penuntun dan laporan praktikum mikrobiologi farmasi · 2020. 7. 8. · sterilisasi alat cara...

LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI) FARMASI USU 2019

0 | B U K U P E N U N T U N D A N L A P O R A N P R A K T I K U M

PENUNTUN DAN LAPORAN

PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI

FARMASI

Tim Penyusun:

Dr. Marline Nainggolan, M.S., Apt.

Popi Patilaya, S.Si., M.Sc., Apt.

Imam Bagus Sumantri, S.Si., M.Si., Apt.

Dra. Erly Sitompul. M.Si., Apt.

Dr. Panal Sitorus, M.Si., Apt.

LABORATORIUM BIOLOGI (MIKROBIOLOGI)

FARMASI

PROGRAM STUDI S1-REGULER-INTERNASIONAL

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UITARA

MEDAN 2019



BIODATA PRAKTIKAN

Pas

Foto

3x4

Terbaru

(tidak boleh foto

Berpakaian seragam

Sekolah)

Nama Lengkap : ................................................................

NIM : ................................................................

Hari Praktikum : ................................................................

Gelombang : ................................................................

Kelompok : ................................................................

Asal Sekolah : ................................................................

Tanda tangan :



PERCOBAAN I

TEKNIK STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

Sterilisasi Alat

Cara sterilisasi alat yang digunakan selama praktikum terdiri dari dua cara,

yaitu Sterilisasi Uap menggunakan Autoklaf dan Sterilisasi Panas Kering

menggunakan Oven. Cara dan Ketentuan sterilisasi mengacu pada Farmakope Edisi IV

(1995). Proses sterilisasi uap (panas basah) menggunakan Autoklaf bila tidak

dinyatakan lain berlangsung sclama 15 menit pada suhu 121°C. Autoklaf merupakan

proses sterilisasi yang paling banyak digunakan. Autoklaf dapat digunakan untuk

sterilisasi bahan dan alat. Proses sterilisasi panas kering menggunakan Oven umumnya

berlangsung selama l jam pada suhu 170°C. Oven umumnya digunakan untuk

sterilisasi alat-alat ataupun bahan-bahan yang tahan suhu tinggi.

Alat-Alat

Alat-alat yang digunakan pada keseluruhan percobaan adalah Batang

pengaduk, Beaker Glas, Botol Akuades, Botol Semprot, Cawan Petri, Erlenmeyer,

Gelas Ukur, Inkubator suhu 35±2°C dan 25±2°C, Jamm Ose, Kompor Gas, Labu

Tentukur, Lampu Bunsen, Lemari Pendingin dilengkapi freezer, Mikro Pipet,

Autoklaf, Oven, Pencadang Logam/Kaca, Pinset, Rak Tabung Reaksi, Tabung

Durham, Tabung reaksi, Timbangan Digital.

Alat dan Bahan yang Harus Selalu Dibawa (Praktikan)

Alat dan bahan yang harus selalu dibawa setiap percobaan adalah aluminium

foil, gunting, hekter, kain kasa steril, kapas, kertas label, kertas perkamen kajang,

mancis/korek api, pipet tetes berkaret merah, pulpen, sabun/cairan antiseptis, selotip,

serbet/lap tangan, spuit jarum suntik, tali (benang bola), tisu gulung, tisu lensa

(percobaan pengecatan gram dan pemeriksaan jamur), wipol (desinfektan) dan

sejenisnya.

Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah akuades, etanol 70%,

spiritus KOH.

Cara Kerja

1. Dilakukan pengemasan alat-alat yang disterilisasi dan pembuatan media

2. Memilih metode sterilisasi yang tepat untuk alat-alat dan bahan-bahan yang

disterilisasi

Alat-alat yang disterilisasi

Alat-alat yang disterilisasi meliputi batang pengaduk, Beaker glas, botol

akuades, botol semprot, cawan petri, erlenmeyer, gelas ukur, jarum ose, labu tentukur,

mikro pipet, pecadang logam/kaca, pinset, pipet tetes, tabung durham, tabung reaksi.

tel:1995

tel:121

tel:170

tel:3512



Pertanyaan Penuntun (wajib isi sebelum praktikum):

1. Apa pengertian sterilisasi?

. .

. .

2. Apa pengertian steril?

. .

. .

3. Apa pengertian sterilitas?

. .

. .

4. Jelaskan pengertian dan prinsip kerja aseptis!

. .

. .

. .

. .

5. Jelaskan metode-metode sterilisasi dan sebutkan cara mensterilkan peralatan

dan bahan yang digunakan dalam percobaan ini!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .



LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

Hasil dan Pengamatan

No. Nama Alat Metode Sterilisasi Suhu dan Waktu Alat Sterilisasi

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Pertanyaan Tambahan (wajib isi setelah praktikum):

Apa dasar pemilihan metode sterilisasi (oven atau autoklaf) dalam sterilisasi alat?

.

.

Medan, 2019

Pengawas Praktikum, Praktikan,

Tanggal ACC:

( ) ( )

Nama lengkap dan tanda tangan Nama lengkap dan tanda tangan



Gambar (FOTO) Hasil Pengamatan:



PERCOBAAN I

TEKNIK STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

Sterilisasi Bahan Media dan Larutan Pengencer

Cara sterilisasi bahan yang digunakan selama praktikum umumnya

menggunakan metode Sterilisasi Uap memakai Autoklaf. Bahan yang digunakan untuk

keseluruhan praktikum umumnya menggunakan media mikrobiologi. Cara sterilisasi

dan pembuatan media mikrobiologi diambil dari prosedur literatur ataupun pada label

kemasan media yang dipakai karena setiap pabrik yang memproduksi media

mikrobiologi mempunyai formula masing-masing yang harus dipatuhi setiap peneliti

atau penggunaan media mikrobiologi tersebut. Proses sterilisasi uap menggunakan

Autoklaf untuk media mikrobiologi dan larutan pengencer bila tidak dinyatakan lain

umumnya beriangsung selama 15 menit pada suhu 121°C.

Alat-Alat

Alat-Alat Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah Batang

pengaduk, Beaker Glas, Botol Akuades, Botol Semprot, Erlenmeyer, Gelas Ukur,

Kompor Gas, Lampu Bunsen, Lemari Pendingin dilengkapi freezer, Autoklaf, Rak

Tabung Reaksi, Tabung reaksi, Timbangan Digital.







sejenisnya.

Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah akuades steril, etanol

70%, seluruh media yang digunakan selama praktikum, spiritus KOH.

Cara Kerja

1. Dilakukan pembuatan media dan larutan pengencer mikrobiologi sesuai dengan

literatur atau pada label kemasan media dan larutan pengencer mikrobiologi

2. Dilakukan sterilisasi yang tepat sesuai dengan literatur atau pada label kemasan

media dan larutan pengencer mikrobiologi.

3. Dilakukan pembuatan agar miring dan agar tegak.

Bahan-bahan yang disterilisasi



Bahan-bahan yang disterilisasi adalah akuades, larutan pengencer

mikrobiologi, dan media mikrobiologi.


1. Mengapa bahan-bahan mikrobiologi harus disterilkan?

. .

. .

. .

2. Dapatkah media mikrobiologi disterilkan dioven? Berikan penjelasan yang

tepat!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Jelaskan pengertian dan fungsi media pertumbuhan?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

4. Sebutkan 5 media agar dan 5 media cair!

. .

. .

. .

. .

. .

5. Jelaskan cara pembuatan media Nutrient Agar, Nutrient Broth dan Larutan

Natrium Klorida 0,9% serta fungsinya masing-masing!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .





No. Nama Bahan Formula Metode sterilisasi Suhu dan Waktu

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15


1. Bagaimana membuat media agar miring dan agar tegak?

.

.

2. Kapan digunakan agar miring dan agar tegak?

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




PERCOBAAN II

TEKNIK INOKULASI

Berdasarkan bentuk media:

Inokulasi aerob (Agar miring)

Inokulasi anaerob (Agar tegak)

Sumber Buku: Buku Bibiana W. Lay, serta buku mikrobiologi yang mendukung

lainnya.

Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik

penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :

l. Menyiapkan ruangan

Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar

tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan dalam laboratorium

pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam scbuah

kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui

suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet.

2. Pemindahan dengan dengan pipet

Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum, misalnya pada penyelidikan

diambil l ml contoh, lalu diencerkan dengan akuades sebanyak 9 ml murni.

3. Pemindahan dengan kawat inokulasi

Kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau nikel, ujungnya boleh lurus juga

boleh berupa kolongan yang diameternya 1-3 mm. Dalam melakukan penanaman

bakteri, kawat ini terlebih dahulu dipijarkan pada api bunsen.

Metode Inokulasi Mikroba

Ada beberapa teknik menggores yang biasa digunakan :

1. Metode Gores

Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi

memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan

}ang sempuma akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di

permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup

inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah

sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan dilakukan pada medium

pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang

paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing

laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin

pada lempeng medium pembiakan. Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni:

goresan T, goresan radian, goresan kuadran dan goresan sinambung.

2. Metode tebar

Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan

petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu

disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan

pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran baktcri yang merata dengan baik.

Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah.



3. Metode tuang

Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan

pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat

hanya ditemukan satu sel di dalam tabung.

4. Metode tusuk

Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum

ose yang didalamnya terdapat inokolum kemudian dimasukkan kc dalam media.

Teknik Pengenceran Suspensi Bakteri

Pengenceran suspensi bakteri dari sampel sumber isolat dari lingkungan dilakukan

sebagai upaya untuk mendapatkan kuantitas bakteri dalam jumlah yang dapat

terhitung. Seperti yang telah diketahui bahwa dalam sampel lingkungan komunitas

bakteri berada dalam kuantitas yang sangat melimpah. Selain mendapatkan kuantitas

yang dapat terhitung, pengenceran suspensi bakteri dari sampel/ sumber isolat dari

alam juga diperlukan dalam rangka memudahkan dalam pengamatan koloni, terutama

dalam kegiatan betahap pemurnian isolat (sub-kultur). Koloni yang tumbuh terpisah

dalam kuantitas yang dapat dihitung memudahkan peneliti untuk memilih koloni yang

akan dipisahkan (disub-kultur). Pengenceran suspensi bakteri dari sampel / sumber

isolat dari lingkungan pada umumnya dilakukan dengan teknik pengenceran berseri

(series of dilution).

Cara Kerja :

1. Masukkan Nutrient Broth (NB) ke dalam masing-masing tabung reaksi dengan

ketentuan sebagai berikut : satu tabung pertama diisi dengan 10 mL Nutrient

Broth dan enam tabung berikutnya masing-masing diisi dengan 9 ml Nutrient

Broth

2. Sterilisasi Seri Tabung pengenceran di atas beserta Mortar Keramik dan

Penumbuknya serta Pipet Volumetrik ke dalam Autoclave

3. Gerus sampel di alas Mortar Keramik steril.

4. Timbang l (satu) gram sampel (di atas alumumium foil) kemudian masukkan

ke dalam tabung I vortex sebentar agar suspense homogen;

5. Ambil sebanyak 1 mL suspensi dari tabung I dengan menggunakan Pipet

Volumetrik steril, kemudian masukkan ke dalam tabung II, vortex sebentar agar

suspensi homogeny

6. Lakukan langkah No. 5 untuk tabung III, IV, V, VI, dan VII.

Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah:

1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose berbentuk batang. Hifa yang

berbentuk seperti benang mudah diambil dengan jarum ose dan mudah sekali

tumbuh di dalam suatu media.

2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose

yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif

banyak.

Alat-Alat



Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah beaker glas, botol akuades,

botol semprot, cawan petri, gelas ukur, inkubator suhu 350C dan 250C, kompor gas,

lampu bunsen, ose, autoklaf, rak tabung reaksi, tabung reaksi.







sejenisnya.

Bahan-Bahan:

Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan adalah akuades, biakan murni

bakteri, biakan murni jamur, etanol 70%, media nutrient agar (NA), media nutrient

broth (NB), media potato dextrose agar (PDA), peptone dillution fluid (PDF)/ pepton

water, Spiritus KOH.


1. Jelaskan perbedaan inokulasi dan isolasi bakteri!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

2. Jelaskan metode-metode inokulasi!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Jelaskan karakteristik pertumbuhan mikroba dalam media padat dan media

cair?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .




Hasil dan Pengamatan Inokulasi

No. Metode

Inokulasi

Jenis media yang

digunakan

Jenis biakan yang

digunakan

Adanya koloni

spesifik

1

2

3

4

5

Hasil dan Pengamatan Suspensi Bakteri dan Jamur

No. Konsentrasi

Pengenceran Bakteri

(Formula)

Jenis media

yang

digunakan

Jenis biakan

yang digunakan

Pengamatan

1

2

3

No. Konsentrasi

Pengenceran Jamur

(Formula)

Jenis media

yang

digunakan

Jenis biakan

yang digunakan

Pengamatan

1

2

3


1. Mengapa Bakteri dapat tumbuh pada media yang digunakan?

.

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




PERCOBAAN IV

Pengecatan Gram dan Pemeriksaan Jamur

Pengecatan Gram

Tujuan Praktikum :

Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa memiliki keterampilan untuk :

1. Melakukan pengecatan Gram

2. Mengidentifikasi morfologi bakteri Gram positif

Prinsip

Daya ikat dari sifat dinding sel dan membran luar dari suatu bakteri gram (+)

dan gram (-) terhadap larutan zatr warna yang disebabkan sifat kepolarannya.

Cara Kerja :

1. Objek glass dicuci alkohol 70% lalu difiksasi.

2. Satu tetes akuades steril diteteskan pada objek glass lalu kedalamnya

dimasukkan satu ose biakan murni kemudian dihomogenkan, lalu dikeringkan

dengan fiksasi

3. Ditambahkan satu tetes larutan gentian violet lalu ditambahkan satu tetes

larutan lugol, diratakan lalu dikeringkan dengan cara fiksasi.

4. Dicuci objek glass dengan alkohol 70 % sampai tetesan terakhir tidak

berwama, kemudian dikeringkan.

5. Diteteskan satu tetes safranin, dibiarkan 15-30 detik, dicuci larutan safranin

dengan akuades steril, kemudian dikeringkan.

6. Diteteskan 1-2 tetes minyak imersi (Imersi Oil).

7. Dilihat pada mikroskop dengan perbesaran 40x dan 100x.

8. Diamati dengan melihat wama dan bentuk bakteri.

9. Ditentukan jenis bakteri berdasarkan pewamaan gram yang diamati.

Ketentuan : Bakteri gram (+) berwama ungu/violet.

Bakteri gram (-) berwarna merah jambu/pink



Pemeriksaan Jamur

Tujuan Praktikum :

Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa memiliki keterampilan untuk melihat

morfologi jamur secara mikroskopik

Cara Kerja :

1. Gelas objek yang dicuci dengan alkohol 70% kemudian difiksasi dengan cara

dipanaskan di api bunsen

2. Diteteskan satu tetes aquades steril

3. Diambil inokulum jamur dengan menggunakan jarum ose dan diletakkan diatas

gelas objek lalu dihomogenkan

4. Dikeringkan dengan cara fiksasi

5. Ditambahkan satu sampai dua tetes minyak imersi

6. Diamati dibawah mikroskop

Alat-Alat

Gelas objek, jarum ose, bunsen, botol air suling, pinset, dan mikroskop.

Bahan

Biakan bakteri gram positif , alkohol, gentian violet, lugol, safranin, air suling dan

minyak imersi.



Pertanyaan Penuntun (wajib diisi sebelum praktikum) :

1. Jelaskan morfologi bakteri Gram Positif ?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

2. Apa tujuan fiksasi dan bagaimana cara melakukannya ?

. .

. .

. .

. .

3. Jelaskan fungsi penambahan reagensia pada percobaan ini ?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

4. Jelaskan guna alkohol 70% dan jelaskan cara pembuatan alkohol 70% ?

. .

. .

. .

. .

5. Bagaimana bentuk morfologi jamur ?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

6. Jelaskan fase hidup dari jamur mikroskopik dan makroskopik ?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .




Hasil dan Pengamatan Pengecatan Gram

No. Nama Biakan Bakteri (spesies) Perlakuan Pengamatan Keterangan

1

2

3

Hasil dan Pengamatan Jamur

No. Nama Biakan Bakteri (spesies) Perlakuan Pengamatan Keterangan

1

2

3


1. Apa perbedaan mendasar antara bakteri Gram + dengan bakteri Gram – serta

dengan Jamur, jelaskan!

.

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




Percobaan V

Penetapan Angka Lempeng Total

Angka Lempeng Total (ALT)

Uji Angka Lempeng Total (ALT) dilakukan untuk menentukan jumlah atau

angka bakteri aerob mesofil yang mungkin mencemari suatu produk, baik itu makanan-

minuman, obat tradisional ataupun kosmetika. Media yang digunakan untuk uji ALT

adalah PCA (Plate Count Agar). Masa inkubasi dilakukan dengan membalik cawan

petri yang berisi biakan. Hal ini dimaksudkan untuk menghindari jatuhnya butir air

hasil pengembunan disebabkan suhu inkubator. Apabila sampai terdapat air yang

jatuhmaka akan merusak pembacaan angka lempeng total dari sampel yang diuji. Cara

inokulasi yang dipilih adalah cara tuang, dimana hal ini dimaksudkan untuk melihat

pertumbuhan baketri aerob mesofil, yang membutuhkan oksigen dalam

pertumbuhannya, sehingga akan teramati bahwa pertumbuhan bakteri aerob mesofil

tersebut akan berada dipermukaan lempeng agar. Untuk sampel makanan-minuman,

obat tradisional, dan kosmetik yang diduga menggunakan pengawet digunakan

pengencer yaitu Letheen Broth (LB) yang dapat menginaktivasi pengawet dalam

sampel karena mengandung lesitin 0,5% yang berfungsi sebagai inaktivator, sehingga

hasil pengujian yang negatif dari sampel benar-benar menunjukkan hasil yang negatif

bukan karena aktifitas dari pengawet. Sedangkan untuk sampel tanpa pengawet,

pengenceran dilakukan dengan menggunakan Pepton Dilution Fluid (PDF).

Pada pengujian angka kapang/khamir digunakan pengencer PDF yang

mengandung nutrisi pepton yang baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir serta

menggunakan media Potato Dextrose Agar (PDA) yang merupakan media padat (agar)

dengan kandungan nutrisi karbohidrat (dekstrosa) yang baik untuk pertumbuhan

kapang dan khamir. Inkubasi sampel dilakukan pada suhu 20-25°C yang merupakan

suhu optimum untuk pertumbuhan kapang dan khamir. Inkubasi sampel tidak boleh

diposisikan terbalik karena kapang/khamir akan tumbuh dan memiliki spora yang terus

dan berkembangbiak, jika posisi cawan dibalik maka spora fungi tersebut akan

bertebaran dan tumbuh dimana-mana pada media agar, sehingga jumlah koloni mfungi

yang tumbuh akan semakin banyak dari jumlah koloni sebenarnya, hal ini dapat

menyebabkan kesalahan perhitungan koloni kapang/khamir. Pada media PDA

ditambahkan klorampenikol sebanyak 10mg/100ml dengan tujuan untuk menghambat

pertumbuhan bakteri sehingga yang akan tumbuh pada media tersebut hanya kapang

dan khamir.

Cawan yang dipilih untuk perhitungan koloni adalah yang mengandung antara

30-300 koloni. Untuk memperoleh sekurang-kurangnya satu cawan mengandung

koloni dalam jumlah yang memenuhi syarat maka harus dilakukan sederetan

pengenceran dan pencawanan. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal

ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor

pengenceran pada cawan yang bersangkutan.



Tabel Pengamatan

Pengenceran Cawan I Cawan II Keterangan

10-2 150 300 Dipilih koloni cawan I

10-3 20 25 Dipilih koloni cawan II

Perhitungan:

Kisaran yang paling tepat dalam menghitung koloni pada cawan adalah 25-250 koloni

percawan. dalam perhitungan percobaan ini, lihat kembali bahan kuliah anda!

Jumlah koloni rata-rata = jumlah kedua cawan dikalikan dengan faktor

pengencerannya

Maka Angka Lempeng Total adalah : 150+250 x 102= 200 x 102 2

Prinsip Percobaan

Pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil dan jamur setelah cuplikan

diinokulasi pada media agar lempeng dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang

sesuai

Tujuan Percobaan

Untuk menghitung angka lempeng total bakteri dan jamur

Media dan pengencer

Plate Count Agar (PCA)

Pepton Dilution Fluid (PDF)

Pereaksi

1% Triphenyltertrazolium Chloride (TTC)

Prosedur

Dengan cara aseptikm dipipet 10ml sampel kedalam kantong stomaker steril yang

sesuai. Ditambhakan 90ml PDF, dihomogenkan selama 30 detik hingg terbentuk

suspensi 10-1. Disiapkan 5 buah tabung reaksi steril yang masing-masing telah diisi

dengan 9ml PDF, dihomogenkan hingga diperoleh suspensi homogen pengenceran 10-

2. Lalu selanjutnya hingga pengenceran 10-6. Setiap pengenceran dipipet 1ml kedalam

cawan petri steril dan dibuat duplo. Kedalam tiap cawan petri dituang 15-20 ml media

PCA. Cawan petri diputar dan digoyang sedemikian rupa sehingga suspensi tersebar

merata. Untuk mengetahui sterilitas media dan larutan pengencer dibuat uji blanko.



Setelah media memadat, cawan diinkubasi pada suhu 35°C-37°C selama 24-48 jam

dalam posisi dibalik. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung

Interpretasi

1. Pilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkanjumlahkoloniantara 30

-300. Jumlahkoloni rata-rata dari kedua cawan dihitung, lalu dikalikan dengan

faktorpengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai angka lempeng total dalam tiap

mL contoh.

2. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni 30 atau 300. Hitung

jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil

dinyatakan sebagai angka lempeng total dalam tiap mL contoh.

3. Jika terdapat cawan-cawan dari dua tingka tpengenceran yang berurutan

menunjukkan jumlah koloni 30 – 300, maka hitung jumlah koloni dari masing –

masing tingkat pengenceran kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya.

Apabila hasi lperhitungan pada tingkat yang lebih tinggi diperoleh jumlah koloni

rata-rata lebih besar dari dua kali jumlah koloni rata-rata dari pengenceran

dibawahnya, maka angka lempeng total dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih

rendah (missal pada pengenceran 10-2 jumlahkoloni rata-rata 140, pada

pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 32, maka dipilih jumlah koloni 140 x

102).

4. Bila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi diperoleh jumlah

koloni rata-rata kurang dari 2 kali jumlah koloni rata-rata pada pengenceran di

bawahnya, maka angka lempeng total dihitung dari rata-rata jumlah koloni kedua

tingkat pengenceran tersebut. Misal, pada pengenceran 10-2 jumlah koloni rata-

rata 293, pada pengenceran 10-3 jumlah koloni rata-rata 41, maka angka lempeng

total adalah: 293 + 41

2 𝑥 103 = 167 𝑥 102

5. Bila tidak ada satu pun koloni tumbuh dalam cawan, maka angka lempeng total

dinyatakan sebagai < dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.

6. Jika seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 300, dipilih cawan dari

tingkat pengenceran tertinggi kemudian dibagi menjadi menjadi beberapa sector

(2,4 atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu sector, angka lempeng total adalah

jumlah koloni dikalikan dengan jumlah sector, kemudian dihitung rata-rata dari

kedua cawan dan dikalikan dengan factor pengenceran.

7. Jika jumlah koloni rata-rata dari ¼ bagian cawan lebih dari 200, maka angka

lempeng total dinyatakan lebih besar dari 200 x 8 dikalikan dengan factor

pengenceran.

8. Perhitungan dan pencatatan hasil angka lempeng total hanya ditulis dalam dua

angka. Angka berikutnya dibulatkan kebawah bila kurang dari lima dan dibulatkan



keatas bila lebih dari lima. Sebagai contoh 523 x 103dibulatkan menjadi 52 x 104,

sedangkan 83,6 x 103dibulatkan menjadi 84 x 103.

9. Jika dijumpai koloni “spreader” meliputi seperempat sampai setengah bagian

cawan, maka diitung koloni yang tumbuh di luar daerah “spreader”. Jika 75% dari

seluruh cawan mempunyai koloni “spreader” dengan keadaan di atas, maka dicatat

sebagai “Spr”. Untuk keadaan ini harus dicari penyebabnya dan diperbaiki

carakerjanya (pengujianulang).

10. Jika dijumpai “spreader” tipe rantai, maka tiap satu deret koloni yang terpisah

dihitung sebagai satu koloni, dan bila dalam kelompok “spreader” terdiri dari

beberapa rantai dihitung sebagai satu kolon


1. Jelaskan Pengertian Angka Lempeng Total ?

. .

. .

. .

. .

. .

2. Mengapa cawan petri diletakan posisi terbalik saat diinkubasi?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Mengapa dipilih lempeng dengan julah koloni 30-300 ?

. .

. .

. .

. .

. .

4. Jelaskan apa yang dimaksud dengan koloni “spreader”!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .




Hasil dan Pengamatan Pengecatan Gram

No. Data Sampel Pengamatan Perhitungan Kesimpulan

1

Nama Sampel :

Tempat pengambilan

sampel:


1. Sebutkan sebab-sebab terjadinya koloni “spreader” ?

.

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




PERCOBAAN VI

UJI ANGKA PALING MUNGKIN (MPN) Bakteri Koliform)

Teori

Teknik Most Probable Number (MPN) merupakann metode untuk

memperkirakan populasi mikroorganisme terutama pada situasi dimana

mikroorganisme ada dalam jumlah yang sangat sedikit. Pengujian MPN Coliform dan

E. Coli menggunakan media Mac Conkey Broth (MCB) dan tabung durham. MCB

merupakan media perbenihan selektif yang mengandung garam empedu sebagai

penghambat bakteri bukan coliform. Tabung durham digunakan untuk mengetahui

adanya pembentukan gas oleh bakteri yang terdapat dalam sampel tersebut.

Terbentuknya gas dan asam menandakan adanya E.coli dan Coliform. Jika hanya ada

gas menandakan adanya coliformn tanpa ada e.coli. Terbentuknya asam ditandai

dengan perubahan warna biakan menjadi kuning.Tahap ini merupakan uji presumtif.

Sampel yang menunjukkan uji presumtif positif dilanjutkan ke uji konfirmasi.

Uji konfirmasi coliform menggunakan media Brilliant Green Lactose Broth (BGLB)

dengan melihat terbentuknya gas dalam tabung durham. Uji konfirmasi e.coli

dilanjutkan dengan media ECB (E.Coli Broth) dan diinkubasi pada suhu optimumnya

yakni 44°C. Uji konfirmasi dinyatakan positif bila terbentuknya gas dalam tabung

durham, kemudian dilanjutkan dengan metode gores kemedia EMBA (Eosin Metylen

Blue Agar) yang merupakan media diferensial untuk e.coli. Koloni spesifik tumbuh

dengan ciri-ciri bentuk bulat, diameter 2-3mm, warna hijau dengan kilap logam dan

bintik biru kehijauan di tengahnya. Satu koloni spesiifk yang terpisah diinokulasikan

pada media NA miring untuk memperbanyak biakan koloni. Kemudian dilanjutkan

dengan uji biokimia yang terdiri dari uji indol, uji merah metil, uji sitrat.

Prinsip

Pertumbuhan bakteri koliform setelah cuplikan diinokulasi pada media cair yang

sesuai, dengan mengamati adanya reaksi fermentasi cara pembentukan gas didalm

tabung durham.

Pereaksi Khusus

Media dan pengencer


Mac Conkey Broth (MCB)

Brilian Green Lactose Broth (BGLB)

Peralatan Khusus

Tabung reaksi dilengkapi tabung durham

Prosedur



Dengan cara aseptik diitimbang 25 cuplikan kedalam kantong stomaker steril.

Ditambahkan 225 ml PDF dan dikocok homogen hingga diperoleh suspensi dengan

pengenceran 10-1 disiapkan 2 tabung reaksi, masing-masing-masing berisi 9ml PDF.

Diambil 1ml dari pengenceran pertama lalu dipindahkan ke tabung kedua hingga

didapatkan pengenveran 10-2. Dilakukan hingga 10-3.

Uji presumtif

Untuk setiap pengenceran disiapkan 3 tabung reaksi berisi 9ml MCB yang dilengkapi

tabung durham. Kedalam tiap tabung dari masing-masing seri dimasukkan 1 ml

suspensi pengenceran. Semua tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam.

Setelah 24 jam dicatat dan diamati adanya gas yang terbentuk dalam tabung Durham

pada tiap tabung. Kemudiaan inkubasi dilanjutkan hingga 48 jam dan dicatat tabung-

tabung yang menunjukkan gas positif

Uji konfirmasi

Biakan dari tabung yang menunjukkan uji presumtif positif dipindahkan 1 sengkelit ke

dalam tabung reaksi berisi 10 ml BGLB yang telah dilengkapi dengan tabung durham.

Seluruh tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam. Dilakukan pengamatan

terhadap pembentukan gas.

Pernyataan hasil

Jumlah tabung yang positif gas dari uji konfimasi dicatat dan dirujuk ke tabel MPN.

Angka yang diperoleh pada tabel MPN menyatakan jumlah bakteri coliform dalam tiap

gram atau tiap ml contoh yang diuji



Tabel MPN ( Cara 3 Tabung )

Indeks MPN dan batas kepercayaan 95% bila digunakan 3 tabung

Jumlah Tabung Positif MPN per

g/ml

Batas

Kepercayaan 95%

1:10 1:100 1:1000 Terendah Tertinggi

0 0 0 <3 -- --

0 0 1 3 <0,5 9

0 1 0 3 <0,5 13

1 0 0 4 <0,5 20

1 0 1 7 1 21

1 1 0 7 1 23

1 1 1 11 3 36

1 2 0 11 3 36

2 0 0 9 1 36

2 0 1 14 3 37

2 1 0 15 3 44

2 1 1 20 7 89

2 2 0 21 4 47

2 2 1 28 10 150

3 0 0 23 4 120

3 0 1 39 7 130

3 0 2 64 15 380

3 1 0 43 7 210

3 1 1 75 14 230

3 1 2 120 30 380

3 2 0 93 15 380

3 2 1 150 30 440

3 2 2 210 35 470

3 3 0 240 36 1300

3 3 1 460 71 2400

3 3 2 1100 150 4800

3 3 3 >2400 -- --

Catatan :

Bila seri pengenceran yang digunakan melebihi dari yang tertera pada tabel, maka hasil

yang diperoleh dari tabel dikalikan faktor 10,100,1000 dan sebagainya. Misal: Bila

yang dipilih adalah dari pengenceran 10−2,10−3, 10−4, maka hasilnya dikalikan

dengan 10, bila yang dipilih adalah pengenceran 10−3, 10−4, dan 10−5 maka hasil,

dikalikan dengan 100.




1. Sampel apa yang dapat diuji untuk melakukan uji angka paling mungkin ?

. .

. .

. .

. .

. .

2. Sebutkan media selektif yang digunakan pada pengujian angka paling

mungkin?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Jelaskan hasil positif yang dihasilkan dari uji presumtif !

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

4. Jelaskan hasil positif yang dihasilkan dari uji konfirmasi!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .





No. Data Sampel Pengamatan dan

Perhitungan Kesimpulan

1

Nama Sampel :

Tempat pengambilan

sampel:


1. Mengapa terjadi perubahan warna dan pembentukan gelembung pada hasil

yang positif mengandung bakteri coliform ?

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




PERCOBAAN VII

Uji Biokimia terhadap Bakteri Salmonella

Uji Salmonella dalam sampel

Prinsip

Pemilihan Salmonella pada media pengkaya non selektif, dilanjutkan dengan

inokulasi pada media pengkaya selektif dan diinkubasi pada 43̊C, kemudian

dilakukan identifikasi terhadap koloni spesifik dari media selektif. Salmonella

dapat mereduksi bismuth, tidak memfermentasi laktosa, tetapi dapat menghasilkan

asam dari glukosa dan sukrosa serta dekarboksilasi lisin dan bersifat antigenik.

Pereaksi khusus

Media

Lactose Broth (LB)

Tetrathionate Brilliant Green Broth (TBGB)

Selenite Cystein Broth (SCB)

Brilliant Green Agar (BGA)

Bismuth Sulfite Agar (BSA)

Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

Lysine Iron Agar (LIA)

Nutrient Agar (NA)


Pereaksi

Larutan Natrium Klorida 0.85%

Salmonella antisera polivalen O

Peralatan Khusus

Stomaker

Prosedur

Pra-pengkayaan

Dengan cara aseptik ditimbang 25 g cuplikan ke dalam kantong stomaker kering,

ditimbang 225 ml PDF. Dihomogenkan menggunakan stomaker selama 30 detik

kemudian dipipet 10 ml ke dalam 90 ml LB, diinkubasi pada suhu 35-37̊C selama

18-24 jam.

Pengkayaan

Dengan cara aseptik dipipet biakan pra-pengkayaan masing-masing 10 ml ke dalam

100 ml media TBGB dan 100 ml SCB. Kemudian keduanya diinkubasi pada 43̊C

selama 24 jam.

Isolasi

Dari biakan TBGB dan SCB diinokulasi masing-masing 1 sengkelit pada



permukaan BGA dan BSA, kemudian diinkubasi pada suhu 35̊-37̊ selama 24-48

jam, koloni yang tumbuh diaamati. Biakan diduga Salmonella positif jika :

Pada BGA: koloni dari tidak berwarna, merah muda hingga merah, dari translusen

hingga keruh (opaque) dengan lingkaran merah muda hingga merah.

Pada BSA: koloni berwarna coklat abu-abu sampai hitam dan kadang-kadang

dengan kilap logam. Warna media di sekitar koloni mula-mula coklat,jika masa

inkubasi ditambah warna koloni menjadi hitam.

Identifikasi

Dipilih dua atau lebih koloni spesifik pada BGA dan BSA, diinokulasi pada media

NA, TSIA dan LIA dengan cara tusukan dan goresan. Diinkubasi pada 35̊-37̊

selama 24 jam. Biakan diduga Salmonella positif jika :

Pada TSIA: terlihat warna merah pada permukaan miring,warna kuning pada

biakan di dasar tabung atau tanpa pembentukan hydrogen sulphide (hitam).

Pada LIA: terlihat warna ungu lebih tua, di seluruh biakan.

Uji Serologi

Diambil 1 sengkelit biakan dari biakan NA miring dan disuspensikan

dengan 1 tetes larutan NaCl 0,85% pada kaca objek. Jika terjadi segera aglutinasi,

suspens tersebut tidak dapat dipakai untuk uji serologi. Jika tidak terjadi aglutinasi

spontan, diteteskan antisera Salmonella polivalen O pada suspensi. Kemudian

dihomogenkan dengan cara menggoyangkaca objek atau menggunakan sengkelit.

Diamati selama 1 menit jika terjadi aglutinasi berarti Salmonella positif.




1. Sampel apa yang dapat diuji untuk melakukan uji angka paling mungkin ?

. .

. .

. .

. .

. .

2. Sebutkan media selektif yang digunakan pada pengujian angka paling

mungkin?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Jelaskan hasil positif yang dihasilkan dari uji presumtif !

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

4. Jelaskan hasil positif yang dihasilkan dari uji konfirmasi!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .





No. Perlakuan Pengamatan Kesimpulan


Jelaskan perubahan warna yang terjadi pada setiap media selktif dan jelaskan

mengaja demikian!

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




PERCOBAAN VIII

Uji Angka Fenol

Prinsip

Membandingkan daya bunuh desinfektan dengan daya bunuh fenol baku

terhadap bakteri uji yang sama pada situasi dan kondisi yang sama dalam jangka

waktu kontak 10 menit dan tidak membunuh dalam waktu kontak 5 menit.

Tujuan Percobaan

Mengevaluasi daya anti mikroba suatu desinfektan, dengan memperkirakan

potensi dan efektifitas desinfektan berdasarkan konsentrasi dan lamanya kontak

terhadap kuman dan membandingkannya terhadap fenol standard yang disebut

koefisien fenol.

Teori

Bahan anti mikroba yang ditemukan memiliki keefektifan yang bermacam-

macam, dan penggunaannya pun ditujukan terhadap hal-hal yang berbeda-beda

pula. Salah satu jenis anti mikroba dikenal sebagai desinfektan, merupakan suatu

zat (biasanya kimia) yang dipakai untuk maksud desinfeksi pada bahan-bahan tidak

bernyawa.

Fenol adalah salah satu contoh desinfektan yang efektif dalam membunuh

kuman. Pada konsentrasi rendah, daya bunuhnya disebabkan karena fenol

mempresipitasikan protein secara aktif, dan selain itu juga merusak membran sel

dengan menurunkan tegangan permukaannya. Dengan persetujuan para ahli dan

peneliti, fenol dijadikan standar pembanding untuk menentukan aktivitas sesuatu

desinfektan.

Zat-zat antimikroba yang dipergunakan untuk disinfeksi harus diuji

keefektifannya. Cara menentukan daya sterilisasi zat-zat tersebut adalah dengan

melakukan tes koefisien fenol. Uji ini dilakukan untuk membandingkan aktivitas

suatu produk (desinfektan) dengan daya bunuh fenol dalam kondisi tes yang sama.

Berbagai pengenceran fenol dan produk yang dicoba dicampur dengan suatu

volume tertentu biakan Salmonella thyposa atau Staphylococcus aureus.

Pereaksi Khusus

Media

Nutrient Broth (NB)

Nutrient Agar (NA)

Peralatan Khusus

Tabung reaksi berbibir ukuran (20x150) mm dan (25x250) mm

Sengkelit platina diameter mata 4 mm

Prosedur

Persiapan media

Media Nutrient Broth (NB) dibuat dengan melarutkan 10 gram Bacto Pepton, 5

gram Beef Extract, 5 gram NaCl dalam 1 liter air suling, dicampur homogeny dan

pH dibuat 6,8. Media dibuat dalam tabung reaksi ukuran 20x150 mm dengan



volume 10 ml tiap tabung. Kemudian disterilkan dengan autoklaf pada 121̊C selama

15 menit.

Persiapan bakteri uji

Digunakan bakteri Salmonella typhi ATCC 6539 pada media NA yang telah

diinkubasi 48 jam pada suhu 35-37̊ . dari biakan NA miring diinokulasi 1 sengkelit

dalam media NB dan diinkubasi pada suhu 35-37̊ selama 24 jam. Bakteri uji yang

digunakan untuk uji koefisien fenol adalah biakan berusia 24 jam dan telah

mengalami peremajaan selama 3 kali dalam 3 hari berturut-turut, batas maksimum

peremajaan adalah 30 kali.

Persiapan larutan fenol baku

Ditimbang 50 gram kristal fenol dalam gelas piala dilarutkan dengan air suling

hingga 1 liter dan dijadikan sebagai larutan A. kadar fenol dari larutan dibakukan

dengan 0,1 N KBr-KBrO₃ dengan cara sebagai berikut: dipipet 25 ml larutan A

ditambah air suling hingga 500 ml, dicampur homogeny sebagai larutan B. dipipet

15 ml larutan B dalam Erlenmeyer bertutup ditambah 30 ml baku KBr-KBrO₃

ditambah 5 ml HCl 0,1N segera ditutup, kemudian dikocok teratur selama 30 menit

dan didiamkan selama 15 menit. Tutup Erlenmeyer dibuka sedikit, ditambahkan

dengan cepat 5 ml larutan 20% KI, usahakan tidak ada uap Br yang keluar dan

segera ditutup rapat. Dikocok seksama, tutup Erlenmeyer dibuka sedikit dan

dibagian leher dibilas sedikit dengan air suling, dijadikan sebagai larutan C yang

dititrasi dengan 0,1 N Na₂S₂O₃.

1 ml 0,1 N KBr-KBrO₃ = 0,001569 gram fenol

Cara perhitungan kadar fenol :

% fenol dalam larutan sediaan baku:

(30 - ml Na₂S₂O₃) x 0,001569 x 1333 x 100/1000

30 : volume larutan 0,1 N KBr-KBrO₃ yang ditambahkan

0,001569 : gram fenol ekivalen terhadap 1 ml 0,1 N KBr-KBrO₃

1333 : faktor pengenceran

1000 : volume larutan sediaan fenol baku

Larutan baku ini harus disimpan rapat dalam tempat yang sejuk dan terhindar dari

cahaya .

Setelah diperoleh kadar fenol yang sebenarnya maka dibuat larutan baku fenol 5%

sebagai berikut :

Ditimbang seberat 5% kristal fenol baku sesuai kadarnya dalam 100 ml air suling

steril, dikocok homogen. Dibuat pengenceran 1:80, 1:90, 1:100 di dalam tabung

steril ukuran (25x150) mm masing-masing 5 ml.

Persiapan larutan desinfektan uji

Dibuat larutan desinfektan yang diencerkan sesuai dengan yang tertera pada etiket

kemasan atau dibuat sedemikian rupa sehingga berada pada kisaran pengenceran

dengan daya bunuh terhadap bakteri uji dalam waktu kontak 5-15 menit .

Pengenceran dibuat dalam tabung reaksi ukuran (25x150) mm dengan volume

masing-masing 5 ml. Untuk larutan desinfektan uji dibuat 7 tingkat pengenceran.

Inokulasi



Disiapkan rak tabung reaksi sesuai ukuran tabung dengan kapasitas 40 dalam 4

deretan. Deretan pertama untuk tabung fenol baku dan desinfektan. Deret ke 2,3,4

untuk tabung media NB untuk waktu kontak 5,10, dan 15 menit. Semua tabung dan

biakan bakteri uji dimasukkan dalam tangas air suhu 20̊ dan dibiarkan selama 5

menit. Ke dalam tiap tabung pengenceran fenol baku dan desinfektan dimasukkan

0,5 ml suspense bakteri uji yang telah dikocok homogen. Waktu memasukkan

bakteri uji pada tabung pengenceran pertama dicatat sebagai 0 menit. Interval waktu

inokulasi antar tabung adalah 30 detik,sehingga untuk 10 tabung dapat Diselesaikan

selama 4,5 menit , setiap kali inokulasi diusahakan ujung pipet mendekati

permukaan cairan dan tidak menyentuh dinding tabung.Lima menit setelah bakteri

uji diinokulasikan pada tabung pertama segera dikocok , tabung dipegang dalam

posisi miring ±60 didekatkan nyala api , tangan kanan memegang sengkelit platina.

Dengan cara aseptic pindahkan satu sengkelit suspensi kedalam media NB deret ke

2 satu persatu dengan selang waktu 30 detik sampai tabung ke 10. Sepuluh menit

setelah bakteri uji diinokulasikan pada tabung pengenceran pertama setelah dikocok

, pindahkan 1 sengkelit suspensi dalam media NB deret 3 sama seperti di atas. Lima

belas menit setelah bakteri uji diinokulasikan pada tabung pengenceran pertama

setelah dikocok , pindahkan 1 sengkelit suspense kedalam media NB deret ke 4.

Semua tabung yang telah diinokulasikan dikocok homogeny kenudian diinkubasi

pada suhu 35-37 0c selama 48 jam dan diamati adanya pertumbuhan bakteri pada

setiap tabung. Jika ada pertumbuhan yang masih meragukan maka dapat dilakukan

konfirmasi dengan uji serologi.

Perhitungan

Koefisien fenol adalah hasil bagi dari factor pengenceran tertinggi desinfektan

dengan factor pengenceran tertinggi baku fenol yang masing-masing dapat

membunuh bakteri uji dalam masa kontak 10 menit tetapi tidak dalam masa kontak

5 menit (lihat table 1 dan 2)

Tabel 1

Contoh hasil pengamatan baku fenol

Baku Lama kontak

Pengenceran 5 menit 10 menit 15 menit

1:80 0 0 0

1:90 + 0 0

1:100 + + +

Tabel 2

Contoh hasil pengamatan desinfektan

Desinfektan x Lama kontak

Pengenceran 5 menit 10 menit 15 menit

1:100 0 0 0

1:150 0 0 0

1:200 0 0 0

1:250 + 0 0

1:300 + + 0

1:350 + + +



1:400 + + +

Koefisien fenol = 250/90 = 2,77 (2,8)

Pengujian dianggap memuaskan jika baku fenol memberikan hasil seperti pada

tabel 3,

Tabel 3

Tabel hasil uji baku fenol yang memenuhi syarat

Pengenceran Lama kontak

5 menit 10 menit 15 menit

1:80 +/0 0 0

1:90 +/0 +/0 0

1:100 + + +/0

Bila dari dua pengenceran pertama dari baku fenolyang diuji tidak ada satupun

tabung pengenceran yang memberikan hasil positif dalam masa kontak 5 menit dan

memberikan hasil pertumbuhan negative dalam masa kontak 10 menit,maka

diperkirakan bahwa pengenceran yang diharapkan berada di antara pengenceran

kedua (1:90) dan pengenceran ketiga ( 1:100) Lihat table 4 dan 5.

Tabel 4

Contoh hasil perkiraan uji baku fenol



1:80 0 0 0

1:90 0 0 0

1:100 + + 0

Tabel 5

Contoh hasil perkiraan uji desinfektan



1:80 0 0 0

1:90 0 0 0

1:100 + + 0

Jadi angka perkiraan untuk baku fenol antara 0-100, untuk desinfektan antara 50-

400 koefisien fenol = 375/95 = 3,95




1. Jelaskan perbedaan desinfektan, aseptic dan sanitaizer!

. .

. .

. .

. .

. .

2. Mengapa pada uji koefisien fenol digunakan senyawa fenol sebagai

baku/pembanding?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Mengapa digunakan bakteri salmonella typhi pada pengujian koefisien fenol?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

4. Jelaskan kelemahan pengujian desinfektan dengan menggunakan metode

koefisien fenol!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .







1. Jelaskan metode-metode yang digunakan untuk pengujian desinfektan?

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




PERCOBAAN IX

Uji sterilitas

Prinsip

Pertumbuhan jasad renik pada media tertentu yang diinokulasikan dan diinkubasi

pada suhu yang sesuai.

Pereaksi khusus

Media

Fluid Thioglycollate Medium (FTM)

Tryptic Soy Broth (TSB)

Peralatan Khusus

Laminar Airflow Cabinet (Lemari Aseptik), Pipet Kamagome Atau Alat Suntik

PROSEDUR

Uji Fertilitas Media

disiapkan 4 tabung berisi 15 FTM dan 2 tabung berisi 15 ml TSB . Ke dalam 2

tabung FTM diinokulasi masing-masing 0,1 ml suspensi Bacillus Substilis ATCC

6633 (1000 spora hidup per ml), ke dalam 2 tabung FTM lainnya 0,1 ml suspensi

Clostridium Sporagenes NIHJ (1000 sel hidup per ml). Kedalam 2 tabung TSB

masing-masing diinokulasi 0,1 suspensi Candida Albicans NIHJ (1000 sel hidup

per ml). Pengujian ini dilakukan bersamaan dengan uji sterilitas contoh tabung-

tabung berisi FTM diinkubasi pada suhu 35 0-370 c dan tsb pada suhu 20-250 c

selama tidak kurang dari 7 hari.

Uji Efektivitas Media

Sebanyak 4 tabung berisi masing-masing 15 ml FTM dan 2 tabung berisi 15 ml

TSB diinokulasikan 1 ml contoh ke dalam semua tabung.pada 2 tabung FTM

diinokulasikan masing-masing 0,1 ml suspense Bascillus Susbtilis ATCC 6633

(1000 spora hidup per ml ), ke dalam 2 tabung FTM lainnya 0,1ml suspensi

Clostridium Sporagenes NIHJ (1000 sel hidup per ml) ke dalam 2 tabung TSB

masing-masing diinokulasi 0,1 ml suspense Candida Albicans NIHJ (1000 sel

hidup per ml). pengujian ini dilakukan bersamaan dengan uji sterilitas contoh

tabung-tabung berisi FTM diinkubasi pada suhu 350-370 c dan TSB pada suhu 20-

250c selama tidak kurang dari 7 hari.

Uji Sterilitas Media

Sebanyak 2 tabung berisi masing-masing media 15 ml FTM dan 15 ml daei bets

yang sama, diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama dengan media yang

digunakan untuk uji sterilitas.

Cara penetapan

Pengujian dilakukan dalam Laminar Airflow Cabinet yang sebelumnya telah

disucihamakan dengan etanol 70% atau larutan benzalkonium klorida 0,2 % steril

dan telah dijalankan selama 30-60 menit. Secara aseptic diambil 2 bagian cuplikan



seberat 250-500 mg dari bagian paling dalam contoh atau kseluruhan contoh bila

ukurannya kecil kemudian masing-masing cuplikan dimasukkan kedalam 100 ml

FTM dan 100 ml TSB . Media FTM diinkubasi pada suhu 350-37 0 dan media TSB

20-25 0C selama tidak kurang 14 hari.

Pengamatan dan penafsiran hasil uji

Tahap pertama

Pada interval waktu tertentu dan akhir periode inkubasi, diamati secara

makroskopis dan pertumbuhan jasad renik didalam tabung.Bila tidak ada

pertumbuhan dikatakan bahwa sample memenuhi syarat sterilitas . bila ada

pertumbuhan dan dapat dibuktikan dari pemantauan bahwa pengujian , bahan yang

digunakan pengujian,maka dinyatakan tidak absah dan tahap pertama harus diulang

.Bila ada pertumbuhan dan terbukti pengujian tahap pertama absah, dilakukan tahap

kedua.

Tahap kedua

Jumlah contoh minimum dua kali dari jumlah contoh pada pengujian tahap

pertama.Bila tidak terdapat pertumbuhan jasad renik, maka dinyatakan sampel

memenuhi syarat sterilitas. Bila ada pertumbuhan maka dinyatakan sampel tidak

memenuhi syarat sterilitas kecuali dapat dibuktikan bahwa tahap kedua tidak absah.

Dalam hal ini pengujian tahap kedua dapat diulang dengan contoh dan cara yang

sama.




1. Jelaskan pengertian sterilitas, fetilitas dan efektivitas!

. .

. .

. .

. .

. .

2. Mengapa uji sterilitas perlu dilakukan terhadap sediaan farmasi dan alat

kesehatan steril?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Mengapa digunakan bakteri Bacillus substilis pada pengujian sterilitas?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

4. Jelaskan tujuan uji sterilitas, uji fertilitas, dan uji efektivitas, serta mengapa

dilakukan uji tersebut!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .







1. Jelaskan metode-metode yang digunakan untuk pengujian sterilitas?

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




PERCOBAAN X

Uji efektivitas pengawet

Tujuan

Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Sarjana (S-1) Farmasi

Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk :

a. Melakukan pengujian efektivitas pengawet ;

b. Menentukan efektivitas pengawet terhadap bakteri uji.

Alat Yang Dibutuhkan

Vortex mixer, cawan petri , alat penghitung koloni dan neraca analitik.

Bahan Yang Digunakan

Triptic Soy, Agar (TSA), Potato Dextrose Agar (PDA), Lactose Broth (LB),biakan

bakteri Staphylococcus Aureus , biakan jamur Candida Albicans

Prosedur

Ditimbang 1 gram atau ambil 1 ml sampel,dimasukkan ke dalam wadah steril.

Ditambahkan 0.1 ml suspensi inokulum bakteri atau jamur dan diencerkan dengan LB

hingga diperoleh pengenceran 10-1-10-6,diambil 1 ml dari setiap pengenceran dan

dipindahkan secara aseptis ke dalam petri (masing-masing duplo), ditambahkan 15 ml

media,dihomogenkan . dibiarkan media memadat, kemudian diinkubasi cawan pada

suhu 35±2 oC ( untuk bakteri) dan 35±2 oC untuk jamur selama 2 hari. Dihitung jumlah

koloni bakteri dan jamur pada hari ke 7,14,21 dan 28.

Suatu pengawet dikatakan efektif jika:

a. a.pada hari ke 14 jumlah koloni tidak lebih dari 0,1%dari jumlah awal.

b. b.selama 14 hari pertama jumlah koloni ragi atau kapang sama dengan atau

kurang dari jumlah awal.

jumlah mikroba uji selama waktu tersisa dari 28 hari tetap atau kurang dari

bilangan yang disebut pada a dan b.




1. Sebutkan 5 macam pengawet alami!

. .

. .

. .

. .

. .

2. Sebutkan 5 Macam Pengawet sintesis!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Jelaskan syarat keberadaan pengawet dalam suatu sediaan farmasi dan

dalam makanan!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

4. Jelaskan syarat-syarat pengawet yang efektif!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .







1. Perlukah suatu pengawet ditambahkan pada makanan maupun sediaan

farmasi? Jelaskan pendapatmu!

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




PERCOBAAN XI

Uji Aktivitas Antimikroba

Prinsip

Uji aktivitas antimikroba dengan melakukan pengujian konsentrasi hambat

minimum (KHM) mikroba berdasarkan metode difusi agar menggunakan pencadang

logam/gelas/kertas, dimana konsentrasi senyawa obat tertentu dimasukkan kedalam

masing-masing pencadang kemudian diukur zona bening disekitar pencadang sampai

diperoleh konsentrasi senyawa obat terkecil yang masih memberikan daya hambat.

Pengujian Antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri senyawa obat tertentu (antimikroba) dilakukan

dengan metode difusi agar menggunakan pencadang logam, bakteri yang digunakan

antara lain bakteri Salmonella, B.Subtilis. Staphylococus epidermidis, Klebsiella

pneumonia,M. lutea, P.acne, B.Pumilus, MRSA, Staphylococus aureus, E.coli. Jamur

yang digunakan antara lain Candida albicans, Rhizopus oryzae.

Pengenceran Senyawa Obat (Antimikroba)

Masing-masing bahan obat atau ekstrak bahan alam yang diduga mempunyai

aktivitas antibakteri ditimbang sebanyak 5 g kemudian dilarutkan dalam DMSO

dan/atau fenol (pa) pada labu tentukur 10 ml sehingga diperoleh konsentrasi 500 mg/ml

selanjutnya dibuat pengenceran 400 mg/ml, 300 mg/ml dan seterusnya sampai pada

konsentrasi tertentu yang tidak memberikan daya hambat lagi.

Sterilisasi Alat

Alat-alat dan bahan-bahan untuk pemeriksaan mikrobiologi harus disterilkan

terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di oven pada suhu 170ºC

selama 1-2 jam dan alat-alat jenis lainnya disterilkan di autoklaf pada suhu 121ºC

selama 15 menit, jarum ose dibakar dengan lampu spiritus.

Media

Media yang digunakan:

1. Nutrient Agar (NA)

2. Nutrient Broth (NB)

3. Mueller Hinton Agar (MHA)

Larutan pengencer

1. Dimetil sulfoksida (DMSO)

2. Etanol (pa)

Pembuatan Inokulum



Koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril lalu

disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan nutrient broth. Diinkubasi

pada waktu beberapa menit pada suhu 35±2ºC. Kemudian diukur kekeruhan larutan

pada panjang gelombang 580 nm sampai diperoleh transmitan 25% (Ditjen POM,

1995).

Pengujian Antibakteri

Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15 ml

MHA dicawan petri steril, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Pada media

yang telah padat ditanam cincin pencadang logam/gelas atau kertas (dengan merendam

kertas selama 30 menit pada masing-masing konsentrasi uji), kemudian pada masing-

masing pencadang dimasukkan masing-masing larutan obat sebagai konsentrasi dan

larutan blanko (DMSO atau etanol), Kemudian diinkubasi pada suhu 36-37ºC selama

18-24 jam untuk bakteri dan 22-25ºC selama 36-48 jam untuk jamur. Selanjutnya

masing-masing petri diukur diameter daerah bening disekitar cincin pencadang

menggunakan jangka sorong dengan satuan mm. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali

(Ditjen POM, 1995).




1. Jelaskan prinsip pengujian konsentrasi hambat minimum (KHM) dengan

metode Kirby-Bauer!

. .

. .

. .

. .

. .

2. Jelaskan Mengapa inokulum harus diatur agar menghasilkan transmitan

25% pada panjang gelombang 580nm!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Jelaskan pengertian mikroba susceptible, intermediet, dan resisten terhadap

antibiotik!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

4. Jelaskan Metode-metode uji aktivitas antimikroba lainnya!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .







1. Jelaskan aplikasi uji kepekaan mikroba di bidang farmasi klinis!

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )




PERCOBAAN XII

Uji Potensi Antibiotik

Tujuan

Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa Program Studi Sarjana (S-1) Farmasi

Fakultas Farmasi USU memiliki keterampilan untuk:

a. Melakukan pengujian potensi antibiotik dengan metode lempeng silinder

b. Menghitung potensi antibiotik terhadap mikroba

c. Mengevaluasi mutu produk antibiotik berdasarkan monografi uji potensi antibiotik

menurut Farmakope Indonesia Edisi IV.

Alat yang dibutuhkan

Cawan petri, pencadang logam/gelas/kertas, pinset, labu tentukur, pipet volumetrik dan

pipet mikro.

Bahan yang digunakan

Antibiotik uji dan baku (Kloramfenikol dan Tetrasiklin), Nutrient Agar, Air suling,

Natrium Klorida 0,9%, asam klorida 0,1 N, mikroba uji (Escherichia coli dan

Staphylococcus aureus).

Prosedur

Penyiapan Larutan Induk Baku (LIB) Kloramfenikol

Timbang teliti 1 g kloramfenikol baku, larutkan dalam air suling dan cukupkan hingga

100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 µg/ml. Diencerkan dengan air suling

(Perbandingan 1:1,25)

untuk memperoleh konsentrasi kloramfenikol 1,6;2,0;2,5;3,125 dan 3,906 µg/ml.

S1 (1,6 µg/ml) : ambil 1,600 ml LIB , diencerkan dengan air suling hingga 10 ml.





Penyiapan Larutan Induk Baku (LIB) Tetrasiklin

Timbang teliti 1 g tetrasiklin, dilarutkan dalam asam klorida 0,1 N dan dicukupkan

hingga 100 ml (Konsentrasi 10 µg/ml). Diencerkan dengan air suling untuk

memperoleh konsentrasi 0,1536;0,192;0,24;0,30 dan 0,375 µg/ml.



S1 (0,1536 µg/ml) : ambil 0,1536 ml LIB , diencerkan dengan air suling hingga 10

ml.





Penyiapan Larutan Kloramfenikol Uji

Ditimbang sediaan setara dengan 1 g kloramfenikol, dilarutkan dalam air suling dan

dicukupkan hingga 100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 µg/ml. Diambil secara

aseptik 2,5 ml larutan dan diencerkan dengan air suling hingga 10 ml untuk

memperoleh konsentrasi kloramfenikol 2,5 µg/ml.

Penyiapan Larutan Tetrasiklin Uji

Ditimbang sediaan setara dengan 1 g tetrasiklin, dilarutkan dalam asam klorida 0,1 N

dan dicukupkan hingga 100 ml untuk memperoleh konsentrasi 10 µg/ml. Diambil

secara aseptik 0,24 ml larutan dan diencerkan dengan asam klorida 0,1 N hingga 10 ml

untuk memperoleh konsentrasi tetrasiklin 0,24 µg/ml.

Penyiapan Inokulum E.coli dan S. aureus

Diambil sengkelit koloni E.coli dan S.aureus masing-masing dari biakan agar yang

telah diinkubasi selama 24 jam. Dipindahkan dalam tabung berisi larutan NaCl 0,9%,

dikocok hingga terdispersi secara merata. Diencerkan secara bertahap hingga diperoleh

inokulum yang menghasilkan transmitan 25% pada panjang gelombang 580 nm.

Pengujian Potensi Antibiotik

Disiapkan 5 cawan petri, diambil 0,1 ml biakan bakteri dan dicampur dengan

15 ml media dalam masing-masing cawan, dibiarkan memadat. Ditanamkan 7

pencadang logam/gelas pada 4 cawan, dimasukkan 0,1 ml LIB kloramfenikol secara

berselang-seling dengan S3, 1 pencadang diisi dengan 0,1 ml air suling sebagai kontol.

Ditanamkan 7 pencadang logam/gelas pada 1 cawan sisa, isi dengan larutan

kloramfenikol uji (U3) dan LIB kloramfenikol (S3). Diinkubasi pada suhu 35±2ºC

selama 24-48 jam. Setelah inkubasi diukur diameter daerah hambat. Prosedur yang

sama dilakukan terhadap tetrasiklin (Depkes, 1995).




1. Jelaskan pengertian potensi antibiotik!

. .

. .

. .

. .

. .

2. Jelaskan prinsip uji antibiotik!

. .

. .

. .

. .

. .

. .

3. Mengapa uji potensi antibiotik dilakukan?

. .

. .

. .

. .

. .

. .

. .







1. Jelaskan mengapa pecadang kertas/logam/gelas dari masing-masing

konsentrasi diletakkan secara berselang-seling dengan dosis tengah (S3)!

.

Medan, 2019


Tanggal ACC:

( ) ( )


penuntun dan laporan praktikum mikrobiologi farmasi · 2020. 7. 8. · sterilisasi alat cara...

Documents