LAPORAN SMEST4-MIKFARLAPORAN RESMIPRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI“PEWARNAAN SEDERHANA”Disusun oleh :Kelompok : AMskur Yusup (17113118A)Dinda Nur M (17113117A)Galau M E B P M (17113120A)Vini Karus S (17113246A)FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SETIA BUDISURAKARTA2012I. TOPIKPewarnaan Sederhana (pewarnaan positif dan negatif)II. ALAT DAN BAHANALAT : Objek glassJarum inokulum / osePembakar spirtusMikroskop monokularTabung reaksiPipet tetesRak tabung reaksiBAHAN : Kultur bakteri (Bacillus,Tetracoccus,Providencia,Staphyllococcus)AquadestSpirtusPewarnamethylen blue,safranin, kristal violetKapasXylolMinyak imersiTinta cinaIII. CARA KERJAPewarnaan positif1. Bersihkan obyek glassdengan kapas2. Jika perlu tulislah kode nama bakteri pada sudu objek glass3. Panaskan ose diatas api hingga membara4. Putar kapas penutup tabung aquadest sebelum membuka tabung reaksi dan kemudian tarik kapas peenutup tabung reaksi yang berisi aquadest. Setelah di buka, panaskan mulut tabung reaksi dengan api5. Ambilah aquadest dengan menggunakan ose yang telah di sterilisasi dengan api, kemudian oleskan ke tengah - tengahobjek glass, lakukan 2-3 kali6. Sebelum menutup tabung reaksi panaskan kembali mulut tabung reaksi.7. Ambilah bakteri yang telah di kultur di dalam tabung reaksi dengan cara putar kapas penutup tabung kultur bakteri sebelum membuka tabungreaksi, dan kemudian tarik kapas penutup tabung reaksi yang berisi kultur bakteri. Setelah di buka, panaskan mulut tabung reaksi dengan api. Masukan ose yang telah distirilisasi untuk mengambilbakteri dengan cara mengoleskan ke permukaan kultur bakteri dan oleskan pada objek glass, tepat diatas permukaan aquadest yangtelah diteteskan sebelumnya pada objek glass yang sama, putar dan ratakan bakteri dengan air hingga sedemikian rupa membentuk lingkaran kurang lebih berdiameter 1- 2 cm8. Fiksasi perparat yang telah diolesi bakteri tersebut di atas api sampai kering.9. Setelah benar – benarkering, genangilah objek glass yang berisi ulasan bakteri tersebut dengan cat pewarna (methylen blue, safranin, crystal violet) selama kurang lebih 30 detik10. Setelah 30 detik cucilah denggan air mengalir dan keringkanlahkembali ulasan yang masih basah di atas api.11. Amatilah ulasan dibawah mikroskop dengan perbesaran lemah, setelah fokus teteskan minyak emersi tepat diatas preparat dan ganti lensa obyektif dengan perbesaran kuat 100x.Pewarnaan negatif1. Sediaakan objek glasssebanyak 2 buah, bersihkan objek glass dengan spirtus atau alkohol supaya objek glassyang akan kita pakai terbebas dari lemak.2. Teteskan nigrosin ( tinta cina ) pada ujung kanan dari salah satu objek glass.3. Ambil ose dan kemudian sterilisasi ose tersebut dengan cara memanaskan ujung ose di api spirtus sampai membara.4. Ambilah tabung reaksiyang berisi kultur bakteri, putar terlebih dahulu sebelum menarik penutupnya, panaskan mulut dari tabung reaksi sebelum mengambil bakteri dengan ose, setelah dipanaskan ambil kultur bakteri dengan ose. Sebelum menutup panaskan kembali mulut dari tabung kultur.5. Oleskan kultur dari bakteri yang telah kita ambil dengan ose tepat pada tinta cina yang kita teteskan di ujug kanan objek glass.6. Tempelkan sisi objek glass yang lain tepat pada tinta cina dengan posisi objek glass membentuk sudut 45o.7. Geser objek glass yang kita tempelkan di atas tinta cina tersebut ke arah kiri, pastikan bahwa ada bagian yang cukup tipis dari olesan tinta tersebut agar dapat diamati dengan mudah.8. Keringkan tinta cina tersebut diatas api sehingga cepat mengering.9. Setelah kering lakukan pengamatan dengan mikroskop menggunakan perbesaran lemah 10x. Setelah tercapai titik fokus ganti lensa objektif dengan perbesaran sedang 40x.IV. DASAR TEORIMelihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri,

sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.Macam-macam pewarnaan antara lain:1. Pewarnaan sederhanaPewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi (coccus, basil, vibrio, spiral) dan susunan selnya(rantai, bergerombol, berpasangan, tetrad) Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin.· Pewarnaan negatifBakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukanuntuk bakteri yang sulit diwarnai, sepertiSpirochaeta.· Pewarnaan positifSebelum dilakukan pewarnaan positif hendaknya membuat ulasan diatas objek glass, kemudian difiksasi. Ulasan jangan terlalu tebal karena akan mempersulit mencari bakteri dalam pengamatan dengan mikroskop.2. Pewaraan diferensialPewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam (acidfast). Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur.· Pewarnaan gramPewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gramA, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.· Pewarnaan acid fastPewarnaan ini digunakan untuk membedakan bakteri yang tahan terhadap larutan asam dan yang tidak tahan terhadap larutan asam. Reagen yangdigunakan dalam pewarnaan acid fast terdiri dari cat utama, peluntur alkohol asam, dan cat lawan / tanding.3. Pewarnaan khususUntuk mewarnai struktur khusus dari bakteri seperti kapsul, spora, flagel dll· Pewarnaan kapsulPewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristalviolet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungugelap dari sel.· Pewarnaan sporaPewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijaupada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis.VI. PEMBAHASANa. Pewarnaan SederhanaPewarnaan sederhana, merupakanpewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jeniscat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmaanya bersifat basofil (suka basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, bacillus, strepto cocus dll) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yangbiasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah methylen blue, kristal violet, dan safranin.Sel-sel mikroorganisme yang tidakdiwarnai umumnya tampak hampir transparan bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat, karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dengan lingkungannya dapat dipertajam dengan mewarnai sample tersebut. Tujuan pewarnaan adalah untuk mengamati dengan lebih baik morfologi mikroorganisme secara kasar, mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme dan membantu mengidentifikasi atau membedakan mikroorganisme yang serupa.b. Pewarnaan negatifPewarnaan negatif adalah pewarnaan yang memakaibahan pulas yaitu tinta-cina (nigrosin), karena itu sering juga disebut pewarnaan tinta-cina. Pewarnaan ini dipakai untuk mengetahui adanya golongan spirochaetales dan juga untuk memperlihatkan

adanya selubung (kapsul) pada kuman-kuman yang tertentu seperti pada Diplococcus pneumoniae, Klebsiella Frielander, dll.Pewarnaan ini merupakan pewarnaan yang tidak langsung. Kita hanya mewarnai latar belakang dari bakteri tersebut, sedangkan bakterinya sendiri tidakmengambil zat-zat warna. Pada negatif staining pada umumnya tidak dilakukan ”fiksasi”, maka praktis bakteri tidak mengalami perubahan-perubahan, tidak mengerut. Dengan demikian pewarnaan negatif berguna untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya serta berguna untuk pengukuran-pengukuran bakteri.Pada pewarnaan bakteri ini sel-sel kuman kelihatan ”transparan” (terang jernih) sedangkan latar belakangnya kelihatan gelap (dengan tinta-cina).c. Pewarnaan sederhana dan negatif pada bakteri basilus,streptococus,providensia,Dalam pewarnaan sederhana yangdipergunaakan dalam praktikum, digunakan biakan bakteri yang telah dikultur dan diwarnai denganpewarna – pewarna sepertimethylen blue, safranin, dan cristalviolet. Masing – masing dari pewarna tersebut memberikan warna – warna yang berbeda, pewarnaan sederhana akan merubah warna dari bakteri sesuaidengan warna cat yang kita beri kepada bakteri tersebut.Methylenblueakan memberikan warna biru muda,safraninakan memberikan warna merah muda dancristal violetakan memberikan warna ungu pada bakteri.Dalam proses isolasi enzim untuk di diamati dan dilakukan suatu pengecatan, pastikan bahwa praktikan harus steril karena bakteri yang akan kita amati adalah bakteri yang patogen, sehingga dapat mengakibatkan terkontaminya bakteri kepada praktikan, jadi pastikan bahwa praktikan dan alat – alat yang digunakan dalam keadaan yang steril. Dalam sterilisasi praktikan sebaiknya menyemprotkan alkoholpada kedua tangan terlebih dahulu,memakai hand glove (sarung tangan) dan masker sebelum memulai praktik untuk memimalisir kontaminasi dari bakteri. Ose yang digunakan harusdipanaskan hingga membara sebelum untuk mengambil biakan bakteri, hal ini bertujuan agar bakteri yang ada di ose tersebut mati dan bakteri yang terambil dengan ose di dalam tabung kulturadalah bakteri yang sesuai. Dalam proses pengambilan bakteri usahakan dekat dengan api entah itu di depan api atau di belakang api ini bertujuan agar tidak terkontaminasi dengan bakteri yang berada di udara karena di sekitar api bakteri akan mati tetapi jagan terlalu dekat karena akan merusak struktur dari bakteri tersebut. Sebelum pengecatan lakukan fiksasi terlebih dahulu yang bertujuan agar bakteri menempel pada objek glass. Pengucuran air kran bertujuan agar lapangan pandang menjadi transparan.Dalam pewarnaan negatif kita dapat membedakan dengan pewarnaan sederhana dari segi warna yang ada, dalam pewarnaan sederhana yang berubah warna adalah bakteri tersebut dan pewarnaan negatif adalah latar belakang yang menjadi gelap, dan bakteri akan tapak seperti bintang – bintang putih transparan. Pastikan bahwa dalam pewarnaan negatif terdapat usapan yang cukup tipis sehingga dapat diamati. Pada saat pemerataan, setelah mengambil bakteri dari tabung kultur pastikan bahwa kita mengusapkan ose yang ada bakteri ke tinta cina secara merata, tujuannya adalah ketika kita mengamati bagian yangtipis dari pengecatan negatif, terdapat bakteri di tempat yang tipis tersebut.VII. KESIMPULAN· Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan sederhana dan pengecatan negativedll· Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarnasepertisafranin,kristal violet, methylen blue· Pewarnaan dari bakteri akanmemberikan penampilan baru dalam pengamatan bakteri· Sterilisasi dari alat dan praktikan sangat penting peranannya dalam pengamatan· Fiksasi adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri tidak tercuci selama prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-anginkan dua-tiga kali pada api bunsenVIII. DAFTAR PUSTAKAAnonim. 2009.http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html. Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.Ekmon, 2008.http://ekmon-

saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi- bakteri.html)Jimmo., 2008. http ://PembuatanPreParAT dannn PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht,. diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:29.http://labmikrobiologi.blogspot.com/2012/02/pewarnaan-negatif-pewarnaan-burry.htmlCampbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Erlangga. Jakarta.vhy_neydi00.