmen DNA termutasi.

V. Isolasi fragmen DNA termutasi dengan metode Inversed PCRFragmen DNA pemutasi, NptII-GUS, dari plasmid pBI121 yang terselip

ke dalam genom mutan tanaman CVPDr-s dilacak dengan metode IPCR

menggunakan sekuen dari fragmen NptII-GUS sebagai primernya. Primer yang

24

digunakan dalam penelitian ini adalah primer yang pernah kami gunakan pada

penelitian menggunakan tanaman Kalanchoe (cocor bebek) dan mulbery yang

dapat berhasil dengan baik. Sekuen primernya adalah sebagai berikut ;

F : 5’-AGA GGC TAT TCG GCT ATG AC -3’

R : 5’-GAT AGT GAC CTT AGG CGA CT -3’.

Total DNA diisolasi dari bagian tanaman CVPDr-s yang telah

dikonfirmasi seperti di atas. DNA ini kemudian dipotong dengan endonuklease

yang sitenya tidak terdapat pada fragmen NptII-GUS (pada penelitian ini

digunakan EcoRI). Setelah itu dilakukan “self ligation” terhadap potongan-

potongan DNA tersebut sehingga didapatkan berbagai ukuran DNA sirkular.

Salah satunya adalah potongan DNA yang membawa fragmen NptII-GUS.

Tahap selanjutnya dilakukan amplifikasi DNA yang membawa fragmen NptII-

GUS dengan IPCR menggunakan primer seperti tersebut di atas. Dengan teknik

IPCR ini pembacaan terjadi secara terbalik yaitu mengarah keluar dari fragmen

NptII-GUS sehingga amplifikasi akan menghasilkan flanking DNA dari tanaman

CVPDr (jeruk kinkit) dengan hanya fragmen kecil DNA dari sekuen NptII-GUS.

VI. Strategi Pengklonan (cloning strategy)Fragmen DNA yang teramplifikasi yang mengandung flanking DNA

dari tanaman CVPDr (jeruk kinkit) dengan fragmen kecil DNA dari sekuen NptII-

GUS kemudian diklon pada plasmid pUC18. Strategi pengklonannya dilakukan

sebagai berikut; Pertama, dilakukan kharakterisasi terhadap sisi pemotongan

endonuklease (endonuclease restriction site) pada fragmen tersebut. Pada

penelitian ini digunakan EcoRI, BamHI, dan Sac I. Pemotongan dengan Sac I

ternyata memberikan fragmen ini relatif utuh (fragmen terpanjang, sehingga

pengklonannya pada vektor plasmid pUC18 dilakukan pada sisi pemotongan SacI.

Ligasi (penyambungan fragmen DNA) dilakukan pada suhu 16 0C

selama 2 jam - overnight menggunakan enzim ligase (produk Takara).

Transformasi dilakukan dengan menggunakan compitent cell, Escherichia coli

JM109. Sebanyak 5 µl DNA yang telah diligasi, dicampurkan ke dalam 100 µl

compitent cell kemudian ditaruh dalam air-es selama 30 menit, lalu diinkubasi

pada suhu 42 0C selama 45 detik sebelum ditambahkan 1 ml media SOC.

25

Kemudian campuran ini diinkubasi pada suhu 37 0C selama 1 jam, untuk

selanjutnya dikultur pada media LB agar yang mengandung 50 ppm ampisilin.

VII. Deteksi dan Isolasi wild type target DNA (Gen CVPDr )Deteksi dan isolasi fragmen wild type target DNA serta konfirmasinya

dilakukan dengan metode PCR menggunakan primer yang dibuat berdasarkan

sekuen partial dari flanking DNA yang telah diisolasi sebelumnya. Berdasarkan

sekuen flanking DNA ini dirumuskan tiga sekuen primer yang disebut; primer 1,

primer 2, dan primer 3. Total DNA dari tanaman induk, diisolasi kemudian

dilakukan analisis PCR.

Program PCR yang digunakan adalah sebagai berikut; Denaturation pada

suhu 94 0C selama 30 detik, annealing pada suhu 60 0C selama 30 detik dan

extention pada suhu 72 0C selama 90 detik serta menggunakan siklus ulangan 26

kali. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik dapat dilakukan pengulangan

setelah selesai satu tahap program (double PCR).

Menggunakan ketiga primer tersebut diatas dihasilkan tiga produk PCR

dengan ukuran yang berbeda, yaitu masing-masing 700 bp, 1100bp dan 841 bp.

Penelitian ini juga menemukan bahwa tanaman jeruk keprok Tejakula tidak

mengandung ke tiga fragmen DNA tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa gen

untuk ketahanan terhadap CVPD tidak terdapat pada jeruk Tejakula

VIII. Hibridisasi Southern BlotKonfirmasi terhadap produk PCR di atas dilakukan menggunakan

metode Southern Blot. Semula cara ini direncanakan sebagai alternatif cara

isolasi wild-type target DNA dari tanaman CVPDr (kinkit) namun kemudian

diyakini perlu dilakukan untuk konfirmasi terhadap hasil yang telah diperoleh

menggunakan metode PCR. Fragmen DNA, potongan EcoRI dari flanking DNA

atau produk PCR di atas, dilabel dengan 32P digunakan sebagai probe untuk

mendeteksi keberadaan fragmen tersebut pada tanaman induk (kinkit dan

karatachi). Total DNA dari ke dua tanaman induk , kinkit dan karatachi, diisolasi,

kemudian dipotong menggunakan EcoRI, lalu fragmen-fragmen DNA yang

dihasilkan dipisahkan pada elektroforesis agarose gel, dan kemudian diblot

26

dengan membran nylon menggunakan sistem Southern blotting, selama 16 jam

atau overnight. Buffer yang digunakan dalam blotting ini adalah buffer SSC

(Sambrook, et al, 1989) .

Blotting total DNA dari ke dua tanaman induk , kinkit dan karatachi,

terhibridisasi oleh DNA probe yang digunakan, dan menunjukkan hibridisasi

band yang sangat jelas. Sedangkan sampel DNA dari tanaman jeruk keprok

Tejakula tidak terhibridisasi. Hal ini menunjukkan bahwa jeruk keprok Tejakula

tidak mengandung fragmen DNA yang berhubungan dengan ketahanan tanaman

terhadap serangan penyakit CVPD. Hasil penelitian ini sekaligus mengkonfirmasi

hasil penelitian menggunakan analisis PCR.

IX. Overekspresi (produksi protein) pada Sel Escherichia coli dan

Pembuatan Tanaman Jeruk TransgenikSekuen DNA terhadap fragmen 1100 bp yang dihasilkan tidak dapat

menentukan adanya Open Reading Frame (ORF) yang meyakinkan, sehingga

diupayakan untuk mendapatkan fragmen DNA yang lebih panjang. Penelitian

menggunakan teknik running primer dan dikombinasikan dengan teknik Southern

Blotting telah berhasil diisolasi fragmen DNA dengan ukuran 2500 bp. Fragmen

DNA ini kemudian diklon dalam plasmid vektor pT7 Blue pada sisi pengklonan

NdeI. Dua ORF ditemukan setelah fragmen DNA 2500 bp ini disekuen. Klon

fragmen DNA 2500 bp dengan dua ORF ini pada plasmid vector pT7 Blue diberi

nama pWR27 yang telah didaftarkan Hak Patennya di Ditjen HKI melalui

Program Oleh Paten Kementerian Riset dan Teknologi RI, atas nama I Gede Putu

Wirawan.

Uji overekspresi klon DNA ini dalam sel E. coli menghasil dua molekul

protein dengan ukuran 17 dan 20 kDa. Penemuan ini menunjukkan bahwa ke dua

ORF yang ditemukan pada sekuen DNA yang diklon adalah dua buah gen yang

aktif dan berperan dalam mekanisme ketahanan tanaman jeruk terhadap serangan

penyakit CVPD.

Fragmen DNA yang membawa gen diklon ulang (subklon) pada plasmid

vektor biner pBI121 dan dimasukkan kedalam sel Agrobacterium tumefaciens

strain LBA4404 dengan metode triparental mating. A. tumefaciens merupakan

27

bakteri Gram negatif yang sangat baik digunakan sebagai vektor dalam membawa

gen atau fragmen DNA tertentu ke dalam genom tanaman. Setelah klon ini berada

dalam sel A. tumefaciens maka transformasi genetik ke dalam sel tanaman jeruk

komersial (jeruk keprok atau siem atau lainnya) dapat dilakukan. Transformasi

genetik untuk menghasilkan tanaman jeruk transgenik tahan penyakit CVPD

dapat dilakukan dengan berbagai metode baik melalui kultur in vitro (kultur

jaringan) maupun melalui metode in planta. Transformasi in planta dapat

dilakukan dengan menginokulasi mata tunas yang tumbuh pada pembibitan

dengan sistem grafting (penempelan). Sebagian tanaman transgenik yang

dihasilkan akan berifat chimera, yaitu tidak keseluruhan bagian tanaman

tertransformasi. Tetapi cara in planta ini sangat sederhana, murah dan dengan

keberhasilan yang cukup tinggi (lebih dari 17 %).

28