LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LANJUTPEMURNIAN ISOLAT

Nama: Mohamad Redzka Andika PutraNIM: 1127020037Kelompok: IIITanggal Praktikum: 14 April 2014Tanggal Pengumpulan: 21 April 2014Nama Dosen: Ukit Rosita, M.Si.

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGIUNVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN GUNUNG DJATI BANDUNG2014

Pemurnian Isolat

I. PendahuluanA. Tujuan Untuk mengetahui cara memurnikan isolate campuran menjadi isolate murni menggunakan metode cawan gores kuadranB. Dasar TeoriMikroorganisme terdapat dimana-mana didalam lingkungan kita mereka ada pada tubuh kita, didalam tubuh kita, dan disekeliling kita. Mereka merupakan komponen penting dalam ekosistem. Dihabitat alamiahnya, mereka hidup dalam suatu komunitas yang terdiri dari berbagai jenis mokroorganisme, bersama spesies-spesies biologi lainnya. Didalam komunitas ini, satu spesies mikroba dapat mempengaruhi spesies lain dengan berbagai cara-cara beberapa bersifat menguntungkan beberapa merugikan ( Pelezar, 1988).Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah, udara, substrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganismenya dapat berupa bakteri, khamir, kapng dan sebagainya. Populasi dari mikroba yang ada di linkungan ini sangatlah beraneka ragam sehinga dalam mengisolasi diperlukan beberapa tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal. Koloni yang tunggal ini kemudian yang akan diperbanyak untuk suatu tujuan penelitian misalnya untuk menngisolasi DNA mikroba yang dapat mendeteksi mikroba yang telah resisten terhadap suatu antibiotik. Atau untuk mengetahui mikroba yang dipakai untuk bioremediasi holokarbon (Ferdiaz, 1992).Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran inti (prokariota). Bakteri dulu terbagi menjadi Bacteria dan Archaebacteria, namun sekarang Archaebakteria memiliki domain sendiri yang disebut Archaea. Bakteri memiliki ciri-ciri antara lain tidak memiliki membran inti, tidak memiliki organel bermembran, memiliki dinding sel peptidoglikan, dan materi asam nukleatnya berupa plasmid (Postlethwait, 2006).Bakteri memiliki beragam variasi bentuk, seperti coccus, basil, dan spiral. Bakteri dapat hidup soliter maupun berkoloni dan berkembang biak dengan cara membelah diri. Bakteri memiliki habitat yang bervariasi, dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuh hewan, misalnya dalam usus manusia. Bakteri ada yang dapat hidup secara anaerob murni dan akan mati dengan adanya oksigen, ada yang bersifat aerob dan memerlukan oksigen untuk metabolismenya, dan ada yang bersifar aerob fakultatif yaitu dapat hidup pada kondisi anaerob, tapi bila ada oksigen, metabolismenya bersifat aerob (Betsy, 2005).Bakteri secara genetis diklasifikasikan menjadi 5 grup besar, yaitu Proteobacteria, Cyanobacteria, Spirocheta, Chlamydia, dan Firmicuta. Proteobacteria merupakan grup bakteri terbesar dan merupakan asal usul mitokondria pada eukariota dengan proses endosimbiosis. Cyanobacteria merupakan grup bakteri yang memiliki klorofil dan dapat berfotosintesis. Spirocheta adalah kumpulan bakteri yang berbentuk spiral. Chlamydia adalah bakteri dengan ukuran yang relatif kecil dibanding grup lain dan umum hidup sebagai parasit. Firmicuta adalah bakteri yang umum memproduksi endspora (Purves, 2003).Isolasi adalah proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Mikroba dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik. Aseptik berarti bebas dari sepsis, yaitu kondisi terkontaminasi karena mikroorganisme lain. Teknik aseptik ini sangat penting bila bekerja dengan bakteri. Beberapa alat yang digunakan untuk menjalankan prosedur ini adalah bunsen dan laminar air flow Bila tidak dijalankan dengan tepat, ada kemungkinan kontaminasi oleh miroorganisme lain sehingga akan mengganggu hasil yang diharapkan. Teknik aseptik juga melindungi laboran dari kontaminasi bakteri (Singleton, 2006).Ada beberapa metode untuk menginokulasi mikroba sesuai dengan jenis medium tujuannya. Pada medium agar tegak, dilakukan metode tusuk menggunakan jarum ose. Pada medium agar miring, dilakukan metode gores dengan menggunakan loop ose. Pada medium petridisk, dapat digunakan metode streak plate (metode gores), pour plate (metode tuang) atau spread plate (metode sebar) Setelah inokulasi, dilakukan proses inkubasi, yaitu menyimpan medium pada alat atau kontainer ada temperatur tertentu dan periode tertentu, sehingga tercipta lingkungan yang menyediakan kondisi cocok untuk pertumbuhan mikroba. (Harley, 2002).Ada berbagai cara untuk mengisolasi mikroba dalam biakan murni yaitu, cara pengenceran, cara penuanagan, cara penggesekan, atau penggoresan, cara penyebaran, cara pengucilan 1 sel, dan cara inokulasi pada hewan. Masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangan. (Waluyo, 2007).Untuk metode streak plate misalnya, mikroba diletakan didalam pada ujung palte mengguanakan ose, lalu digoreskan pada permukaan medium agar tersebut dengan pola tertentu yang khas. Ada pula metode Pour Plate atau penuanga. Metode ini dapat digunakan untuk penghitungan bakteri secara langsung. Karena sebelum dituang bakteri tersebut diencerkan terlebih dahulu. Sehingga syarat penghitungan langsung yaitu dalam 1 media terdapat 30-300 koloni dapat terpenuhi (Prescott, 2008).Di dalam keadaaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada mikroba yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Untuk menyendirikan suatu spesies dikenal beberapa cara, yaitu (Dwidjoseputro, 1990) :1. Degan pengenceranCara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil memelihara Streptococcus lactis dalampiraan murni yang diisolasi dari sampel susu ang sudah masam.Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam medium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.2. Dengan penuanganRobert Koch (1843-1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikti sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan, dan sampel ini kemudian di sebar di dalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian dia memperoleh suatu piaraan adukan. Setelah medium tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni- koloni yang masing- masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin.Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam biakan di dalam medium diantaranya adalah (Lay, 1994) :1. Metode cawan goresMetode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjafi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel- sel yang digores.2. Metode cawan tuangCara lain untuk mempeeroleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian di cawankan. Karena konsentrasi sel- sel mikroba di dalam eksperimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang- kurangnyya satu di antara cawan cawan tersebut mengandung koloni- koloni terpisah baik di atas permukaan maupun di dalam agar. Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi.Proses pemisahan/pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan Isolasai Mikroba. Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu (Pelczar, 1988) :1) Isolasi pada agar cawanPrinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: Metode gores kuadran, dan metode agar cawantuang.Metode gores kuadran. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satusel.Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50oC), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalamcawan.2) Isolasi pada medium cairMetode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.3) Isolasi sel tunggalMetode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis.Pertama kali mengadakan piaraan biasanya diperoleh dari piaraan campuran, piaraan pertama disebut primary culture dan sifatnya murni.Piaraan semacam ini dapat disimpan tetapi harus diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru yang disebut piaraan turunan (Sub-culture) yaitu piaraan yang diperoleh dari piaraan pertama (Dwidjoseputro, 1992).

II. MetodeA. Alat dan BahanAlatJumlahBahanJumlah

Cawan petriTabung reaksiJarum oseBunsenGelas kimiaSpidolPenggarisLabel1 buah2 buah1 buah1 buah1 buah1 buah1 buah1 buahMedia NAMedia NA agar miringAlkoholAquadesBakteri6 cawan45 tabung

SecukupnyaSecukupnyaSecukupnya

B. Cara KerjaJarum ose

Dimasukkan ke dalam alkohol Dipijarkan diatas api Di dinginkan Hasil

Media NA dalam cawan petri

Di buat kuadran 0, I, II, III pada bagian luar permukaan cawan Dibuka tutupnya tidak terlalu lebar Diletakkan satu jarum ose penuh kultur di atas permukaan agar Dipijarkan jarum ose dan didinginkan Ditarik jarum ose kurang lebih sejajar Diputar cawan 900 Ditarik lurus kembali setelah menyentuuh ujung area I memenuhi area II Dipijarkan kembali lup dan cawan diputar 900 masuk area III setelah menyentuh area IIHasil

Koloni terpisah S. marcescens (merah), M. luteus (kuning), dan E. coli (Putih)

Diberi label Diinkubasikan pada suhu 250CHasil

Lup

Dipijarkan Di sentuhkan pada permukaan koloniHasil

Tabung reaksi berisi media agar miring

Dibuka tutup tabung Dipanaskan leher tabung Diinokulasikan ke permukaan media Dipanaskan kembali leher tabung Ditutup kembaliHasil

III. Hasil Pengamatan(Pembuatan kuadran pada cawan)

(Bakteri mulai tumbuh disetiap kuadran)

(Bakteri mulai tumbuh disetiap kuadran)

IV. PembahasanPada praktikum kali ini dilakukan pengamatan mengenai pemurnian isolat dari beberapa bakteri yang telah dicampurkan pada cawan petri. Bakteri yang akan dicoba dimurnikan kembali ada 3 jenis, masing-masin bakteri tersebut berwarna merah, kuning dan putih yang asalnya masing-masing ditempatkan di dalam media cawan miring. Media yang digunakan adalah media NA, hal ini dikarenakan mikroba yang digunakan adalah bakteri.Menurut Fobisher (1974), untuk menumbuhkan mikroba ada berbagai macam medium yang digunakan. Untuk mudahnya medium mikroba diklasifikasikan berdasarkan sifat, komposisi dan fungsinya. Berdasarkan sifat fisiknya, medium dibagi menjadi 3, yaitu solid medium, semi solid medium, dan broth medium. Sedangkan berdasarkan komposisi penyusunnya juga dibedakan menjadi medium sintetis, medium semi sintetis, medium non-sintetis. Berdasarkan fungsinya sendiri medium terbagi menjadi medium umum, medium selektif, medium diferensial, medium uji dan medium diperkaya. Penggunaan media miring sebagai tempat awal pengembangan bakteri merupakan langkah yang tepat karena kemiringan tersebut memberikan kesempatan bakteri untuk dapat berkembang lebih luas. Tujuan penanaman ketiga bakteri tersebut pada pedia cawan adalah untuk mencampurkan bakteri-bakteri tersebut dan mendapatkan koloni bakteri yang masing-masing berbeda dan ditanam pada media miring kembali. Cawan dibuat 4 daerah yang masing-masing akan di buat goresan bakteri. Hal ini dilakukan untuk mengurangi jumlah bakteri sedikit demi sedikit agar nantinya jumlah bakteri menjadi beberapa koloni. Penggoresan pada kuadran 0 dilakukan selama 3 kali dengan saling bertumpuk, hal ini dilakukan agar pada daerah tersebut membentuk koloni campuran pada daerah itu kemudian secara terus-menerus dibuat goresan hingga mencapai kuadran III. Media yang diguakan mendapatkan kontaminasi dari mikroba lain seperti bakteri kontaminan dan kapang. Berdasarkan hasil yang didapat dari pengamatan selama 3 hari terlihat bahwa pada kuadran III terdapat beberapa koloni bakteri yang berbeda dan kebanyakan berwarna merah. Setiap goresan yang dilakukan mengurangi jumlah bakteri menuju kuadran III hingga menyisakan beberapa koloni saja. Walaupun kebanyakan terkihat berwarna merah namun ada pula koloni berwarna putih dan kuning walaupun jumlahnya sedikit. Menurut Pelczar (1988), Untuk mempelajari kehidupan dan keragaman bakteri, diperlukan suatu usaha untuk mengembakbiakkan mereka dalam skala laboratorium. Pengembangbiakan ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri dari sumber isolat, seperti tanah, udara, sisa makanan, dll, dalam media yang mengandung nutrisi. Dalam dunia mikrobiologi, dikenal beberapa istilah seperti inokulasi, kultur dan isolasi. Inokulasi adalah suatu usaha menumbuhkan mikroorganisme dari satu sumber ke media pertumbuhan steril. Biakan yang tumbuh disebut dengan kultur. Isolat adalah biakan murni dari mikroorgansime yang diharapkan berasal dari satu jenis, sedangkan isolasi adalah usaha untuk mendapatkan isolat. Sumber isolasi Inokulasi Kultur/biakan Isolasi Isolat. Media pertumbuhan bakteri sangat beragam, mulai dari media selektif, media penyubur, media diferensial. Pada media terlihat adanya mikroba kontaminan yang mendominasi ruang pada media tersebut namun tidak dapat menyentuh bakteri yang telah digoreskan, hal ini dikarenakan bakteri mengeluarkan metabolit sekunder yang memiliki sifat toksik dan dapat membunuh mikroba yang lain sehingga terdapat suatu daerah yang tidak ditempati oleh kontaminan/barrier.V. KesimpulanDari hasil yang didapat dapat disimpulkan bahwa terdapat beberapa koloni bakteri pada kuadran III yang kebanyakan merupakan bakteri berwarna, hal ini terjadi karena semakin menuju kepada kuadran III maka bakteri yang digoreskan akan semakin sedikit. Bakteri yang digoreskan membuat barrier dari metabolit sekundernya agar tidak diganggu oleh mikroba lain.

DAFTAR PUSTAKA

Betsy dan Keogh. 2005. Microbiology Demystifed. USA : McGraw-Hill Publisher.Frobisher, 1974.Fundamentals Of Microbiology. London : Saunders CompanyDwidjoseputro, 1992.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Imagara Ph.Dwidjoseputro, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama.Ferdiaz, S., 1992, Mikrobiologi Pangan. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama.Harley dan Presscot. 2002. Laboratory Exercise in Microbiology. USA : McGraw-Hill Publisher.Lay, B. 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Raja Grafindo Persada.Pelczar, M.J.Jr, and E. C. S. Chan. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press. Postlethwait dan Hopson. 2006. Modern Biology. Texas : Holt, Rinehart and Winston; Prescott, L. M, J. P. Harley, dan D. A. Klein. 2008. Microbiology 7th Ed. USA : McGraw-Hill Book Company Inc.Purves dan Sadava. 2003. Life The Science of Biology 7th Edition. New York : Sinauer Associates Inc.Singleton dan Sainsbury. 2006. Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd Edition. Inggris : John Wiley and Sons Sussex.Volk. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Erlangga.Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.