makmal mikrobiologi

AGAR MacCONKEY

Penyediaan Agar MacConkey

Bahan yang diperlukan:

i) Gelatin

ii) Laktosa monohidrat

iii) Natrium klorida

iv) Pepton

v) Garam hempedu

vi) Neutral red

vii) Krystal violet

Prinsip

Agar MacConkey digunakan isolasi dan identifikasi Enterobacteriaeceae daripada sampel

feses, urin, dan sebagainya. Ia juga bertindak sebagai agar pemilih bagi bakteria gram negatif.

Gelatin dan pepton member sumber nitrogen, vitamin, mineral dan asid amino untuk

pertumbuhan bakteria. Natrium klorida membekalkan elektrolit untuk pengangkutan dan

kesimbangan osmotik manakala laktosa pula yang membekalkan karbon dan tenaga. Kristal

violet dan hempedu pula merupakan agen pemilih yang bertindak sebagai inhibitor kepada

bakteria gram positif. Neutral red bertindak sebagai indikator pH.

Prosedur:

1. Serbuk agar seberat 50 gram disediakan dan dimasukkan ke dalam satu liter air

suling.

2. Kemudiannya dipanaskan dan digaul sehingga sebati.

3. Agar dididihkan selama satu minit.

4. Didihan agar kemudiannya dimasukkan ke dalam botol dan disterilkan dalam

autoclave pada suhu 121°C selama 15 minit.

5. Setelah itu, botol disejukkan pada suhu 45 – 50 °C dan disebatikan.

6. Tuang kedalam piring petri yang steril dan digoncangkan sesekali untuk

mengelakkan agar mengeras.

7. Agar yang sudah siap disimpan pada suhu 8 - 15°C.

Keputusan:

Organisma Warna Ciri – ciri

Esherichia coli Merah ke merah jambu -Tidak mukoid

-Bulat

Klebsiella Merah -Mukoid

-Bersaiz besar

Serratia Merah ke merah jambu Mukoid

Proteus Tidak berwarna dan jernih ‘Swarming’

Salmonella Tidak berwarna dan jernih

Shigella Tidak berwarna dan jernih

atau merah pucat

AGAR HEKTOEN

Penyediaan Agar Hektoen

Bahan yang digunakan:

i) Enzim dari tisu haiwan

ii) Ekstrak yis

iii) Garam hempedu

iv) Laktosa, sukrosa, salicin

v) Natrium klorida

vi) Natrium thiosulfida

vii) Ferrik ammonium sitrat

viii)Asid fushin

ix) Agar.

Prinsip:

Agar Hektoen digunakan untuk isolasi dan membezakan Salmonella spp dan Shigella spp yang

mana kedua-dua bakteria ini menginfeksi salur gastrousus manusia. Kandungan agar hektoen

memberikan fungsi yang berbeza kepada agar. Enzim yang diekstrak dari tisu haiwan

membekalkan nitrogen, karbon, dan asid amino untuk pertumbuhan organism.

Manakala ekstrak yis bertindak sebagai sumber vitamin dan garam hempedu dan asid fushin

pula sebagai inhibitor kepada bakteria gram positif. Laktosa, sukrosa dan salicin adalah

karbohidrat fermenter. Natrium klorida mengekalkan kesimbangan osmotik bagi agar tersebut

dan ferrik ammonium sitrat menjadi sumber ferum dan membolehkan penghasilan hidrogen

sulfide daripada natrium thiosulfida.

Prosedur:

1. Serbuk agar seberat 50 gram disediakan dan masukkan ke dalam 1liter air

suling.

2. Kemudian dipanaskan dan digaul sehingga sebati.

3. Agar dididihkan selama satu minit.

4. Kemudian, disejukkan selama 10 minit dan disebatikan

5. Agar dituang ke dalam piring petri yang steril dansesekali digoncang untuk

mengelakkan agar menjadi solid.

6. Agar yang sudah siap disimpan pada suhu 8 - 15°C.

Keputusan:

Koloni berwarna merah ke oren: Esherichia coli

Koloni berwarna hijau: Shigella flexneri

THIOSULFATE CITRATE BILE SUCROSE SUGAR (TCBS)

Penyediaan Agar Thiosulfate Citrate Bile Sucrose Sugar (TCBS)


i) Ekstrak yis

ii) Enzim kasein

iii) Enzim dari tisu haiwan

iv) Natrium sitrat

v) Natrium thiosulfat

vi) Oxbile

vii) Natrium klorida

viii) Sukrosa

ix) Ferrik sitrat.

Prinsip:

Agar TCBS digunakan sebagai agar pemilih bagi mengisolasi Vibrio cholerae. Ekstrak yis,

enzim kasein dan enzim dari tisu haiwan membekalkan nitrogen, vitamin, dan asid amino dalam

agar TCBS. Manakala natrium sitrat, natrium thiosulfat dan oxbile bertindak sebagai agen

pemilih yang membekalkan pH alkali untuk inhibitor organisma gram positif. Peningkatan pH

digunakan untuk menggalakkan pertumbuhan Vibrio cholera kerana bakteria ini sensitif kepada

asid. Sukrosa pula sebagai karbohidrat fermenter dan natrium klorida meransang pertumbuhan

organisma dan mengekalkan kesimbangan osmotik.

Prosedur:

1. Sediakan serbuk agar seberat 50 gram dan masukkan ke dalam 1liter air suling.

2. Panaskan dan gaulkan sehingga sebati.

3. Didihkan selama 1minit.

4. Biarkan selama 10 minit untuk sejukkannya dan sebatikannya.

5. Tuang kedalam piring petri yang steril.

6. Simpan agar yang sudah siap pada suhu 8 - 15°C.

Keputusan:

Koloni berwarna kuning: Vibrio alginolyticus.

Koloni berwarna kuning: Vibrio cholerae.

Koloni berwarna hijau: Vibrio paarhaemolyticus.

AGAR NUTRIENT

Penyediaan Agar Nutrient


i) 23 g serbuk agar nutrient.

ii) Air suling.

iii) Botol universal satu liter.

iv) Autoclave.

v) Piring petri.

Prinsip:

Nutrient agar merupakan medium asas bagi kebanyakan mikroorganisma. Ia juga merupakan

asas pengkulturan bagi kebanyakan mikroorganisma. Ia juga merupakan asas bagi kebanyakan

media seperti agar chocolate, dan media lain yang kompleks. Nutrien agar juga boleh disimpan

di dalam tube. Kegunaan nutrient agar adalah untuk subkultur dan kekalkan patogen bukan

fastidious.

Prosedur:

1. 23 g serbuk agar nutrient dimasukkan dalam bekas steril.

2. Kemudian air suling dimasukkan sehingga mencapai paras satu liter.

3. Campuran tersebut dipanaskan dengan kacauan yang kerap.

4. Sesudah mendidih, agar dibiarkan selama satu minit.

5. Air agar dimasukkan dalam botol universal.

6. Botol tersebut diaotoclave pada suhu 121ºC selama 15 minit.

7. Botol dibiarkan sekejap, dan kemudian dituangkan ke dalam piring petri.

AGAR DARAH

Penyediaan Agar Darah


i) 42.5 g Columbia Base Agar.

ii) Air suling.

iii) Botol universal.

iv) Autoclave.

v) 5% darah.

vi) Piring petri.

Prinsip:

Agar darah merupakan agar diperkaya yang digunakan untuk membesarkan sejumlah besar

organisma yang sederhana memilih. Ia juga digunakan untuk mengesan perbezaan hemolisis

bakteria.

Darah yang digunakan untuk agar daras mestilah bebas lisis dan berantikougulasi dan

difibrinasi. Ia boleh jadi darah kuda, kambing biri-biri, atau darah arnab. Citrat darah manusia

yang luput turut boleh digunakan. Citrat boleh merencat pertumbuham beta hemolitik

streptococci. Sebelum digunakan, sejukkan dalam peti sejuk semalaman.

Prosedur:

1. Sediakan 42.5 g Columbia Base Agar.

2. Air suling dicampurkan ke dalam agar sehingga mencecah paras satu liter.

3. Campuran tersebut dipindahkan ke dalam botol universal.

4. Kemudian botol tersebut diautoclave pada suhu 121ºC selama 15 minit.

5. Kemudian, botol tersebut dikeluarkan daripada autoclave dan dibiarkan pada suhu bilik

sehingga suhu 45ºC hingga 50ºC.

6. 5% darah yang steril kemudiannya dimasukkan ke dalam botol tersebut dan disebatikan.

7. Serta merta, agar dituangkan ke dalam piring petri sambil digoncang sekali-sekala untuk


Keputusan:

Streptococcus spp: α-hemolisis; bakteria sedikit pecahkan sel darah merah dan

ukuran lisis kecil.

β-hemolisis; bakteria sepenuhnya memecahkan sel darah merah.

Ukuran lisis yang besar.

Ƴ-hemolisis; tiada pemecahan sel darah merah. Tiada ukuran

lisis.

AGAR CHOCOLATE

Penyediaan Agar Chocolate


i) 42.5 g Columbia Base Agar.

ii) Air suling.

iii) Botol universal steril.

iv) Autoclave.

v) 5% sel darah merah.

vi) Piring petri.

Prinsip:

Agar chocolate merupakan agar bukan pemilih, diperkaya media tumbesaran. Ia mengandungi

sel darah merah yang telah dilisiskan dengan memanaskan secara perlahan sehingga 56ºC.

agar ini digunakan untuk tumbesaran bakteria fastidious bakteria respirasi seperti Haemophilus

influenza. Bakteria ini memerluka faktor tumbesaran seperti nicotinamide adenosine

dinucleotide (NAD) dan hematin yang terdapat pada sel darah merah. Oleh itu cara yang baik

untuk prtumbuhan adalah menggunakan sel darah merah yang lisis.

Prosedur:

1. Sediakan 42.5 g Columbia Base Agar.

2. Air suling dicampurkan ke dalam agar sehingga mencecah paras satu liter.

3. Campuran tersebut dipindahkan ke dalam botol universal.

4. Kemudian botol tersebut diautoclave pada suhu 121ºC selama 15 minit.

5. Kemudian, botol tersebut dikeluarkan daripada autoclave dan dibiarkan pada suhu bilik

seketika.

6. Setelah suhu botol mencecah 56ºC, 5% darah yang steril kemudiannya dimasukkan ke

dalam botol tersebut dan disebatikan. Ini untuk melisiskan sel darah merah.

7. Serta merta, agar dituangkan ke dalam piring petri sambil digoncang sekali-sekala untuk


Keputusan:

Media gelap dan bersih: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus simulans, dan Streptococcus faecalis.

Media kekuningan: alpha-hemolytic spesis Streptococcus.

AGAR CYSTEINE-LACTOSE-ELECTROLYTE-DEFICIENT (CLED)

Penyediaan Agar CLED


i) 36 g serbuk CLED.

ii) Botol universal steril.

iii) Air suling.

iv) Autoclave.

v) Piring petri.

Prinsip:

Agar CLED ialah medium pembeza yang bukan selektif untuk tumbesaran dan enumerasi

mikroorganisma salur urinari. Kehadiran sodium klorida merencat perebakan Proteus dan

memberikan tumbesaran pada mikroorganisma salur urinari dan ia digunakan untuk membeza

dan mengenalpasti mereka. Kehadiran pengkontaminaan bakteria seperti Diphtheroids,

Lactobacilli dan mikroorganisma lain sebagai pengukur darjah penjagaan yang diambil dalam

melaksanakan spesimen urin.

Ekstrak dagine lembu dan pepton kasein membekalkan nitrogen, vitamin, mineral dan asid

amino untuk tumbesarah lebihan. Laktosa merupakan bahan fermentasi karbohidrat

memberikan karbon dan tenaga. L-Cystine ditambah sebaigai pembesaran tambahan untuk

cystine pembentukan coliform secara sendiri. Membezakan fermentasi laktosa dan bukan

fermentasi laktosa diperolehi dengan menggunakan Bromothymol biru sebagai indikasi pH.

Organisma yang menapaikan laktosa akan menurunkan pH dan mengubah warna medium

daripada hijau ke kuning.

Mikroorganisma yang sebabkan infeksi dalam salur urinari secara umumnya diabaikan dan

hanya satu spesis. E. coli ialah mikroorganisma yang paling kerap di isolasi. Pembilangan

100.000 (105)/ml atau banyak merupakan indikasi signifikan infeksi salur urinari.

Prosdur:

1. 26 g serbuk agar CLED dimasukkan dalam bekas steril.



4. Sesudah mendidih, agar dibiarkan selama satu minit.




Keputusan:

Mikroorganisma Pembesaran Warna medium

Fermentasi atau

bukan fermentasi

laktosa

Enterobacter

aerogenes

Baik Kuning cerah - biru Bukan fermentasi

Escherichia coli Baik Merah jambu Fermentasi

Proteus vulgaris Baik (tiada swarming) Biru – biru hijau Bukan fermentasi

Staphylacoccus

aureus

Baik Kuning cerah Bukan fermentasi

Enterococcus faecalis Baik Kunig cerah Bukan fermentasi

Klebseila pneumonia Baik Merah jambu Fermentasi

Kleibseila spp Baik Merah jambu Fermentasi

Citrobacter freundii Baik Merah jambu Fermentasi

AGAR TRIPLE SUGAR IRON (TSI)

Penyediaan Agar TSI


i) 65 g serbuk TSI.

ii) Air suling.

iii) Botol universal.

iv) Autoclave.

v) Tabung uji.

Prinsip:

Pencernaan enzimatik kasein, pencernaan enzimatik tisu haiwan dan kulat diperkaya pepton

memberikan nitrogen, karbon, dan vitamin yang diperlukan untuk pembesaran organisma. TSI

mengandungi tiga karbohidrat, dekstros, laktosa, dan sukrosa. Apabila karbohidrat telah

ditapaikan, penghasilan asid akan dikesan oleh fenol merah indikasi pH. Sodium tiosulfat

dikurangkan kepada hidrogen sulfida, dan hidrogen sulfida bertindak balas dengan garam iron

membentuk iron sulfida hitam yang serupa. Ferik amonia sitrat adalah hidrogen sulfida (H2S)

indikasi. Sodium klorida berfungsi mengekalkan keseimbangan osmotik pada medium. Agar

ialah agen solidifikasi.

Prosedur:

1. 65 g serbuk agar TSI dimasukkan dalam bekas steril.



4. Sesudah mendidih, agar dibiarkan selama satu minit untuk larutan lengkap.



7. Botol dibiarkan sekejap, dan kemudian dituangkan ke dalam tabung uji secara condong.

Keputusan:

Mikroorganisma

Approx.

Inoculum

(CFU)

Anggaran Keputusan

Baikpulih Slant Butt Gas H2S

Escherichia coli Berat Tumbuh A A + -

Proteus mirabilis Berat Tumbuh K A - +

Pseudomonas aeruginosa Berat Tumbuh K K - -

Salmonella typhimurium Berat Tumbuh K A +/- -

Shigella flexneri Berat Tumbuh K A - -

Kata kunci: A, asid.

K, alkali.

-, negatif.

+, positif.

+/-, pertumbuhan positif dan negatif.

Slant alkali - butt asid (merah/kuning): Fermentasi dekstros sahaja.

Slant asid - butt asid (kuning/kuning): Fermentasi dekstros, laktosa, dan atau

sukrosa.

Slant alkali-butt alkali (merah/merah): Dekstros dan laktosa tidak difermentasi.

Mediaum mekahan, pisahan atau buih: Penghasilan gas.

Butt warna kehitaman: Penghasilan hidrogen sulfida (H2S).

AGAR MORTILITY-INDOL-ORNITHIN (MIO)

Penyediaan agar MIO


i) 31 g serbuk agar MIO.

ii) Air suling.

iii) Botol universal steril.

iv) Autoclave.

v) Tabung uji.

Prinsip:

Mortiliti adalah untuk memerhatikan kekeruhan dalam medium. Pada organisma yang tidak

motil, pertumbuhan boleh dilihat melalui rekahan dalam medium disebabkan oleh penghasilan

gas, tetapi akan terdapat poket yang bersih tanpa pertumbuhan.

Dikarboksilasi ornitin adalah untuk memerhati di bahagian bawah 3/4 iaitu kawasan anaerobik

pada medium untuk perubahan dalam warna pada indikasi pH; pertumbuhan mesti hadir pada

bahagian tiub ini untuk analisa keputusan yang betul; warna kelabu, biru atau ungu merupakan

reaksi positif untuk ornitin dikarboksilasi iaitu pembentukan produk alkali yang sangat tinggi,

peneutralan asid yan melampau dihasilkan daripada penapaian glukosa. Warna kuning

merupakan reaksi negatif. Merupakan default penghasilan asid daripada penapaian glukosa.

Penghasilan indol berlaku apabila titisan reagen Kovacs ditambah pada medium. Gegelang

merah akan terhasil pada indol daripada pemecahan trytophan.

Prosedur:

1. 31 g serbuk agar MIO dimasukkan dalam bekas steril.






7. Botol dibiarkan sekejap, dan kemudian dituangkan ke dalam tabung uji.

Keputusan:

No. tabung uji (sebelah kanan setiap tabung uji

telah ditambah dengan reagen Kovaks) 1 2 3

Kehadiran asid amino (aerobik alkali) + + +

Mortiliti (kekeruhan) - + +

Dikarboksilasi ornitin (anaerobik alkali) - + +

Penghasilan indol (gegelung merah selepas tambah

kovaks)

+ - +

Penapaian glukosa (asid) + + +

Contoh jenis mikroorganisma Klebseila

oxytoca

Enterobecte

r aerogenes

Escherichia

coli

MUELLER HINTON AGAR/BROTH

Penyediaan Mueller Hinton Agar/Broth

Bahan yang diperlukan :

I. Mueller hintonII. Air suling.

III. Botol universal steril.

IV. Autoclave.

V. Botol kaca.

Prinsip :

Muller Hinton broth digunakan bersama Muller-Hinton agar dalam ujian sensitiviti antibiotik.

Muller-Hinton agar adalah satu medium pertumbuhan mikrobiologi yang biasanya digunakan

untuk ujian kerentanan antibiotik. Ia juga digunakan untuk mengasingkan dan mengekalkan

spesies Neisseria dan Moraxella.

Prosedur:

Muller-Hinton Agar

1. 38 g serbuk agar Mueller hinton dimasukkan dalam bekas steril.







Muller-Hinton Broth

1. 21 g serbuk agar Mueller hinton dimasukkan dalam bekas steril.






7. Botol dibiarkan sekejap, dan kemudian dituangkan ke dalam botol.

Keputusan :

PENGKULTURAN BAKTERIA

SAMPEL URIN

Pemprosesan Sampel Urin

Bahan dan alat radas:

i) Agar darah

ii) Agar C.L.E.D ( Cystine Lactose Electrolyte Defision)

iii) Inkubator (37°C)

iv) Dawai loop

Prinsip:

Kebanyakkan infeksi saluran urin adalah disebabkan oleh bakteria tunggal. Tetapi bagi pesakit

yang menghidapi kronik UTI atau membuat pembedahan pada saluran urin,dua organisma

mungkin hadir. Sampel ‘midstream urin’ diproses dan dikultur dalam media agar untuk

mengesan kehadiran bakteria dan mengenalpasti bakteria yang hadir.

Prosedur:

i) Sampel urin yang diterima dilabel dan pastikan maklumat pada sampel adalah sama

pada borang permintaan.

ii) Sampel dikulturkan pada agar darah dan agar MacConkey.

iii) Selepas itu media agar diinkubasi secara aerobik pada suhu 37°C selama 18 – 24

jam.

iv) Agar media tersebut didiagnos dan ujian biokimia dilakukan untuk pengenalpastian

bakteria.

v) Ujian sensitiviti dilakukan.

Keputusan:

Tiada pertumbuhan bakteria: Dilaporkan sebagai tiada pertumbuhan.

Pertumbuhan signifikant: >100,000/ml, ujian identifikasi dan sensitiviti dijalankan.

Pertumbuhan tidak signifikant: <100,000/ml, dilaporkan sebagai tiada patogen.

SAMPEL SPUTUM

Pemprosesan Sampel Sputum


i) Agar darah

ii) Agar MacConkey

iii) Agar coklat

iv) Slaid

v) Mikroskop

vi) Dawai loop

vii) Inkubator 37°C

Prinsip:

Batuk merupakan salah satu tanda atau simptom kepada jangkitan dalam sistem respiratori.

Batuk selalunya akan memyebabkan sputum terhasil dalam alveoli dan saluran udara.

Pemeriksaan sampel sputum adalah untuk mengenalpasti bakteria yang menginfeksi saluran

respiratori. Sampel sputum diambil dan dikultur dalam media agar dan pengenalpastian

bakteria.

Prosedur:

1. Sampel yang diterima dilabel dan pastikan sampel adalah sesuai untuk diproses.

2. Selepas itu, pemeriksaan makroskopik dilakukan.

3. Smear dan pemeriksaan mikroskopik dilakukan selepas itu.

4. Sampel kemudiaannya dikulturkan di atas agar darah, agar coklat dan agar Mac

Conkey.

5. Agar darah dan agar Mac Conkey dieram dalam incubator pada suhu 37°

semalaman manakala agar coklat pula dieram dalam balang karbon dioksida

selama 48 jam.

6. Plat agar didiagnos dan ujian biokimia dilakukan pengenalpastian bakteria.

7. Ujian sensitiviti dijalankan.

Keputusan

Patogen diisolasi: Streptococcus pyogens, Streptococcus pneumonia.

- Ujian pengenalpastian.

- Ujian sensitiviti.

Tiada patogen diisolasi: Inkubat semula.

- Dilaporkan sebagai tiada patogen diisolasi.

SAMPEL FESES

Pemprosesan Sampel Feses


i) Dawai loop

ii) Agar Hektoen

iii) Broth Selenite

iv) Inkubator 37°C.

Prinsip:

Feses cair merupakan salah satu simptom bagi infeksi pada gasterusus. Infeksi ini berlaku

apabila patogen memasuki salur gasterusus dan membiak. Mikroorganisma boleh menembusi

mukosa intestinal dan membiak diusus ataupun merebak ke organ sistemik yang lain. Sampel

feses akan dikultur pada media agar, dikenalpasti dan ujian sensitivity dilakukan

Prosedur:

1. Sampel feses diterima dan dilabel.

2. Sampel dikultur pada agar Hektoen dan broth Selenite untuk pengkulturan

primary dan dibiarkan semalaman.

3. Subkultur dari broth Selenite dilakukan pada agar Hektoen untuk pengkulturan

sekunder dan dieram pada suhu 37°C dan dibiarkan 24jam.

4. Plat agar didiagnos dan ujian biokimia dilakukan untuk pengenalpastian bakteria.

5. Ujian sensitiviti dijalankan.

Keputusan:

Patogen diisolasi: Salmonella dan Shigella



Tiada patogen diisolasi: Dilaporkan sebagai tidak patogenik.

Tiada pertumbuhan: Dilaporkan sebagai tiada pertumbuhan

SAMPEL GENITAL, RESPIRATORY SPESIMEN DAN SPESIMEN STERIL

Pemprosesan Sampel Genital, respiratory spesimen dan Spesimen Steril


i) Agar darah

ii) Agar Mac Conkey

iii) Agar Coklat

iv) Dawai loop

v) Biggy Agar

vi) Inkubator 37 °C.

Prinsip:

Pemeriksaan bakteriologi bagi spesimen genital dari wanita adalah sukar kerana spesimen

terdedah pada normal flora pada vagina. Sampel diambil pada High Vaginal Swab (HVS) atau

swab endoservikal dan akan diperhatikan dibawah mikroskop setelah pewarnaan Gram

dilakukan. Setelah itu, pengkulturan pada media agar dilakukan untuk isolasi dan

mengenalpasti patogen yang hadir.

Prosedur:

1. Sampel diterima dan dilabel.

2. Sampel kemudiaannya dikultur pada agar darah, agar MacConkey dan agar

coklat serta biggy agar. Agar darah dan MacConkey serta biggy agar dieram

pada inkubator 37° semalaman dan agar coklat dieram secara anaerobik selama

48 jam.

3. Sekiranya tiada pertumbuhan bakteria yang diperhatikan selepas dieram

semalaman agar dieram semula selama 24jam.


5. Ujian sensitiviti dilakukan.

Keputusan:

Patogen diisolasi: N. Gonorrhoeae, Candida Albican




Tiada pertumbuhan: Dilaporkan sebagai tiada pertumbuhan.

SAMPEL PUS / NANAH

Pemprosesan Sampel Pus


i) Agar darah

ii) Agar Mac Conkey

iii) Dawai loop

iv) Inkubator 37 °C.

Prinsip:

Kecederaan kecil yang terjadi pada kulit boleh memusnahan intergritinya dan membolehkan

mikroorganisma yang terdapat pada permukaan kulit masuk ke dalam lapisan kulit. Kecederaan

yang dialami dapat dikelaskan sebagai kecederaan daripada pembedahan, trauma dan

kecederaan fisiologi.

Jka kecederaan tidak dirawat dengan segera, mikroorganisma akan menginfeksi kawasan luka

tersebut dan terjadilah nanah. Nanah yang terhasil adalah diakibatkan oleh infeksi bakteria

pada kulit dan kecederaan yang dialami. Sampel pus diambil daripada kawasan terinfeksi untuk

menentukan jenis organisma dan membuat pengkulturan pada media agar untuk mengisolasi

dan mengenalpasti patogen.

Prosedur:

1. Sampel diterima dan dilabel.

2. Sampel kemudiaannya dikultur pada agar darah dan agar MacConkey.. Agar

darah dan MacConkey dieram pada inkubator 37° semalaman. Sekiranya tiada

pertumbuhan bakteria yang diperhatikan selepas dieram semalaman agar

dieram semula selama 24jam.


4. Ujian sensitiviti dilakukan.

Keputusan:

Patogen diisolasi: S.aureus,acinetobacter





SAMPEL DARAH

Pemprosesan Sampel Darah


i) Agar darah

ii) Agar MacConkey

iii) Agar coklat

iv) Dawai loop

v) Inkubator khas.

Prosedur:

1. Spesimen yang diterima dalam media komersial.

2. Spesimen discan pada komputer dan dimasukkan kedalam inkubator khas.

3. Spesimen akan dieram selama 5hari bagi dan bagi spesimen fungus ia dieram

selama 2minggu.

4. Spesimen yang positif akan dikeluarkan dan perwarnaan gram dilakukan untuk

memerhatikan morfologi bakteria yang hadir.

5. Vial aerobik akan dikultur dalam agar darah, agar MacConkey dan agar coklat.ia

akan dieram dalam inkubator 37° selama 24jam

6. Vial anaerobik pula akan dieram dalam agar darah dan dieram secara anaerobic

selama 24jam.

7. Bagi spesimen negatif, ia akan terus dieram selama 5hari dan akan dikeluarkan

selepas itu.

Keputusan:

Patogen diisolasi: S.aureus,Brucella sp

o Ujian pengenalpastian.

o Ujian sensitiviti.



UJIAN SENSITIVITI

Ujian Sensitiviti


i) Swab kapas

ii) Dawai loop

iii) Agar Muller Hinton

iv) bakteria dalam broth.

Prinsip:

Menentukan aktiviti perencatan agen antimikrobial terhadap strain tertentu bakteria. Inokulum

yang standard diswabkan pada permukaan agar dan disk yang mengandungi antibiotik

diletakkan atas agar. Plat agar tersebut kemudiannya dieramkan dalam inkubator semalaman.

Antibiotik tersebut kemudiannya akan menyerap masuk ke dalam agar bergantung kepada ciri –

ciri fizikal dan kimia. Zon perencatan organism diperhatikan dan diameter zon ini akan

ditentukan berdasarkan kebolehan organism berkembang, kadar pertumbuhan dan penyerapan

antibiotik. Diameter tersebut diukur dan ditukar kepada sensitive, intermediate & resistant

berdasarkan jadual.

Prosedur:

1. Broth bakteria dieram selama 2 jam.

2. Swab kapas dicelup ke dalam broth dan pastikan cecair yang diserap oleh swab kapas

tidak berlebihan.

3. Kemudian diswabkan di atas agar menutupi semua kawasan, plat agar diputar 60° dan

diswab dan kemudiaan plat agar diputar 60° lagi dan diswab.

4. Disk antibiotik diletakkan diatas agar dan tidak melebihi 6 disk dalam 1 plat agar.

5. Plat agar dieramkan agar selama 16-18 jam pada suhu 35oC.

6. Selepas 24 jam, zone perencatan diperhatikan dan diukur dalam unit mm.

Keputusan:

Optochin: Resistan ( streptococcus viridians).

Sensitif ( streptococcus pneumonia).

Novobiochin: Resistan (staphylococcus saprophyticus).

Sensitif( staphylococcus epidermis).

Bacitracin: Resistan ( streptococcus sp).

Sensitif ( streptococcus pyogenes).

Polymycin B: Resistan( bukholderia , pseudomallei B cepacia).

Sensitif (pseudomonas aeruginosa).

PEWARNAAN GRAM

Pewarnaan Gram

Prinsip:

Pewarnaan ini adalah untuk membezakan bakteria gram positif dan bakteria gram negatif.

Pembezaan ini berdasarkan tindak balas bakteria terhadap alkohol iaitu agen penyahwarnaan.

Bakteria gram positif tidak bertindakbalas dengan alkohol dan akan berwarna ungu gelap

manakala bakteria gram negatif akan bertindak balas dengan alkohol. Warna ungu gelap akan

pudar dan bakteria akan berwarna merah jambu disebabkan pewarna balas safranin.

Prosedur:

1. Apusan bakteria dilakukan ke atas slaid dan difiksasikan untuk melekatkan

bakteria pada slaid.

2. Slaid kemudiaannya diwarnakan dengan pewarna kristal violet selama satu minit

untuk mewarnakan dinding sel bakteria.

3. Bilas dengan air kemudian diwarnakan dengan pewarna iodin Lugol yang

bertindak sebagai mordan selama satu minit

4. Bilas dengan air selama dan kemudian dibilas dengan alkohol aseton selama 10

ke 15 saat.

5. Slaid dibilas dengan air.

6. Kemudian slaid diwarnakan dengan pewarna safranin selama satu minit.

7. Kemudian dibilas dengan air dan slaid dikeringkan.

8. Pemerhatian dibawah mikroskop dilakukan.

Keputusan:

Gram Positif: Berwarna biru.

Gram Negatif: Berwarna merah.

Tatacara Pelekapan Basah Bakteria

BAHAN

1. Kultur bakteria (dalam botol media broth atau plat kultur)

2. Slaid mikroskop

3. Penutup slaid

4. Botol larutan salin (steril)

TATACARA

1. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk.

2. Letakkan setitis kecil salin steril di atas sekeping slaid mikroskop bersih.

3. Sentuhkan gelung dawai steril kepada 1 koloni bakteria pada plat kultur.

4. Buatkan suspensi bakteria dari gelung dawai di dalam titisan salin di atas.

5. Letakkan sekeping penutup slaid di atas suspensi bakteria seperti yang ditunjukkan

dalam Rajah 3.1.

6. Amati pergerakan bakteria dengan kanta objektif 40X.

Sekiranya menggunakan kultur broth tukarkan langkah 4 kepada berikut:

4a. Sterilkan gelung dawai melalui kaedah pembakaran dan biarkannya sehingga sejuk.

4b. Letakkan 1 gelung penuh kultur cecair bakteria (yang agak keruh atau tebal) ke atas slaid

mikroskop.

Tatacara Plat Garisan

BAHAN

1. Kultur bakteria

2. Piring Petri yang mengandungi media agar

3. Gelung dawai

4. Penunu Bunsen

TATACARA

1. Labelkan plat Petri yang mengandungi media pertumbuhan yang steril (pada bahagian

dasar atau bawahnya dan bukan di atas penutupnya).

2. Letakkan plat Petri tersebut dengan bahagian dasarnya di sebelah atas.

3. Sterilkan gelung dawai melalui pembakaran api penunu Bunsen dan setelah sejuk, ambil

specimen dengannya.

4. Pegang dan angkat bahagian dasar plat sehingga permukaan media yang terdedah

menghadap anda.

5. Letakkan gelung yang mengandungi specimen di atas permukaan media agar kira-kira 1

cm daripada dinding plat Petri tersebut.

6. Sebarkan inokulum seluas 1 cm garis pusat.

7. Bermula daripada sebaran di atas gariskan inokulum dengan menggerakkan gelung

bolak-balik supaya garisan meliputi satu kawasan seluas kira-kira sepertiga daripada

plat.

8. Garisan seterusnya bermula daripada kawasan di sekitar penghujung garisan-garisan

pertama.

9. Bakar semula gelung dawai dan biarkan sejuk. Putarkan plat ~90 darjah dan buatkan

pula beberapa garisan mengulangi prosedur di atas sehingga garisan meliputi

keseluruhan kawasan permukaan media.

10. Pastikan garisan yang terakhir tidak menyentuh sebaran inokulum yang pertama.

11. Piring Petri yang telah diinokulasi dieramkan pada suhu tertentu dalam keadaan terbalik.

NOTA

1. Gunakan penghujung gelung dawai sahaja untuk menyentuh permukaan media supaya

mendapatkan garisan yang halus dan tipis.

2. Dalam membuat garisan, yang penting ialah menyentuh gelung pada permukaan media

dan menggariskannya; usahakan menggaris perlahan-lahan supaya anda tidak sampai

mencungkil atau merobek media sehingga mengakibatkan media menjadi pecah-pecah.

3. Pastikan juga garisan yang dibuat tersebut rapi, berterusan tetapi terpisah serta tidak

saling memotong atau bersilang di antara garisan atas dengan yang di bawahnya

supaya mendapatkan koloni bakteria yang berasingan.

4. Gelung dawai dibakar semula selepas garisan dibuat pada bahagian pertama piring

Petri supaya inokulum (jumlah bakteria) dikurangkan, maka koloni bakteria yang

terpisah akan didapati.

5. Jangan bercakap semasa melakukan prosedur ini untuk mengelakkan semburan air liur

terjatuh ke atas permukaan media agar.

6. Piring petir yang telah diinokulasi dieramkan secara terbalik supaya sebarang

pemulapan yang berlaku pada penutupnya tidak akan menitis ke atas kultur.

UJIAN MAKMAL DALAM PENGENALPASTIAN BAKTERIA

Bakteria mempunyai kisaran aktiviti biokimia yang amat luas; yang merangkumi proses

kemusnahan dan proses pembinaan (atau sintesis). Aktiviti yang luas ini dikawal oleh factor

genetic serta alam sekelilingnya.Daripada segi genetik, sesuatu aktiviti biokimia ditentukan oleh

enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteria.Dalam pengenalpastian bakteria, faktor ini dengan

spesifisiti sesejenis enzim terhadap substrat tertentu membolehkan bakteria dikenal pasti dalam

keadaan sekeliling yang terkawal seperti di makmal.Misalnya, beberapa kumpulan bakteria

tertentu menghasilkan bahan pertengahan metabolisme yang spesifik seperti asetil-metil-

karbinol berikutan fermentasi glukos yang boleh digunakan untuk membezakan kumpulan

bakteria yang menghasilkannya daripada yang tidak.

Kehadiran sesejenis enzim dikenal pasti secara tidak langsung melalui tindakannya terhadap

sesuatu substrat.Hasilan aktiviti enzim ini boleh berupa gas atau terbitan bukan gas. Gas yang

dihasilkan dikesan secara langsung melalui pengamatan penghasilan gelembung gas atau

secara tidak langsung melalui penggantian cecair di dalam tiub Durham dengan gas, kehadiran

rekahan atau celah-celah di dalam agar atau melalui tindakan kimia yang menghasilkan terbitan

yang berwarna dan tidak larut (misalnya H2S). Hasilan bukan gas ditunjukkan oleh perubahan

warna indicator pH (sesuatu jenis pewarna) yang bergantung kepada jenis indicator yang

digunakan (contoh, Andrade: neutral – kuning pucat, asid – merah, alkalin – tanpa warna;

bromthymol blue: neutral – hijau, asid – kuning, alkali – biru). Enzim juga boleh ditunjukkan

dalam tindakan serologi yang menghasilkan kompleks enzim (sebagai antigen) – antibody yang

muncul sebagai presipitasi.

Ujian Tiga Gula-Besi

Media tiga gula-besi atau Triple Sugar Iron (TSI) merupakan sejenis media campuran yang

digunakan untuk membezakan spesies bakteria dalam famili Enterobacteriaceae dengan

berdasarkan kepada kemampuan spesies-spesies ini untuk memfermentasi gula dekstros,

laktos atau sukros atau kombinasi daripada ketiga-tiga tersebut; penghasilan gas dan

penghasilan hydrogen sulfid.

Media TSI disediakan dalam agar condong. Bahagian permukaan agar (agar condong) (slant)

adalah terdedah kepada udara maka wujud daladm keadaan aerobic. Sebaliknya, bahagian

punting agar (di bahagian dasar tabung) (butt) dilindungi dari udara dan wujud dalam keadaan

anaerobic (walaupun bukan 100%). Gula yang digunakan adalah glukosa (0.1%), laktosa

(1.0%) dan sukrosa (1.0%). Indicator pH, sebagai penunjuk fermentasi, adalah fenol merah

yang akan menjadi kuning pada pH 6.8 (keadaan asid). Media TSI ditampan pada pH 7.4 iaitu

pH alkali maka warna agar kelihatan oren-kemerahan atau merah.

Peptida dan asid amino yang berasal dari pepton di dalam media TSI didegradasikan melalui

proses dekarboksilasi oksidatif kepada amina, sejenis terbitan alkali. Proses ini dipercepatkan

oleh bakteria yang tumbuh di bahagian permukaan agar. Di bahagian puntung, oksigen di

dalam udara tidak dapat sampai maka proses dekarboksilasi oksidatif adalah pada tahap

minimum.

Jika bakteria yang diinokulasi tidak menfermentasi karbohidrat, asid tidak diihasilkan dan warna

merah akan kekal di seluruh media. Jika bakteria hanya boleh menfermentasi glukosa, kuantiti

asid yang dihasilkan adalah terhad kerana kuantiti glukosa yang digunakan adalah rendah

(0.1%). Walau bagaimanapun, kuantiti ini mencukupi untuk bahagian permukaan dan puntung

agar menjadi kuning. Tetapi di permukaan agar yang terdedah kepada oksigen udara, amina

dihasilkan dan lama kelamaan (18 – 24 jam selepas pengeraman) kuantitinya mencapai aras

yang mampu mengatasi kesan kuantiti rendah asid yang dihasilkan, pH asid di bahagian

permukaan agar akan berubah semula menjadi alkali (ungu – merah) manakala bahagian

puntung agar (bahagian dasar tabung) akan kekal asid (kuning) kerana di situ amina yang

dihasilkan tidak mencukupi untuk mengatasi kesan asid.Jika laktosa atau sukrosa, atau kedua-

duanya difermentasi kuantiti asid yang dihasilkan daripada salah satu di antara kedua gula ini

adalah besar kerana konsentrasi kedua-dua gula ini adalah tinggi iaitu masing-masing 1%. Jadi,

walaupun amina dihasilkan kuantiti asid yang dihasilkan terlalu besar untuk perubahan pH

kembali kepada keadaan alkali maka bahagian condong mahupun bahagian puntung agar akan

tetap berkeadaan asid (kuning). Sukrosa dicampurkan untuk menyaringkan spesies Salmonella

dan Shigella kerana kedua-dua bakteria ini tidak menfermentasi sukrosa atau laktosa.

Penghasilan gas ditunjukkan dengan kehadiran gelembung gas atau bahagian puntung agar

akan kelihatan pecah-pecah. Hydrogen sulfid yang dihasilkan akan bertindak balas dengan

ferrous sulfat dan suatu presipitasi hitam (ferik sulfid) akan terbentuk di dalam media.

Tatacara Ujian Tiga Gula Besi

BAHAN

1. Kultur bakteria

2. Cerun agar TSI di dalam tabung uji

3. Dawai inokulasi lurus (dawai lurus)

4. Penunu Bunsen

TATACARA

1. Sterilkan keseluruhan dawai lurus melalui pembakaran dan biarkan supaya sejuk.

2. Sentuhkan penghujung dawai kepada koloni bakteria.

3. Tusukkan inokulum menembusi cerun agar TSI di dalam tabung sehingga ke dasarnya.

4. Tarik semula dawai dan gariskan organisma di atas permukaan agar yang condong.

5. Eramkan semalaman dan teruskan selama 48 jam (jika perlu).

NOTA

1. Tabung TSI harus ditutup secara longgar sahaja selepas diinokulsi supaya udara dapat

masuk ke dalam tiub kultur untuk membolehkan berlakunya oksidasi dan perubahan

balik condong agar daripada asid (kuning) ke alkali (ungu-kemerahan).

2. Oleh kerana sesetengah spesies Proteus dan beberapa spesies lainnya boleh

memberikan reaksi pada TSI yang serupa dengan Salmonella ataupun Shigella, maka

untuk membezakan spesies-spesies ini ujian urease dilakukan. (Salmonella dan Shigella

adalah urease-negatif, manakala Proteus, urease-positif).

Penggunaan Sitrat

Koser mencipta sejenis media broth asas yang mengandungi natrium ammonium fosfat sebagai

sumber tunggal nitrogen, dan natrium sitrat sebagai sumber tunggal karbon. Bakteria golongan

aerogen boleh menggunakan sitrat sebagai sumber karbon , manakala golongan koliform tidak.

Dalam ujian yang menggunakan media Koser, hasilnya ditafsir berdasarkan berlakunya

kekeruhan pada media broth akibat pertumbuhan bakteria. Seterusnya, Simmons

mengubahsuai media Koser tersebut dengan menambahkan agar dan indicator, bromthymol

blue, yang kelihatan hijau pada pH 6.8 dan biru pada pH lebih 7.6.

Pengubahsuaian ini membolehkan pertumbuhan bakteria dikesan dengan lebih mudah kerana

dalam metabolisme karbon pada sitrat (pertumbuhan positif), suatu tindak balas alkali berlaku

dan ini ditunjukkan dengan perubahan pada warna media daripada hijau kepada biru tua.

Kadangkala bacaan hasil ujian tidak semata-mata berdasarkan kepada perubahan warna, tetapi

sama ada terdapat atau tidaknya pertumbuhan bakteria pada garis inokulasi di atas media.

Kehadiran pertumbuhan bererti kemampuan bakteria mengurai sitrat sebagai sumber karbon,

dan hasil ujian dinyatakan sebagai positif untuk sitrat.Perubahan warna, dalam hal ini,

mempermudahkan lagi pembacaan hasil ujian.

Ujian Penggunaan Sitrat

BAHAN

1. Kultur bakteria

2. Dawai lurus

3. Cerun agar sitrat Simmons di dalam botol Bijou

(Agar sitrat Simmons: Dari sumber komersial)

TATACARA

1. Sterilkan keseluruhan dawai lurus dan biarkan sehingga sejuk.

2. Sentuhkan pada koloni bakteria dengan penghujung dawai.

3. Buatkan 1 garisan tipis bakteria pada permukaan agar.

4. Eramkan pada 37®C selama semalaman atau 48 jam, jika perlu.

5. Amatilah perubahan warna pada media.

PENGAMATAN DAN PENTAFSIRAN

Ujian positif: Pertumbuhan dengan/tanpa media menjadi biru.

Ujian negative: Tiada pertumbuhan atau media tetap hijau.

Pentafsiran ujian positif: Kemampuan menggunakan sitrat sebagai sumber tunggal karbon.

NOTA

1. Gunakan sedikit sahaja inokulum supaya semasa penginokulasian inokulum ini tidak

kelihatan sama sekali pada garis inokulasi dan untuk mengelakkan reaksi positif palsu

akibat bakteria yang mati membebaskan karbon dan nitrogen dalam kuantiti yang boleh

menampung pertumbuhan.

2. Elakkan daripada mengambil sebarang bahan nutrient daripada media kultur di mana

inokulum diambil.

3. Kultur yang menunjukkan pertumbuhan tanpa perubahan pH (perubahan warna) juga

dianggap positif kerana pada sesetengah bakteria yang lambat tumbuh keadaan tindak

balas alkali tidak dapat dicapai dalam tempoh pengeraman yang ditetapkan.

Pengeraman selama 48 jam mungkin diperlukan untuk bakteria yang lambat tumbuh

supaya warna biru dapat muncul.

Ujian Oksidase

Ujian oksidase menentukan kehadiran sitokrom C, sejenis enzim respiratori.Oleh yang

demikian, ujian ini hanya positif untuk bakteria yang memiliki sitokrom C. sitokrom adalah

protein yang mengandungi heme dan merupakan enzim oksidatif dalam kitaran respiratori yang

terlibat dalam fosforilasi oksidatif.Dalam ujian oksidase tatacara Kovacs, reagen oksidase

adalah tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida 1%. Enzim oksidase sitokrom tidak bertindak

secara langsung dengan reagen oksidase,tetapi menyebabkan oksidase sitokrom C yang

kemudian menyebabkan oksidase tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida sehingga

membentuk sejenis bahan kimia berwarna biru yang disebut biru Wunster. Sitokrom C yang

direduksi (ditambah electron) dalam tindakan ini diubah secara tidak langsung kepada bentuk

yang teroksidasi oleh oksidase sitokrom yang menerima elektronnya.Enzim oksidase sitokrom

kemudian menggantikan electron tersebut kepada oksigen untuk menghasilkan air dengan ion

hydrogen.

Ujian ini digunakan untuk membezakan streptkokus (oksidase-negatif) daripada Neisseria

(oksidase-positifa).

Tatacara Ujian Oksidase

BAHAN

1. Kultur bakteria

2. Slaid mikroskop

3. Kepingan kecil kertas turas Whatman no.1

4. Reagen oksidase (tetrametil-p-fenilena-diamina dihidroklorida 1%)

5. Kayu aplikator

TATACARA

1. Letakkan sekeping kertas turas kecil di atas slaid mikroskop bersih.

2. Titiskan 2 hingga 3 titis reagen oksidase ke atas kertas turas.

3. Ambil koloni bakteria dengan kayu aplikator dan goreskan ke atas kertas turas pada

bahagian yang menyerap reagen oksidase.

4. Amati kemunculan warna dalam beberapa saat.


Ujian positif: Kemunculan warna Lavender (ungu pudar) yang cepat (dalam beberapa saat)

menjadi

biru/ungu.

Ujian negative: Tiada perubahan warna atau warna muncul hanya setelah beberapa minit.

Pentafsiran hasil positif: Perubahan segera ke warna biru/ungu menunjukkan bakteria

memilikim

sitokrom C.

NOTA

1. Reagen ini mesti disediakan segar kerana sifatnya yang tidak stabil. Auto-oksidasi oleh

oksigen bebas dari udara boleh berlaku dan oleh yang demikian reagen ini dengan

sendirinya akan berubah menjadi biru atau ungu jika dibiarkan di udara agak lama.

2. Reagen yang baru disediakan perlu dibiarkan selama 15 minit untuk menjadi “masak”

sebelum digunakan.

3. Pastikan dan patuhi tempoh masa yang ditetapkan untuk mentafsir hasil ujian ini kerana

pada ujian yang disimpan lama sebelum dibaca hasil positif palsu boleh berlaku kerana

warna biru atau ungu boleh muncul akibat auto-oksidasi yang berlaku ke atas reagen.

4. Gunakan kayu aplikator atau dawai platinum untul mengambil koloni. Dawai nikrom juga

boleh mempengaruhi hasil ujian dan memberikan hasil positif palsu.

5. Tatacara alternatif ujian oksidase ini adalah dengan membanjiri kultur pada piring petri

dengan reagen dan kemudian segera menyingkirkan bahan yang berlebihan ini dengan

pipet. Hasilnya ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteria kepada warna

ungu (oksidase-positif) atau tiada perubahan warna (oksidase-negatif).

Ujian Koagulase

Ujian untuk menentukan penghasilan enzim koagulase oleh stafilokokus adalah suatu ujian

penting dalam mikrobiologi diagnostik.Ia membezakan stafilokokus patogenik kerana

berkemampuan untuk menghasilkan enzim ini, daripada yang tidak menghasilkannya atau tidak

patogenik. Terdapat dua jenis koagulase; yang satu terikat pada dinding sel bakteria (koagulase

terikat) dan tidak bebas, dan yang satu jenis lagi dirembeskan oleh sel ke dalam media atau

cairan (koagulase bebas).Ujian slaid di mana penggumpalan atau pengelompokan bakteria

dihasilkan dipercayai disebabkan oleh koagulase terikat yang terdapat pada dinding sel. Enzim

bentuk ini bertindak secara langsung ke atas fibrinogen haiwan-haiwan tertentu dan

menghasilkan fibrin yang memerangkap bakteria sehingga berlakunya

penggumpulan/pengelompokan tersebut.Sebaliknya, koagulase yang dihasilkan secara bebas

bertindak dengan protrombin untuk menghasilkan thrombin, yang seterusnya bertindak ke atas

fibrinogen untuk menghasilkan fibrin (pembekuan).

Tatacara Ujian Koagulase Slaid

BAHAN

1. Kultur bakteria

2. Larutan salin 0.85%

3. Slaid mikroskop

4. Gelung dawai

5. Plasma arnab

TATACARA

1. Letakkan setitis larutan salin steril di atas sebuah slaid mikroskop yang bersih dan

kering.

2. Ambil beberapa koloni bakteria dengan gelung dawai steril.

3. Buatkan suspensi bakteria ini di dalam titisan salin.

4. Tambahkan setitis plasma arnab kepada suspensi dan campurkan dengan gelung

dawai.

5. Goncangkan slaid dan amatilah penggumpalan (clumping) bakteria yang akan kelihatan

sebagai kelompok-kelompok putih dalam masa 15 saat.


Ujian positif: Pembentukan gumpalan bakteria.

Ujian negatif: Tiada penggumpalan dan suspensi bakteria kelihatan homogeny.

Pentafsiran hasil positif: Bakteria memiliki enzim koagulase.

NOTA

1. Mana-mana bakteria yang boleh menggunakan sitrat sebagai sumber tenaga boleh

membebaskan kalsium yang akan mengakibatkan pembekuan plasma jika plasma

tersebut diambil daripada darah yang bercampur sitrat. Oleh yang demikian, adalah

amat penting untuk mempastikan bahawa bakteria yang diuji adalah benar-benar kultur

murni stafilokokus, dan ujian ini digunakan semata-mata untuk membezakan antara

strain yang menghasilkan koagulase daripada yang tidak.

2. Gunakan plasma arnab atau manusia dan bukan spesies mamalia lain kerana

kebanyakan plasma daripada spesies lain tidak bertindak dengan koagulase

stafilokokus. Perlu juga diperhatikan bahawa kadangkala plasma manusia yang

digunakan mengandungi bahan perencat yang akan memberikan hasil negative palsu.

3. Plasma perlulah diuji terlebih dahulu dengan strain kawalan positif dan negative

sebelum digunakan. Seterusnya, supaya hasil ujian boleh dipercayai dan diterima tanpa

ragu-ragu, ujian haruslah dilakukan juga keatas beberapa jenis bakteria kawalan yang

memberikan hasil positif kuat, positif lemah dan kawalan negatif.

4. Pastikan koloni bakteria boleh diemulsifikasi di dalam salin supaya tidak menimbulkan

masalah dalam pembacaan hasilnya nanti.

5. Ujian positif palsu boleh berlaku jika penggumpalan yang berlaku lewat diambil kira.

6. Hasil positif yang berlaku lewat atau negative diuji semula dengan ujian koagulase

tabung kerana terdapat strain S.aureus yang menghasilkan hanya koagulase bebas

yang tidak bertindak dalam ujian koagulase slaid.

Ujian Katalase

Katalase adalah enzim dengan bahagian (moieti) yang mengandungi besi. Tindak balas kimia

yang berlaku dalam ujian katalase adalah : 2H2O2 AE 2H2O + O2. Penghasilan gelembung

gas (oksigen) adalah tanda bagi ujian yang positif.Ujian katalase digunakan khususnya untuk

membezakan antara stafilokokus (katalase positif) dengan streptokokus (katalase negative) dan

juga kadangkala digunakan dalam pengenalpastian pelbagai jenis bakteria.

Tatacara Ujian Katalase

BAHAN

1. Kultur bakteria

2. Slaid mikroskop

3. Kayu aplikator

4. Hydrogen peroksida 3%

TATACARA

1. Letakkan setitis larutan hydrogen peroksida dia atas sebuah slaid kaca bersih dan

kering.

2. Sentuhkan penghujung kayu aplikator kepada koloni bakteria.

3. Masukkan organisma ke dalam titisan reagen di atas slaid.

4. Amatilah kehadiran gelembung-gelembung gas yang dihasilkan dengan cepat, rancak

dan berterusan.


Ujian positif : Penghasilan dan pembebasan gas dengan cepat dicirikan dengan gelembung-

gelembung gas yang dibebaskan dengan rancak.

Ujian negative : Tiada sebarang tindak balas. Penghasilan segelintir gelembung kecil selepas

20 – 30

saat tidak dianggap positif.

Pentafsiran hasil positif : Bakteria memiliki enzim katalase.

NOTA

1. Jangan gunakan dawai gelung kerana positif palsu boleh berlaku.

2. Jangan gunakan kultur yang berusia lebih daripada 24 jam untuk mengelak daripada

memperolehi hasil negative palsu kerana enzim ini hanya dapat dikesan pada kultur

hidup yang masih segar dan mungkin tiada lagi pada kultur tua.

3. Pada kultur anaerobik, dedahkan kultur kepada udara selama setengah jam sebelum

ujian dilakukan untuk membolehkan oksidasi aerobic ke atas katalase yang tereduksi

berlaku.

4. Gunakan H2O2 pada kepekatan 3% untuk mendapatkan hasil ujian yang terbaik atau

optimum. Larutan H2O2 disimpan di dalam botol gelap di dalam peti beku.

5. Seboleh-bolehnya elakkan daripada mengambil koloni yang tumbuh pada permukaan

media agar darah. Ini untuk mengelakkan daripada terambil bersama sel darah dan

mendapatkan hasil yang positif palsu seperti di atas. Tetapi, sekiranya hal ini tidak dapat

dielakkan, berhati-hatilah dalam pengambilan tersebut untuk mempastikan hasil yang

tepat dan betul.

6. Ujian katalase plat : Ujian ini boleh dilakukan ke atas koloni di atas plat kultur dengan

menuangkan reagen ke atas koloni berkenaan KECUALI jika media kultur tersebut

adalah agar darah kerana ia boleh memberikan hasil positif palsu. Perlu ditekankan di

sini bahawa darah juga mengandungi enzim katalase yang dapat bertindak balas

dengan reagen. Ujikan juga sebahagian daripada plat agar yang belum diinokulsi

dengan bakteria dengan menuangkan sedikit reagen di atasnya sebelum meneruskan

dengan ujian katalase plat ini untuk mengelakkan hasil positif palsu. Ini adalah kerana

sesetengah media mungkin mengandungi sedikit katalase yang boleh memberikan

tindak balas yang lemah dan lambat serta boleh menyulitkan pembacaan hasil.

Ujian Motiliti dengan Menggunakan Agar Separuh Pejal

Media pertumbuhan dengan kepekatan agar yang rendah (0.4% atau <) merupakan suatu

media separuh pejal yang membolehkan bakteria bergerak dan menyebar ke pelbagai arah di

dalamnya. Jika bakteria mempunyai kemampuan untuk bergerak atau bersifat motil ia akan

menunjukkan penyebaran yang bermula dari garis inokulasi. Bakteria yang tak motil akan tetap

pada garis inokulasi dan sama sekali tidak akan tersebar.

Garam tetrazolium digunakan dalam ujian motility ini kerana ia memudahkan pengesanan

pertumbuhan serta penyebaran bakteria secara visual di dalam media. Garam tetrazolium

adalah tanpa warna dan akan diubah kepada formazan, kompleks tak larut berwarna merah

hasil pereduksian oleh bakteria yang tumbuh.

Tatacara Ujian Motilit (Pergerakan) pada Agar Separuh Pejal

BAHAN

1. Kultur bakteria

2. Agar nutrient (0.4% atau <) yang mengandungi indicator (garam tetrazolium) di dalam

tabung uji.

3. Dawai lurus

4. Inkubator

TATACARA

1. Sterilkan keseluruhan dawai lurus.

2. Sentuh koloni bakteria dengan penghujung dawai.

3. Tusukkan hujung dawai ke dalam agar separuh pejal sehingga ke dasar tabung.

4. Eramkan semalaman.

5. Amati pola pertumbuhan bakteria.


Ujian positif : Pertumbuhan bakteria (merah) tersebar daripada garis tusukan dawai lurus.

Ujian negative : Pertumbuhan bakteria terhad kepada garis tusukan.

Pentafsiran ujian : Ujian positif – bakteria motif, ujian negatif – bakteria tak motil.

NOTA

1. Beberapa bakteria seperti Pseudomonas adalah aerobik dan akan hanya menunjukkan

motility pada bahagian atas media ini.

2. Oleh kerana keseluruhan dawai lurus akan ditusuk ke dalam agar maka pastikan

keseluruhan dawai ini dibakar untuk mensterilkannya.

3. Pertumbuhan beberapa jenis bakteria tertentu mungkin dihalang oleh garam tetrazolium.

4. Dawai yang ditusuk ke dalam media dikeluarkan seboleh-bolehnya bertepatan dengan

garis kemasukannya. Elakkan daripada menggerakkan dawai ke kiri atau ke kanan

semasa dikeluarkan (dan juga semasa dawai ditusuk) kerana ini akan menyebabkan

pertumbuhan yang kelihatan tersebar dan memberi tafsiran positif palsu mengenai

mobiliti.

makmal mikrobiologi

Documents