ALAT BAHAN DAN CARA KERJA

1. Pewarnaan Spora

a. Pewarnaan Klein

Alat : objek glass, ose, spritus, mikroskop, pinset

Bahan :

o Bahan cat 1 : Carbol fuchsine, peluntur : H2So4 1%

o Bahan cat 2 : Air methylen biru, air

Cara Kerja :

1. Suspensi bakteri dibuat terlebih dahulu dengan cara

Ambil 1 cc air garam physiologis (pZ), kemudian larutkan

kultur bakteri yang akan diperiksa.

Suspensi bakteri diambil sebanyak 1 cc dan dicampur

dengan 1 cc bahan cat carbol fuschine, kemudian

dipanaskan selama 6 menit.

2. Dibuat preparat pada objek glass, keringkan lalu difiksasi

diatas nyala api.

3. Lunturkan dengan H2SO4 1% selama 3 detik

4. Cuci dengan air

5. Cat dengan Methylen Blue selama 4 menit

6. Cuci dengan air lalu keringkan, spora akan tercat warna merah

dan vegetatif terlihat biru.

b. Pewarnaan Schaeffer Fulton

Bahan : Cairan atau padatan (koloni)

Alat : Os, obyek glass, deg glass, lampu siritus, mikroskop

Bahan cat 1 : malachile green 5%

Bahan Cat 2 : Safranin 0,5%, air

Cara kerja :

1. Preparat dicat dengan Malachite Green 5 % dan dipanasi

selama 30-60 detik, dibiarkan selama 5 menit

2. Cuci dengan air

3. Preparat dicat dengan Safranin 0,5% selama 30 detik

4. Cuci dengan air lalu keringkan, spora akan teercat warna hijau

dan vegetatif berwarna merah.

2. Pewarnaan Becker & Kranz

a. Bahan : Bahan diambil langsung dari material alba, atau plak gigi.

b. Cara Kerja :

1. Bahan yang diambil digoreskan di atas gelas obyek,

tuangkan diatasnya bahan fiksaksi dari Ruge-Ross

.

2. Sediaan dicuci denganair, kemudian dituangi tannine beite

selama 1 menit sambil dipanasi, lalu dicuci kembali dengan

air. Pemanasan dimaksudkan untuk memudahkan

spirochaeta menyarap bahan cat.

3. Cat dengan Carbol Gentian Violet selam 2 menit, panasi

sampai menguap 1 kali. Cuci dengan air dna keringkan,

Spirochaeta akan tercat ungu tua.

4. Terlihat :

Bentuk batang langsing runcing berwarna ungu

Bentuk batang tebal panjang berwarna ungu

3. Pewarnaan Neisser

a. Bahan :

1. Neisser A : Methylen Biru 1 gram, alkohol 96% 20 cc,

akuades 1000 cc, acid acetic glacial 50 cc.

2. Neisser B : Kristal violet 1 gram, alkohol 96% 10 cc,

akuades 300 cc.

3. Neisser C : Chrysoidine 1 gram dilarutkan dalam air panas

sebanyak 300 cc lalu difilter.

b. Cara Kerja :

1. Campurkan dalam gelas ukur, 2 bagian Neisser A dan 1

bagian Neisser B.

2. Gelas obyek yang telah diulas dengan kultur dicat dengan

campuran dari Neisser A dengan memakai kertas filter.

3. Cat dibuang, cat kembali dengan Neisser C selama

menit, kemudian keringkan dengan memakai kertas filter

4. Pewarnaan Tahan Asam/ Ziehl Neelsen

a. Bahan :

1. Bahan waran 1 : Carbol fuschine

2. Peluntur : HCL 3% dalam alkohol

3. Bahan warna 2 : Air methylen biru (counter stain) atau

Brilliant green

4. Air

b. Cara kerja :

1. Sebagai bahan diambil dari sputum pagi atau sputum yang

dikumpulkan

2. Sputum diletakkan dalam cawan hitam untuk dilihat warna

serta susunannya, cari bagain-bagian yang kuning

kehijauan dan keras untuk dibuat sediaan.

3. Ambil 2 gelas obyek yang sudah steril, ambil sputum dan

letakkan di atas gelas obyek, lalu tipiskan dnegan gelas

obyek yang kedua serta tekan kira-kira 5 mneit diatas api.

4. Sediaan dikeringkan dan difiksadi selama 3x1 detik,

keringkan lagi selanjutnya siap dilakukan pewarnaan.

5. Tuangi larutan carbol fuchsine selama 5 menit dengan

pemanasan sedikit hingga menguap namun tidak mendidih

selama 2-3 menit,maksud dari pemanasn supaya dapat

mewarnai dengan kuat.

6. Pewarna dibuang dan disiram dengan air.

7. Lunturkan dalam botol bermulut besar yang berisi HCL 3%

dalam alkohol selama 1-2 detik

8. Siram dengan air, selanjutnya cat dengan air methlyen biru

selama 1 mneit, siram dengan air kembali kemudian

keringkan.

TINJAUAN PUSTAKA

1. Pewarnaan Klein

Pewarnaan klein menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air

fukhsin) tujuan untuk mempelajari kegunaan pewarnaan ini untuk

mempertinggi kontras antara sel dan sekelilingnya dan mengamati ciri ciri

bakteri. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarnaan klein

khususnya spora, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu

macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi karena

sitoplasmanya bersifat basofilik (sukaakan basa) sedangkan zat-zat warna

yang digunakan untuk pewarnaan ini umumnya bersifat alkalin (komponen

kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari

satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. (Pelezar, chan. 2008)

Pewarnaan Schaeffer Fulton

Pewarnaan Schaeffer Fulton adalah jenis pewarnaan yang banyak digunakan

untuk pewarnaan endospora. Bila pewarnaan spora bakteri ini berhasil

dengan baik, maka sel vegetatif bakteri akan berwarna merah. Jika sel

membentuk spora, maka spora hasil pewarnaan akan berwarna hijau.

(Soemarno. 2010).

Pewarnaan Becker & Kranz

Pewarnaan ini ditujukan untuk mengecat spirochaeta. Dengan

pengecatan sederhana maupun gram spirochaeta tidak terlihat jelas.

Spirochaeta merupakan golongan bakteri berbentuk spiral yang bersifat

lentur pada saat bergerak, tubuhnya dapat memenjang dan mengerut.

(Drs.Koes Irianto, 2006).

2. Pewarnaan Neisser

Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula

metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk

semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan

lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang

spesifik (Pelezar,2008).

Prinsip pengecatan dengan Neisser A & B menyebabkan granula

Babes Ernst (poolkarrel) berwarna violet hitam, cat tadi oleh granula bakteri

dipegang kuat terhadap air. Sehingga dengan cat Neisser C tidak berubah

(luntur), badan bakteri akan terlunturkan oleh air yang terdapat pada Neisser

C sehingga mengambil warna kuning atau coklat dari Neisser C. (Soemarno,

2010)

Pada prosedur Neisser yang tidak spesifik, methylene blue, crystal

violet dan chrysoidine digunakan untuk mendeteksi granula metachromatic,

atau yang disebut Babes-Ernst polar bodies, khususnya pada diphtheria

bacteria. Dengan nilai pH yang telah ditentukan, methylen blue dan crystal

violet akan diikat pada polar bodies atau struktur (Volutin bodies), tetapi

tidak terikat pada sel bakteri lainnya. Polar bodies akan terlihat sebagai titik

gelap. Pada prosedur counter stain, badan bakteri diwarnai dengan

chrysoidine tetapi ini hanya sebagian terserap oleh polar bodies. Bakteri

golongan Diphterie, poolkarrelnya ungu kehitaman dengan badan bakteri

berwarna coklat atau kekuningan biasanya ditemukan dengan berbagai

susunan yang menyerupai huruf V, L atau Y. Hasil pengecatan Neisser

hanya bersifat diagnosa sementara, untuk kepastian diagnosa dilakukan

kultur dan tes virulensi baik secara invivo maupun invitro. Kultur

Corynebacterium diphteriae. Spesimen ditanam pada media Loffler Serum,

inkubasi 37°C selama 24 jam. (Kusnaidi,2003)

5. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak

dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika

bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbol-fukhsin melalui proses

pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa

mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol.

Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan

ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab

tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . (Dwidjoseputro, D. 2005)

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau

berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora,

non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri gram positif. Namun, sekali

mycobacteria diberi warna oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak

dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena itu, maka mycobacteria disebut

sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme lain yang

juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus,

Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. (Thomas

Dormandy, 1999)

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat

warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%.

Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat

mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang

dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah

pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu

pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan.

Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol

fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu

asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri

kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-pori dan

menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan

bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat

sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua

yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay,

1994).

Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode

Ziehl-Neelsen dapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :

1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut

bakteri tahan asam (acid fast).

2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut

bakteri tidak tahan asam (non acid fast).

PEMBAHASAN

Pewarnaan Spora

1. Pewarnaan Klein

Pewarnaan Klein adalah pewarnaan khusus yang digunakan untuk mewarnai spora

(endospora). Pada pewarnaan klein ini bahan yang digunakan berasal dari kultur

murni dan bahan cat yang digunakan adalah carbol fuschine dan methylen blue.

Pada pewarnaan endospora perlu dilakukan proses pemanasan. Hal ini bertujuan

supaya cat dapat terserap kedalam spora. Setelah dilakukan pengamatan dengan

menggunakan mikroskop, maka akan terlihat bentuk batang berwarna biru, bentuk

oval berwarna merah, dan bentuk batang berwarna biru dengan rongga

didalamnya berwarna merah. Bentukan yang berwarna biru tersebut adalah bentuk

vegetatif, sedangkan yang berwarna merah adalah spora, dan bentuk batang

berwarna biru dengan rongga didalamnya berwarna merah merupakan dalam

pembentukan spora.

Gambar 2. Hasil pewarnaan Klein

2. Pewarnaan Schaeffer Fulton

Pewarnaan Schaeffer Fulton adalah jenis pewarnaan yang banyak

digunakan untuk pewarnaan endospora. Pada pewarnaan Schaeffer Fulton,

bahan yang digunakan berasal dari kultur murni dan bahan cat yang digunakan

adalah malachiet green dan safranin. Dari hasil pengamatan mikroskop dengan

pewarnaan Schaeffer Fulton akan terlihat bentuk batang berwarna merah,

bentuk oval berwarna hijau, bentuk batang berwarna merah dengan rongga

didalamnya berwarna hijau. Bentukan yang berwarna merah tersebut adalah

dalam bentuk vegetatif, sedangkan yang berwarna hijau adalah spora, dan

bentuk batang berwarna merah dengan rongga didalamnya berwarna hijau

adalah dalam pembentukan spora.

Gambar 3. Hasil pewarnaan Schaeffer Fulton

Pewarnaan Becker and Kranz

Pewarnaan Becker and Kranz adalah salah satu jenis pewarnaan yang

biasanya digunakan untuk mengetahui bagian atau struktur dari suatu bakteri yang

susah dilihat jika menggunakan pewarnaan biasa. Pada praktikum kali ini

pewarnaan Becker and Kranz digunakan untuk mengamati spirochaeta yang

diambil dari plak gigi. Plak gigi digoreskan diatas gelas obyek, kemudian bahan

fiksasi ruge-ross dituangkan ± 2x ½ menit. Setelah itu sediaan dicuci dengan air,

kemudian dituangi tannine beite selama 1 menit sambil dipanasi. Tujuan dari

pemanasan ini adalah supaya cat dapat terserap oleh spirochaeta. Kemudian

sediaan dicuci dengan air lagi dan diberi cat Carbol Gentian Violet selama 2

menit, lalu sediaan dipanasi sampai menguap, lalu dicuci dengan air dan

dikeringkan. Dengan pewarnaan Becker & Kranz ini spirochaeta akan tercat ungu

tua dan terdapat beberapa bentukan yaitu, bentuk batang langsing runcing

berwarna ungu, bentuk batang tebal panjang berwarna ungu, bentuk batang

berlenggok (spiral) berwarna ungu, dan bentuk batang koma berwarna ungu.

Gambar 1. Hasil pewarnaan Becker and Kranz

Pewarnaan Neisser

Bahan : Kultur murni

Terlihat : bentuk batang warna kuning dengan ujung bulat (pool korel)

warna cokelat

Diagnose sementara : Corynebacterium diphteriae

Prinsip pengecatan dengan Neisser A dan B menyebabkan granula Babes

Ernst (polo karel) berwarna violet hitam, cat tadi oleh granula bakteri dipegang

kuat terhadap air. Sehingga dengan cat Neisser C tidak berubah (luntur), badan

bakteri akan terlunturkan oleh air yang terdapat pada Neisser C sehingga

mengambil warna kuning atau cokelat dari Neisser C.

Granula metakhromatik sering ditemukan pada jenis-jenis kuman patogen

tertentu dan berbentuk khas untuk kuman tersebut. Di dalam sitoplasma dapat

ditemukan granula metakhromatik pada sediaan mikroskopik. Misalnya bakteri

diphteriae mempunyai granula metakhromatik karena bila diwarnai dalam

sediaan, granula tersebut akan berwarna lain dari pada zat warna yang digunakan.

Misalnya bila diwanai sediaan bakti diphteriae dengan zat warna methylen blue,

granula Babes Ernst akan berwana cokelat tua. Pada spesies bakti tertentu, granula

metakhromatik terletak pada tempat-tempat khas di dalam sel bakteri.

Disamping material nukleus, sitoplasma bakteri mungkin mengandung

inklusif sel kepingan-kepingan kecil material yang tidak menjadi bagian utuh

struktur sel. Butiran khusus ini yang rupanya bertindak sebagai sumber fosfat dan

energi disebut butiran metakromat karena akan menyerap warna merah apabila

diwarnai dengan biru metilen. Butiran metakromat disebut juga kolektif volutin.

Bakteri golongan diphteriae, pool korelnya berwarna cokelat dengan badan

bakteri berwarna kuning biasanya ditemukan dengan berbagai susunan yang

menyerupai huruf V, L, atau Y.

Hasil pengecatan Neisser hanya bersifat diagnosa sementara, untuk

kepastian diagnosa dilakukan kultur dan tes virulensi baik secara in vivo maupun

in vitro.

Pembuatan dan pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)

Pada praktikum kali ini dilakukan pengecatan Bakteri Tahan Asam (BTA)

yang menggunakan tiga jenis cat Ziehl-Neelsen (ZN) yaitu carbol fuchsin, HCl

3% dalam alkohol dan methylene blue 3 %. Dalam pengecatan ini digunakan

sample sputum.

Sebelum dibuat apusan, objek glass difiksasi untuk menghilangkan lemak

yang menempel pada permukaanya dan untuk menghilangkan kontaminan lain

yang ada pada objek glass. Apusan yang dibuat tidak boleh terlalu tebal agar

bakteri tidak bertumpuk-tumpuk sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri

menjadi lebih mudah, tetapi juga tidak terlalu tipis.

Pewarnaan BTA ini dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ziehl

Neelsen yang menggunakan 3 jenis warna sebagai berikut :

1. Pewarnaan dengan Carbol Fuchsin

Pewarnaan pertama ini, akan sulit menembus dinding dari bakteri tahan asam,

sehingga dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel bakteri tersebut

sehingga warna carbol fuchsin ini mampu diserap oleh sel-sel bakteri. Namun

perlu diperhatikan, pemanasan dilakukan tidak sampai mendidih cukup

sampai menguap agar sel-sel bakteri tersebut tidak rusak.

2. Penambahan HCl 3% dalam alkohol

Penambahan alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan zat warna

(decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri sudah

mampu menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel tersebut akan

kembali tertutup dalam pada suhu semula. Sehingga sebelum dilakukan

penambahan asam alkohol ditunggu sampai 5 menit. Saat penambahan asam

alkohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan dilunturkan kembali warna

carbol fuchsin tersebut karena tidak mampu mengikat kuat seperti halnya

bakteri BTA.

3. Pemberian zat warna Methylene Blue

Terakhir dilakukan penambahan Methylene blue. Methylene Blue

merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untu

k mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah

perlakuan dengan asam alkohol.

Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang

permeabilitas dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non

BTA terekstraksi oleh asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non

BTA tersebut menjadi berwarna biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah

terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori-pori mengkerut, daya rembes

dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna methylene blue tidak

dapat masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah.

Waktu yang diperlukan untuk menunggu setiap warna juga berbeda.

Hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan pada saat

pembacaan preparat pada mikroskop.

1. Menunggu selama 5 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol fuchsin

dan dilakukan pemanasan bertujuan agar cat ini dapat diserap dan melekat

sempurna pada dinding bakteri dan dinding selnya kembali seperti semula

setelah dilakukan pemanasan.

2. Warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa.

3. Menunggu selama 1 menit setelah penambahan pewarna methylene blue

bertujuan agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non BT

A sehingga ada perbedaan warna antara bakteri BTA dan Non BTA.

Setelah pewarnaan dan menunggu selama waktu diatas, dilakukan

pembilasan dengan aquadest yang bertujuan untuk membilas zat warna yang

berlebih sebelum dilanjutkan dengan pewarnaan berikutnya.

Hal yang perlu diperhatikan

Fase yang paling kritis adalah dekolorisasi yang mengakibatkan warna

yang tidak terikat oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam alkohol tidak

sampai berlebih karena akan menyebabkan over decolorization sehingga sel

BTA hampir sama dengan Non BTA yang menyebabkan sulit

membedakannya, tetapi juga tidak terlalu sedikit dalam memberikan alkohol

(under decolorization) karena tidak akan melunturkan warna secara sempurna

sehingga sel Non BTA bisa saja berwarna ungu mendekati warna sel BTA.

Selain itu kaca obyek selalu dicuci dengan aquades diantara

penambahan pewarna untuk menghilangkan kelebihan warna dan

mempersiapkan pewarna berikutnya.

Faktor yang membedakan BTA dan Non BTA

Perbedaan mendasar antara bakteri BTA dan non BTA adalah pada

komponen + dinding selnya. Dinding sel BTA mengandung lapisan lilin

(lapisan lemak) yang sangat banyak sehingga dalam proses penyerapan warna

perlu dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel tersebut sehingga

warna dapat diserap. Namun dalam dinding sel bakteri non BTA lapisan

lemaknya tidak banyak sehingga untuk melakukan penyerapan warna tidak

perlu dilakukan pemanasan dan pelunturan warna pun sangat mudah dilakukan

saat penambahan asam alkohol.

Pengamatan preparat pewarnaan BTA

Bahan : sputum / dahak

Terlihat :

1. BTA (Bakteri Tahan Asam)

bentuk batang terputus-putus warna merah

2. Leukosit

bentuk oval, lebih besar dari coccus, berwarna biru

3. Epithel

bentuk oval, lebih besar dari leukosit, memiliki inti sel, berwarna biru

Diagnose sementara : Mycobacterium sp.

 Kesimpulan

Pewarnaan BTA dilakukan dengan menggunakan tiga jenis zat pewarna

Ziehl Neelsen, yaitu Carbol fuchsin untuk mewarnai sel bakteri, Asam Alkohol

untuk meluruhkan warna Carbol Fuchsin, dan Methylene Blue untuk memberi

warna background. Hasil praktikum menunjukkan sampel positif teridentifikasi

2

1

3

mengandung bakteri Mycobacterium sp (penyakit TB) dengan bentuk basil

berwarna merah. Sifat bakteri ini tidak tahan panas, tetapi dapat bertahan lama

dalam udara bebas. Dalam pewarnaan bahan asam bakteri tahan asam berwarna

merah dan bakteri tidak tahan asam berwarna biru.

DAFTAR PUSTAKA

1. Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan

dan Sekolah Tenaga Kesehatan Yang Sederajat. Bandung: Citra Aditya Bakti.

2. Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT Raja

Grafindo Persada.

3. of Tuberculosis. ISBN 0-8147-1927-9 HB - ISBN 1-85285-332-8 PB.

Thomas Dormandy. 1999. The White Death: A History

4. Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan

5. Kusnadi; Peristiwati; Syulasmi, Ammi; Purwianingsih, Widi;

Rochintaniawati, Diana. 2003. Common Textbook Mikrobiologi Jica.

Bandung : Universitas Pendidikan Indonesia FMIPA Jurusan Pendidikan

Biologi

6. Soemarno. 2010. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Klinik. Yogyakarta:

Akademi Analis Kesehatan Yogjakarta Departemen Kesehatan Republik

Indonesia.

7. Pelezar, chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: Jakarta

8. Irianto koes, D. 2006. Mikrobilogi Menguak dunia Mikroornisme. Bandung :

Yrama Widya.