LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM

PEWARNAAN SEL (BAKTERI DAN JAMUR) DAN PEWARNAAN

ENDOSPORA

KELOMPOK I

Ahmad Soni

0810910002

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2010

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena

selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Selain itu

bakteri yang hidup akan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut

disuspensikan. Sedangkan, untuk mengatasi hal tersebut maka

dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat

terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel

bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-

penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya

ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari

pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan

listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan

adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan

ungu, bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan merah sedangkan

yang positif berwarna ungu (Levine, 2000).

Praktikum persiapan pembuatan apusan dan teknik pewarnaan gram

sangat penting dilakukan karena untuk pengamatan biakan dari koloni

mikroba dan biakan jamur dapat dilakukan dengan mudah dan baik.

Pewarnaan ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada

akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospora yang

bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi

yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap

berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Pelczar dan Chan,

2007).

1.2 Tujuan

Tujuan dilakukannya praktikum mengenai pewarnaan sel (bakteri

dan jamur) dan pewarnaan endospora ini antara lain :

1) Mempelajari teknik pembuatan sediaan apusan (preparat)

2) Mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri3) Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri4) Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur

tersebut

5) Mempelajari proses pewarnaan struktur sel jamur (kapang)

6) Mempelajari bentuk-bentuk dan struktur sel jamur (kapang)

7) Memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimiawi di dalam prosedur

tersebut

1.3 Manfaat

Manfaat yang diperoleh setelah mengikuti praktikum mengenai

pewarnaan sel bakteri dan pewarnaan endospora ini adalah praktikan

akan mempunyai keterampilan dan keahlian dalam hal pewarnaan sel

bakteri dan pewarnaan endospora yang banyak dilakukan dalam

laboratorium-laboratorium mikrobiologi dengan metode yang

disesuaikan dengan alat dan biaya yang ada.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri

sangat kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan

mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel

bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat

berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri

merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 m. Bentuk

bakteri bermacam macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri

lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia

agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk,

susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri

dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks)

(Pelczar & Chan, 2007).

Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri

dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat

struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola,

menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan

zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam

yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan

struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan

menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,

yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan

yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian

sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan, 2007).

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu

ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion

bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan

bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna

berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.

Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika

warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna

basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam.

Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-

lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-,

COOHCOO?. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa

lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah

bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh

faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi

pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara

komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang

disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik

pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode

pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan

pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal,

pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen.

Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum

digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).

Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif,

salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna

terdapat pada ion positif (zat pewarna+ Cl-) dan pada pewarna asam, warna

akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+). Hubungan antara bakteri

dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya

asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri

itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi

dengan ion positif zat pewarna basa, Kristal violet, safranin dan metilin blue

adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat

pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi,

mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya

pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna

di atas latar belakang yang berwarna (Volk & Wheeler, 1993).

Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter

kebangsaan Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus)

pewarna tersebut merupakan pewarna differensial karena dapat membagi

bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk

identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi

pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan

pewarna yodium, setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi

laputan alkohol 95% selama 30 detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna

safranin atau bismarck (untuk buta warna merah) selama 1 menit. Zat

pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang

kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah

apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan

walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram positif akan terwarna

ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan terwarna merah

(safranin) (Umsl, 2008).

Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah

pewarnaan Gram dan ZiehlNelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat

mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai

dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium

maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol.

Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna

biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna

ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus,

Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus,

Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan

terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan

warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative

adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella,

Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).

Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi

atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif

dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat

dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa

pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua

disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna

dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel

kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila

komponen dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan

tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci

maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap

warna dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium,

alkohol dan safranin (Tracy, 2005).

Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi

pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam

pemberian alcohol, maka poripori akan membesar dan tidak mengikat

pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan

bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol.

Hal ini akan mengecilkan poripori sehingga menghasilkan kompleks kristal

iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan

peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya

menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki 12

lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang

lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet,

Aalkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium,

Kalium iodide, Aquades), Gram C

(Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades).

Pewarnaan ZN digunakan untuk mengidentifikasi infeksi yang disebabkan

oleh bakteri tahan asam, conttohnya adalah Micobacteriom tuberculosis,

Micobacterium leprae, Mycobacterium atypical seperti Mycobacterium

avium intraseluler / Mycobacterium avium complex yang tumbuh pada 41C

yang menyerang sistem imun, Mycobacterium marinum dan

Mycobacterium ulcerans yang tumbuh pada 31C dan menginfeksi kulit,

Nocardia, Legionella mycdatci, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordonia /

Gordona, Cryptosporidium, Isospora, Cyclospora, Sarcocytis, dll. Contoh

bakteri than asam yang tidak cocok pada pewarnaan ZN tetapi cocok pada

Kinyoun adalah Nycordia, Rhodococcus, Tsukamurella, dan Gordonia.

Hasil pewarnaan ZN akan mengidentifikasikan : 1. Bakteri tahan asam

Bakteri tahan asam baru akan terkarakterisasi setelah pewarnaan setelah

pemberian asam alkohol. Hasilnya berwarna merah. 2. Bakteri tidak tahan

asam Hasilnya adalah berwarna biru karena dekolorisasi pada pewarnaan

pertama oleh asamalkohol, jadi perlu diberi pewarnaan kedua berupa

counter stain. Sifat tahan asam pada bakteri tahan asam disebabkan karena

dinding selnya terdiri atas peptidoglikan, arabinogalaktan, dan lipid (50%

nya tersusun atas asam mikolat). Asam mikolat merupakan asam lemak

ranai panjang yang terdiri atas 3490 karbon. Pewarnaan ZN terdiri dari ZN

A (merah) (Basic fusion, Alcohol, Fenol, Aquades), ZNB (tidak berwarna)

(HCl, Etil alcohol), dan ZNC (biru) (Methylen blue, Aquades) (Madigan,

2003).

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan

sebagai berikut: pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan

gram dan pewarnaan tahan asam), pewarnaan khusus untuk melihat struktur

tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, pewarnaan

khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser

(granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan pewarnaan

negatif (Gozali, 2009)

Gambar 2.1 Pewarnaan Sederhana (Gozali, 2009)

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi

mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini

mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna

untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan

tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan

kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang

sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini

menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo, 1990)

Gambar 2.2 Pewarnaan Negatif (Hadiotomo, 1990)

Gambar 2.3 Pewarnaan Gram (Jason, 2009).

Endospora merupakan struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa

jenis bakteri. Struktur endospora sangat bervariasi pada setiap spesies.

Endospora merupakan struktur yang tahan terhadap keadaan lingkungan

yang ekstrim misalnya kering, pemanasan dan keadaan asam. Karena

kandungan air endospora sangat rendah bila dibandingkan dengan sel

vegetatifnya, maka endospra berbentuk sangat padat dan sangat refraktil bila

dilihat di bawah mikroskop. Endospora sangat sukar diwarnai dengan

pewarnaan biasa, sehingga harus menggunakan pewarnaan spesifik. Bakteri

yang menghasilkan spora pada umumnya tahan terhadap pewarnaan,

sedangkan bakteri yang tidak memiliki spora dan hanya memiliki sel

vegetatif tidak tahan terhadap pewarnaan (Partic, 2008).

Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya,

tetapi sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang

menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode

Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora,

endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses

pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat

berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan

sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan

menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel

vegetatifnya (Fardiaz, 1992).

Kondisi yang terus memburuk membuat endospora dibebaskan dari

degenerasi sel vegetatif dan menjadi sel independen yang disebut spora

yang diakibatkan komposisi lapisan kimia spora bersifat tahan terhadap

efek-efek merusak, misalnya pemanasan berkelebihan, pembekuan, radiasi,

pengeringan, dan agent kimia lainnya sehingga diperlukan pewarnaan

khusus secara mikrobiologi dan ketika kondisi lingkungan kembali normal,

spora bebas kembali untuk aktif secara metabolik dan sel vegetatif

berkurang resisten melalui germinasi. Sporogenesis dan germinasi tidak

dimaksudkan untuk reproduksi tetapi hanya mekanisme yang menjamin

ketahanan sel dibawah kondisi lingkungan (Suriawiria, 2005).

Endospora adalah struktur spesifik yang ditemukan pada beberapa

jenis bakteri. Karena kandungan air endospora sangat rendah bila

dibandingkan dengan sel vegetatifnya, maka endospora berbentuk sangat

padat dan sangat refraktil bila dilihat di bawah mikroskop. Endospora sangat

sukar diwarnai dengan pewarna biasa, sehingga harus digunakan pewarna

spesifik dan yang biasa digunakan adalah malachite green.

Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan.

Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk

mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-

pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa).

Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya

bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan

sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-

macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan

lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).

Bakteri penghasil spora tahan terhadap pewarnaan. Oleh karena itu,

setelah diwarnai oleh suatu warna, misalnya malachite green, akan mengikat

kuat senyawa pewarna. Untuk pewarnaan selanjutnya, cat tersebut

(misalnya safranin) sel spora tidak dapat menerimanya karena sudah terikat

dengan cat pertama. Akhirnya warna bakteri spora adalah hijau. Bakteri

yang tidak berspora cenderung tidak tahan pengecatan karena hanya

memiliki sel vegetatif. Saat diwarnai oleh malachite, sel vegetatif dapat

mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya

tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif

mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir

adalah merah muda dari safranin (Assani, 1994).

BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum mengenai Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan

Pewarnaan Endospora dilaksanakan pada hari Kamis 15 April 2010 pada

pukul 13.00 16.35 WIB, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan

Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas

Brawijaya, Malang.

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Pembuatan Apusan

Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol

70%, kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan jarum ose

sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan

di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali

yang pengambilannya dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya

hingga kering. Preparat apusan siap diwarnai dan diamati.

3.2.2 Teknik Pewarnaan Gram

Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit, cat

dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya

dikeringkan. Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram B selama 1

menit, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya

dikeringkan. Setelah kering, apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30

detik, cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya

dikeringkan. Setelah kering, apusan digenangi dengan cat gram D selama 1

menit, sisa cat dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan

selanjutnya dikeringkan. Kemudian preparat siap diamati dibawah

mikroskop

3.2.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH

Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol

70%, kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu ose

dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH sebanyak

satu jarum ose. Kemudian campurkan dengan mengaduknya, kemudian

jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk mengetahui apakah cairan

berlendir atau tidak.

3.2.4 Pewarnaan Endospora

Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol

70%, kemudian B. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak satu

kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis dan diletakkan di atas kaca

obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali pengambilan

dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga kering.

Selanjutnya gelas obyek dipanaskan di atas air mendidih dengan menutup

preparat dengan kertas saring dan ditetesi dengan malakit hijau selama 10

menit. Setelah itu dinginkan preparat sebentar, selanjutnya preparat di cuci

dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian genangi preparat

dengan pewarna safranin selama 1 menit, di cuci dengan air mengalir.

Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop,

endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak

berwarna merah.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisa Prosedur

4.1.1 Pembuatan Apusan

Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol

70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat

pembuatatn apusan, kemudian bakteri hasil isolasi diambil menggunakan

jarum ose sebanyak satu kali pengambilan yang telah di tehnik aseptis, agar

tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat pembuatatn

apusan dan diletakkan di atas kaca obyek yang telah terdapat aquades steril

sebanyak satu kali pengambilan dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi

secukupnya hingga kering, agar bakteri yang akan digunakan mati namun

organ dan struktur tidak rusak (Madigan, 2003).

4.1.2 Teknik Pewarnaan Gram

Apusan dicat dan digenangi dengan cat gram A selama 1 menit, cat

dibuang lalu preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya

dikeringkan, agar pewarna sebelumnya tidak bercampur dengan pewarna

yang lain yang akan digunakan (Umsl, 2008). Setelah kering, apusan

digenangi dengan cat gram B selama 1 menit, cat dibuang lalu preparat

dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Cat gram B akan

menguatkan ikatan antara pewarna dengan dinding sel bakteri. Setelah

kering, apusan ditetesi dengan cat gram C selama 30 detik, cat dibuang lalu

preparat dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Cat gram

C akan melarutkan warna sebelumnya, apabila preparat bakteri merupakan

gram negative, maka preparat akan berwarna bening. Setelah kering, apusan

digenangi dengan cat gram D selama 1 menit, sisa cat dibuang lalu preparat

dicuci dengan air mengalir dan selanjutnya dikeringkan. Kemudian preparat

siap diamati dibawah mikroskop. Bakteri gram negative akan berwarna

kemerahan, sedangkan bakteri gram positif akan berwarna ungu.

4.1.3 Konfirmasi Hasil Cat Gram Dengan KOH 3%

Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol

70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat

perlakuan, kemudian bakteri yang akan dikonfirmasi diambil sebanyak satu

ose dan diletakkan pada gelas obyek yang telah terdapat larutan KOH

sebanyak satu jarum ose, konfirmasi dilakukan untuk memastikan bakteri

tersebut gram negatif atau positif. Kemudian campurkan dengan

mengaduknya, kemudian jarum ose diangkat beberapa sentimeter untuk

mengetahui apakah cairan berlendir atau tidak. Jika cairan tersebut berlendir

maka bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif dan jika cairan

tersebut tidak berlendir maka bakteri tersebut bakteri gram positif (Umsl,

2008).

4.1.4 Pewarnaan Endospora

Gelas obyek yang akan digunakan di aseptis dahulu dengan alkohol

70% agar tidak terdapat mikroorganisme yang tidak diinginkan saat

perlakuan, kemudian B. subtilis diambil menggunakan jarum ose sebanyak

satu kali pengambilan yang telah di teknik aseptis dan diletakkan di atas

kaca obyek yang telah terdapat aquades steril sebanyak satu kali

pengambilan dengan jarum ose. Kemudian di fiksasi secukupnya hingga

kering, agar bakteri yang akan digunakan mati namun organ dan struktur

tidak rusak. Selanjutnya apusan bakteri dengan pewarna malakit hijau,

masuknya pewarna dalam endospora di bantu dengan, gelas obyek

dipanaskan dengan diletakkan pada ram kawat di atas air mendidih hingga

timbul uap air dengan menutup preparat dengan kertas saring dan ditetesi

dengan malakit hijau agar endospora yang berkembang dapat terwarna hijau

dan agar endospora tidak mati (menjaga agar tetap lembab (tidak

kekeringan)) selama 10 menit, agar endospora dapat berkembang

(memudahkan pengamatan). Setelah itu dinginkan preparat sebentar,

selanjutnya preparat di cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.

Kemudian genangi preparat dengan pewarna safranin selama 1 menit, di

cuci dengan air mengalir agar endospora dapat terwarna dengan baik.

Preparat ditiriskan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop,

endospora akan tampak berwarna hijau dan sel vegetatif akan tampak

berwarna merah (Scienceprofonline, 2008).

4.3 Data Hasil Pengamatan

Tabel 1. Data hasil pewarnaan bakteri dan endospora

No Isolat kel Bentuk Gram Perbesaran Uji KOH 3% Endospora

B.subtilis

1 BP 1.3 1 Basil - 1000x Ada Ada

2 Basil - 1000x Ada Ada

2 BNP 1.1 3 Basil + 1000x Tidak ada Ada

4 Basil + 1000x Tidak ada Ada

3 BNP 3.2. 5 Basil - 1000x Ada Ada

6 Basil - 1000x Ada Ada

4 BP 8.1 7 Basil - 1000x Ada Ada

8 Basil - 1000x Ada Ada

Tabel 2. Data hasil pewarnaan kapang

No Isolat Kelompok Spora Sporan

gium

Hifa Sporan

giofor

1 KNP 6.1 1 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat,

cabang, tidak

rapat

Ada

Ujung : Tumpul

Jenis : Satu

2 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat,

cabang, tidak

rapat

Ada

Ujung : Tumpul

Jenis : Satu

2 KP 5.3 3 Bentuk : Bulat Tidak

ada

Tidak bersekat,

cabang, tidak

rapat

Tidak

ada

Ujung : Tumpul

Jenis : Satu

4 Bentuk : Bulat Tidak

ada

Tidak bersekat,

cabang, tidak

rapat

Tidak

ada

Ujung : Tumpul

Jenis : Satu

3 KP 4.1 5 Bentuk : Lonjong Tidak

ada

Bersekat, cabang,

rapat

Tidak

ada

Ujung : Lancip

Jenis : Dua : Besar

dan Kecil

6 Bentuk : Lonjong Tidak

ada

Bersekat, cabang,

rapat

Tidak

ada

Ujung : Lancip

Jenis : Dua : Besar

dan Kecil

4 KP 5.1. 7 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat,

cabang, tidak

rapat

Ada

Ujung : Tumpul

Jenis : Satu

8 Bentuk : Bulat Ada Tidak bersekat,

cabang, tidak

rapat

Ada

Ujung : Tumpul

Jenis : Satu

4.3 Analisa Hasil

Data hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolate BP 1.3, BNP 3.2 dan

BP 8.1 merupakan bakteri gram negatif dan berbentuk basil jika diamati

pada mikroskop dengan perbesaran 1000x. Preparat BNP 1.1 merupakan

bakteri gram positif, namun terdapat bentuk yang berbeda yang dikarenakan

kurang telitinya praktikan dalam mengamati bentuk bakteri. Pewarnaan

endospora menggunakan bakteri Bacillus subtilis, dimana bakteri ini

mempunyai endospora yang ditandai dengan warna hijau.

Data hasil pengamatan pada pewarnaan kapang menunjukkan bahwa

terdapat variasi bentuk pada kapang tersebut antara lain bentuk spora yang

bulat dan lonjong, ujung tumpul dan lancip, terdiri atas satu macam atau dua

macam spora. Ada yang memiliki sporangium dan ada pula yang tidak

mempunyai sporangium. Hifa ada yang bersekat dengan cabang yang tidak

rapat, ada pula hifa yang bersekat dengan cabang rapat. Ada yang memiliki

sporangiofor dan ada pula yang tidak memiliki sporangiofor.

Bakteri dan kapang, baik yang tercemar maupun yang tidak tercemar

pestisida akan mempunyai karakteristik yang sama berdasarkan hasil

pewarnaan yang telah dilakukan. Hal ini menunjukkan bahwa tidak ada

perbedaan morfologi yang berarti antara bakteri dan kapang yang tercemar

maupun yang tidak tercemar.

Pada pewarnaan Gram yang dilakukan digunakan gram A, gram B,

gram C, dan gram D. Gram A merupakan cat yang terdiri dari campuran

kristal violet 2 gram, etil alkohol 95% 20 ml, ammonium oksalat 0,8 gram,

aquades 80ml. Kristal violet merupakan bahan kimia dengan rumus kimia

C18H15N3O3, bukan merupakan bahan kimia berbahaya, dan biasa digunakan

dalam teknik pewarnaan microscopy Certistain (Merck, 2007). Gram B

merupakan merupakan cat yang terdiri dari campuran yodium 1 gram,

kalium yodida 2 gram, akuades 300ml. Gram B merupakan larutan mordan

yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh

bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas

warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada

pewarnaan gram , penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya

persenyawaan kompleks kristal violet-yodium. Tanpa penambahan larutan

mordan, zat warna kristal violet akan larut saat penambahan larutan

pemucat. Gram C merupakan cat yang terdiri dari campuran aseton 50ml

dan etil alkohol 95%50ml. Gram C merupakan larutan pemucat . larutan

pemucat berfungsi untuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram

negative yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga

meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet-yodium. Gram D

merupakan cat yang terdiri dari campuran safranin 0, 25 gram , etil alkohol

95% 10ml, dan akuades 90ml. Safranin pada gram D tidak akan

menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan

kompleks kristal violet-yodium tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri

gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri

berubah menjadi merah karena warna ungu yang dihasilkan oleh kristal

violet-yodium telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin

dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi

sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994).

Tabel 3. Perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram

positif dan bakteri Gram negatif (Filzahazny, 2008)

No. Perbedaan Bakteri Gram Positif

(+)

Bakteri Gram Negarif (-)

1 Dinding sel Lapian peptidoglikan

tebal

Lapian peptidoglikan lebih

tipis2 Kadar lipid 1-4% (Lebih rendah) 11-22% (Lebih tinggi)3 Resistensi terhadap alkali

(1% KOH)

Lebih pekat Larut

4 Kepekaan terhadap Yodium Lebih peka Kurang peka

5

Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

6 Resistensi terhadap tellurit Lebih tahan Lebih peka

7 Sifat tahan asam Ada yang tahan asam Tidak ada yang tahan asam

8 Kepekaan terhadap

penisilin

Lebih peka Kurang peka

9 Kepekaan terhadap

streptomisin

Tidak peka Peka

10 Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat11 Ketahanan terhadap fisik Lebih tahan Kurang tahan12 Kebutuhan nutrien Kompleks Relatif

Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres

karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di

lingkungan sampai kondisi menjadi baik. Komponen endospora mempunyai

resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat, yang terdiri dari

cross-linked keratin. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi,

lokasi, dan ukuran endospora. Beberapa endospora mempunyai diameter

lebih besar daripada sel, dimana sel tersebut akan nampak menggembang

pada letak endosporanya. Letak endospora yang berbeda diantara spesies

bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama diantara terminal,

subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel

vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki pengertian

letak sel vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe

subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel

vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupunkecil dari sel

vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini

memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan

dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan

metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi.

Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di

subterminal (Scienceprofonline, 2008).

Komposisi dari Lactophenol Cotton Blue yaitu kristal, cotton blue

0,075 g berfungsi untuk memberi warna pada sel kapang, asam laktat 20 ml

yang berfungsi untuk menjernihkan latar belakang dan mempertajam

struktur kapang, gliserol 40 ml berfungsi menjaga fisiologi sel dan menjaga

sel terhadap kekeringan, kristal fenol + air panas 70oC untuk membunuh

jamur, dan air suling 40 ml (Waluyo, 2007).

Kelebihan dan kekurangan pengecatan gram (Nirwati, 2001):

Kelebihannya adalah: pengecatan gram penting sebagai pedoman

awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif

bakteri penyebab infeksi (kultur dan kepekaan bakteri terhadap antibiotik).

Hal ini dikarenakan bakteri gram positif dan negatif mempunyai kepekaan

yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang morfologi

bakteri yang telah dicat gram mempunyai makna dignostik. Misalnya pada

pemeriksaan gram ditemukan gram negatif diplococci intraseluler dari

spesimen pus (nana), uretral, maka memberikan presumptive diagnosis

untuk penyakit infeksi gonoro.

Kekurangannya adalah pengecatan gram memerlukan

mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 ml per ml.

Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan

serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk

mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil

sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara

mikroskopis.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan

mensuspesikan biakan bakteri dengan aquades, kemudian difiksasi.

Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan

Gram dan ZiehlNelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi

penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian

kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri

akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif

membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di

tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Endospora

adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang

nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan

sampai kondisi menjadi baik. Letak endospora yang berbeda diantara

spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi, tipe utama diantaranya

ialah terminal, subterminal dan sentral.

5.2 Saran

Diharapkan praktikan teliti dan hati-hati dalam pemurnian sebab

dikhawatirkan dapat terjadi kontaminasi.

DAFTAR PUSTAKA

Assani, S. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia, Jakarta.

Cappuccino, J. G. & Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual.

Addison-Wesley Publishing Company, New York.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia. Jakarta

Filzahazny., 2008, , http:/wordpress.com/Penganta-tentang-bakteri.htm.

Diakses pada tanggal 26 April 2010

Gozali. Amir. 2009. Pewarnaan gram.

http://www.gozali.blogspot.com/gram/pewarnaan-gram-prinsip.html .

Diakses pada tanggal 26 April 2010

Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta :

Pt Gramedia.

Jason. 2009. The Gram Stainning. http://astro.temple.edu/~jasoncg/ID/

microreporting.htm. Diakses pada tanggal 26 April 2010

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo

Persada. Jakarta.

Levine, M. 2000. An Introduction to Laboratory Technique in Bacteriology.

McMillan Company, New York.

Madigan, M.T. 2003. Brock Biology of Microorganism. Pearson Education,

inc. United State of America.

Merck . 2007. Cresyl Violet Acetate. http://www.merck-

chemicals.co.id/cresyl-violet-

acetate/MDA_CHEM105235/p_zyOb.s1LZb0AAAEWZuEfVhTl;si

d=2XfBHZapUlXHHd9B9-

vTSj5pCnREAl69HlgSHhO2CnREAkWqXGgJCVGG. diakses

pada tanggal 26 April 2010

Nirwati, Hera. 2001. Pembuatan preparat dan pengecatan dalam petunjuk

praktikum mikrobiologi Fakultas kedokteran Universitas Gadjah

Mada. Universitas Gadjah Mada press. Yogyakarta.

Partic, Li. 2008. Pewarnaan endospora. http://www.dunia-

mikro.blogspot.com/2008/08/pewarnaan endospora. Diakses pada

tanggal 26 April 2010

Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill

Book Company. New York.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti. Jakarta.

Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta. Jakarta.

Tracy. 2005. Gram Staining. www.tracy.k12.ca.us/thsadvbio/pdfs/gram

%20stain.pdf. Diakses pada tanggal 26 April 2010

Umsl. 2008. Staining Bacteria.

www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf. Diakses

pada tanggal 26 April 2010

Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga. Jakarta

Waluyo, L . 2007 . Mikrobiologi Umum . Universitas Muhammadiyah

Malang Press. Malang.