LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

ISOLASI DNA

Nama

: Gerry P.A. Hasni

NIM

: 125040200111047

Kelompok : Selasa, 15.00 minggu kedua

Asisten : Dika Chiqmatul Janah

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2013BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam proses isolasi DNA tanaman, keberadaan polisacharida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam proses isolasi asam nukleat. Struktur polisacharida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisacharida tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat. Penambahan senyawa pereduksi seperti marchaptoetanol dan dithiothreitol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat.

Metabolit sekunder dan polisacharida juga dapat menghambat kerja enzim. Adanya polosacharida dalam tanaman ditandai dengan kekentalan pada hasil isolasi DNA yang menyebabkan kesulitan dalam reaksi PCR akibat penghambatan aktivitas Taq polymerase. Oleh karena itu diperlukan suatu teknik isolasi DNA genom tanaman yang tepat sehingga diperoleh kualitas DNA yang baik bagi proses amplifikasi PCR.Setiap tanaman pasti memiliki DNA dan DNA merupakan molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. Dalam DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida.

DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.

isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA.1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum isolasi DNA adalah sebagai berikut :

Untuk mengetahui definisi isolasi DNA Untuk mengetahui faktor penentu keberhasilan dari isolasi DNA kasar Untuk mengetahui tahapan isolasi DNA kasar dengan benar.1.3 Manfaat

Untuk mengetahui cara mengisolasi DNA yang benar dari buah-buahan atau tumbuhan, dan mengetahui keefektifan deterjen dan buah yang dipakai yang di gunakan dalam percobaan isolasi DNA.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Isolasi DNA

isolasi DNA merupakan kegiatan yang dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA.

(Jamilah, 2005)DNA isolationis a process of purification of DNA from sample using a combination of physical and chemical methods.Isolasi DNA adalah proses purifikasi DNA dari sampel dengan menggunakan kombinasi metode fisik dan kimia.(Wikipedia, 2012)2.2 Macam Metode Isolasi DNA

A. Metode CTAB

Pada proses isolasi dengan metode CTAB dilakukan pembuatan bufer lisis (yang terdiri atas 0,2 M Tris-Cl pH 7,5 ; 0,05M EDTA pH 8,0 ; 2 M NaCl ; 2 % CTAB) dan bufer ekstraksi (terdiri dari 0,35 M sorbitol ; 0,1 M Tris-Cl pH 7,5 ; 5 mM EDTA ; dH2O). Potongan daun dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah didinginkan dalam es, kemudian daun digerus dengan bantuan nitrogen cair. Setelah itu ditambahkan bufer isolasi DNA (campuran bufer lisis, bufer ekstraksi dan sarcocyl). Suspensi divortex sampai tercampur merata, kemudian diinkubasi selama 1 jam, pada suhu 65o C. Setelah 1 jam ditambah 750 l kloroform - isoamil alkohol (24 : 1). Setelah homogen larutan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, 40 C, lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan larutan isopropanol dan divortex perlahan. Sentrifugasi dilakukan selama 5 menit, 12.000 rpm, pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang. Pelet dicuci menggunakan 500 l EtOH 70 %, kemudian disentrifugasi 12.000 rpm, 3 menit dan supernatan dibuang. Sentrifugasi dilakukan kembali dengan kecepatan 12.000 rpm, 1 menit, kemudian supernatan dibuang dengan mikropipet. Pelet dikeringkan dan dilarutkan dengan 50 l TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada suhu -200 C.

(Fauziah, 2010)B. Metode CTAB

DNA genomik jarak pagar diisolasi dengan menggunakan 200 mg daun, yang dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan digerus dengan bantuan nitrogen cair. Ke dalam tabung ditambahkan 750 l bufer ekstraksi CTAB. Campuran tersebut divorteks lalu diinkubasi dalam pemanas air selama 60 menit pada suhu 650 C. Setelah dibiarkan dingin hingga suhu kamar, campuran tersebut ditambahkan dengan 750 l kloroform - isoamil alkohol ( 24 : 1 ). Campuran disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 40C. Lapisan atas dimasukkan ke dalam tabung eppendorft lain yang mengandung isopropanol dan dicampur merata. Setelah disentrifugasi selama 10 menit 11.000 rpm, endapan DNA dicuci dengan menambahkan etanol 76 % dan dikeringkan. Endapan DNA yang telah kering dilarutkan dalam 25 l bufer TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 ; 1 mM EDTA pH 8,0). DNA disimpan pada suhu -200 C. (Fauziah, 2010)C. Metode SDS

Pada pemakaian metode ekstraksi sebelum berlangsungnya proses isolasi DNA dilakukan pembuatan bufer pengekstrak yang terdiri atas 25 mM EDTA (pH 7,5), 50 mM TrisHCl (pH 8), 300 mM NaCl, SDS 1% dan H2O. Potongan daun tanaman jarak pagar dimasukkan tabung 1,5 ml yang telah didinginkan dalam es, kemudian digerus dengan menambahkan 400 ul buffer pengekstrak. Setelah cukup halus ditambahkan 100 ul buffer pengekstrak. Setelah itu diambil 400 ul larutan dan ditambah dengan 400 ul chloroform. Suspensi divortex sampai tercampur merata, kemudian dan setelah homogen larutan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 40C. Lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan 800 l Etabol absilut. Larutan disentrifugasi selama 3 menit, 13.000 rpm, pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang. Pelet dicuci kembali dengan menggunakan 500 l EtOH 70 %. Supernatan dibuang, kemudian endapan dicuci kembali dengan etanol 70%, dan disentrifugasi 13.000 rpm, pada suhu 40C Zheng et al (1995).

Supernatan dibuang kembali, dan pelet dikeringkan dengan menggunakan vakum. Setelah kering, pelet ditambah dengan 50 ul TE dan DNA disimpan pada suhu -200C.(Fauziah, 2010)Hasil isolasi DNA dengan berbagai teknik tersebut kemudian dielektroforesis pada 0,8% gel agarosa pada kondisi 50V selama 30 menit. Deteksi dilakukan menggunakan UV transluminator dan dilakukan pemotretan gell.(Fauziah, 2010)2.3 Tahap Isolasi DNAAda 5 (lima) tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu:

1. Isolasi jaringan Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.2. Pelisisan dinding dan membran sel Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada di dalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi. 3. Pengekstraksian dalam larutanSelanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak. 4. PurifikasiTahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

5. Presipitasi Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Istanti, 1999)

2.4 Manfaat Isolasi DNAa. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.b. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southernc. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.d. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNAe. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR. (Arumingtyas, 2012)

BAB III

METODOLOGI3.1 Alat dan Bahan

Alat :

Mortar

: untuk menghaluskan bahan

Pistil

: untuk menghaluskan bahan

Tabung Reaksi: untuk mengamati reaksi

Spatula

: untuk mengambil bahan

Beker glass

: untuk tempat mencampur

deterjen, garam,ekstrak mangga,

serta etanol

Gelas ukur

: untuk mengukur volume larutan

yang digunakan

Pipet

: untuk mengambil larutan

Cutter/Pisau

: untuk memotong mangga

Timbangan Analitik: untuk menimbang bahan

Rak tabung reaksi: untuk meletakkan tabungBahan :

Mangga

: objek pengamatan

Aquades

: sebagai pelarut

Garam

: untuk memisahkan benang-

benang DNA

Etanol dingin: untuk melihat DNA mangga

berupa benang halus putih

Deterjen bubuk: untuk melihat kemampuan

merusak sel

Deterjen cair: untuk melihat kemampuan

merusak sel

Deterjen krim: untuk melihat kemampuan

merusak sel3.2 Langkah Kerja

Timbang mangga 3 x 5 gram

Dihaluskan dengan mortar

Dimasukkan ke dalam gelas beker

Tambah aquades 50 mL

Tambah garam dan detergen

dengan perbandingan 2,5 gram : 2,5 gram

Aduk hingga homogen

Diamkan 15 menit

Ekstrak bahan

Ambil dengan pipet @5 mL

Tabung Reaksi

Tambahkan Etanol dingin

Amati gumpalan berupa benang-benang putih

3.3 Analisa Perlakuan

Dalam peraktikum isolasi DNA kasar Penggunaan deterjen berfungsi untuk melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler ynag dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa "memakan" DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang sama dengan dodesil sulfat.

Kegunaan garam memegang peranan penting yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lysing buffer.

Dalam praktikum juga menggunakan Garam digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan denagn kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul. Jadi nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA. Dan penggunaan Etanol dingin berfungsi untuk pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam, karena kerapatan etanol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka etanol akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di atas filtrat.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Hasil (DNA Terlihat/tidak + dokumentasi hasil)DNAKeterangan

Bayam 1, DNA tidak terlihat

Bayam 2, DNA tidak terlihat

4.2 Pembahasan

Dalam DNA bayam yang pertama tidak terlihat dan bayam kedua juga tidak terlihat ini diakibatkan karena kesalahan prosedur pada waktu pembuatan, pada sawi pertama terlihat DNAnya tetapi pada sawi yang kedua tidak terlihat. Hal hal yang mengakibatkan tidak terlihatnya DNA adalah karena kesalahan prosedur pada awal pembuatan. Dalam praktikum juga menggunakan Garam digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan denagn kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul. Jadi nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA. Dan penggunaan Etanol dingin berfungsi untuk pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam, karena kerapatan etanol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka etanol akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di atas filtrat. Hal ini sesuai dengan literatur yang mengatakan biasanya, teknik isolasi DNA untuk tanaman tahunan memerlukan perlakuan khusus seperti penggunaan nitrogen cair untuk membantu menghancurkan jaringan, penyimpanan sampel daun di ruang gelap atau ditutup kertas aluminium foil selama beberapa jam sampai satu malam (over night). (Syafarudin,2011)V PENUTUP

5.1 KesimpulanUntuk praktikum isolasi DNA yang dilakukan dengan mengunakan daging mangga arum manis yang di kupas dan di ambil dagingnya kemudian di haluskan dan di ketahui DNA nya secara kasar, diketahui pula bahwa jenis detergen berpenuh terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen tertentu memberikan pengaruh paling baik terhadap jenis buah tertentu pula dengan kadar air berbeda. Dari data dapat diketahui bahwa deterjen bubuk memiliki kemampuan merusak membran sel yang paling tinggi dibandingkan dengan deterjen krim dan deterjen cair. Hal tersebut ditandai dengan banyaknya benang-benang berwarna putih yang muncul dari larutan buah mangga dan aquades tersebut jadi dapat disimpulkan bahwa penggunaan deterjen sanggat mempengaruhi hasil isolasi DNA kasar.

5.2 Saran

Praktikum : Untuk praktikum isolasi DNA sudah baik, tapi alangkah baiknya alat dan bahan praktikum di perbanyak sehingga mahasiswa semua dapat praktikum satu persatu dengan lebih jelas dan detail.

DAFTAR PUSTAKA

Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan

Fauziah, L. 2013. Isolasi DNA. Available on http://miss-purplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 11 Desember 2013.

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Prtogram Sarjana Biologi.Mustahib. 2013. . Metode - Metode Isolasi DNA. http://biologi.blogsome.com/2012/02/11/isolasi-dna-metode-kitchen-preparation/. Diakses tanggal 11 Desember 2013. Syafarudin, 2011. Optimasi Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA yang Efisien dan Efektif pada Kemiri Sunan (Reutalis trisperma (Blanco) Airy Shaw). Jurnal Littri 17(1), Maret 2011. Hlm. 11 17. ISSN 0853-8212.Wikipedia, 2013. DNA Extraction. http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_extraction. Diakses pada tanggal 11 Desember 2013.DOKUMENTASI