BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam melakukan diagnosa Mikrobiologi sterilisasi sangat diutamakan

baik alat maupun medianya. Suatu alat dikatakan steril apabila alat atau bahan

bebas dari mikroba baik dalam bentuk vegetative maupun spora. Untuk itu

sebagai pemula dalam Mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik sterilisasi,

pembuatan media serta teknik penanaman (Dwidjoseputro, 1994).

Secara umum sterilisasi merupakan proses pemusnahan kehidupan

khususnya mikroba dalam suatu wadah ataupun peralatan laboratorium.

Sterilisasi dalam Mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua

mikroorgansime yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ada tiga cara

utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas,

penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Apabila panas

digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi basah, bila

tanpa kelembaban maka disebut sterilisasi kering (Dwidjoseputro, 1994).

Untuk membutuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan

suatu substrat yang disebut medium. Sedangkan medium itu sendiri sebelum

digunakaan harus dalam keadaan steril artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba

lain yang tidak diharapkan agar mikroba dapat tumbuh dan berkembangbiak

dengan baik di dalam medium, maka diperlukan syarat tertentu yang

diantaranya bahwa didalam medium harus terkandung semua unsur hara yang

diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba kemudian

susunan makanannya, tekanan osmosis, derajat, keasaman (pH), dan

temperatur (Hadietomo, 1990).  

Dalam bidang penelitian mikroorganisme ini, tentunya menggunakan

teknik atau cara-cara khusus untuk mempelajarinya dan bekerja pada skala

laboratorium untuk meneliti mikroorganisme ini baik sifat dan

karakteristiknya, tentu diperlukan pula tentang bagamana caranya

menumbuhkan suatu mikroba ke dalam suatu media, karena kita tahu bahwa

beragamnya persyaratan tumbuh mikroba, maka harus dimengerti jenis-jenis

nutrient yang disyaratkan oleh mikroba dan juga macam lingkungan fisik

yang menyediakan kondisi yang optimum bagi pertumbuhannya. Mikroba

amat beragam, baik dalam persyaratan nutrient maupun fisiknya. Jadi, media

yang digunakan harus mengandung komponen-komponen yang dibutuhkan

oleh mikroba tersebut (Hadietomo, 1990).

Untuk mengenal lebih jauh tentang penyiapan medium untuk suatu

mikroba, maka diadakanlah praktikum ini, dimana dalam praktikum ini

praktikan diwajibkan mampu mengetahui cara-caranya mulai dari awal

sampai akhir melalui bimbingan dari kakak asisten.

1.2 Tujuan

Adapun tujuan yang ingin dicapai oleh praktikan dalam praktikum kali

ini yaitu:

1. Mengetahui cara pembuatan media dan membedakan berbagai media

pertumbuhan mikroba.

2. Mengetahui cara dan macam-macam sterilisasi.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Medium

Medium adalah substansi yang terdiri atas campuran zat-zat makanan

(nutrien) yang dipergunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan

mikroorganisme. Mikroorganisme juga merupakan mahluk hidup, untuk

memeliharanya dibutuhkan medium yang harus mengandung semua zat yang

diperlukan untuk pertumbuhannya, yaitu antara lain senyawa-senyawa

organik (protein, karbohidrat, lemak, mineral, dan vitamin). Medium

digunakan untuk melihat gerakan dari suatu gerakan mikroorganisme apakah

bersifat motil atau nonmotil, medium ini ditambahkan bahan pemadat 50%

(Hadietomo, 1990).

Mikroorganisme dapat menggunakan makanan dalam bentuk padat dan

dapat pula yang hanya menggunakan bahan-bahan dalam bentuk cairan atau

larutan. Mikroorganisme yang menggunakan makanannya dalam bentuk

padat tergolong tipe holozoik. Mikroorganisme yang dapat menggunakan

makanannya dalam bentuk cairan atau larutan disebut holofitik. Ada beberapa

mikroorganisme yang dapat menggunakan makanannya dalam bentuk

padatan, tetapi makanan tersebut sebelumnya harus dicerna, di luar sel

dengan bantuan enzim ekstraseluler (Anonim, 2009).

Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun

sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang

menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan

terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron,

sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. Selain itu, secara umum

nutrien dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang

penting untuk sintesis biologik oranisme baru (Hadietomo, 1990).

Tiap sel harus mensintesis sendiri konstituen tubuhnya dari zat-zat

sederhana yang ditemukan dalam lingkungannya. Kebanyakan dari zat-zat ini

berupa makanan dalam bentuk suspensi atau larutan yang ditemukan dalam

air laut, sungai, danau, air selokan, atau bahan-bahan organik lain yang

mengalami penguraian, dan sebagainya. Sifat kimia dan fisika dari habitat ini

menentukan jenis organisme yang dapat tumbuh atau hidup di lingkungan itu

(Irianto, 2006).

Menurut Pelgzar (1996), klasifikasi medium berdasarkan fungsinya

digolongkan menjadi 7 golongan, yaitu:

1. Medium umum, media yang ditambahkan bahan-bahan yang

bertujuan menstimulasi pertumbuhan mikroba secara umum.

Contoh Nutrient Agar (NA) untuk menstimulasi pertumbuhan

bakteri, Potato Dextrose Agar (PDA) untuk menstimulir

pertumbuhan fungi.

2. Medium khusus, merupakan medium untuk menentukan tipe

pertumbuhan mikroba dan  kemampuannya untuk mengadakan

perubahan-perubahan kimia tertentu misalnya, medium tetes tebu

untuk Saccharomyces cerevisiae.

3. Media diperkaya (enrichment media), media yang ditambahkan

bahan-bahan tertentu untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba

yang diinginkan. Hal ini dilakukan untuk menstimulasi

pertumbuhan mikroba yang jumlahnya sedikit dalam suatu

campuran berbagai mikroba, contoh Chocolate media dan Yeast-

Extract-poptasium Nitrat Agar.

4. Media selektif, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan

tertentu yang akan menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak

diinginkan yang ada dalam suatu spesimen. Inhibitor yang

digunakan berupa antibiotik, garam dan bahan-bahan kimia

lainnya.

5. Media diferensial, merupakan media yang ditambahkan bahan-

bahan kimia atau reagensia tertentu yang menyebabkan mikroba

yang tumbuh memperlihatkan perubahan-perubahan spesifik

sehingga dapat dibedakan dengan jenis lainnya.

6. Medium penguji (assay medium), yaitu medium dengan susunan

tertentu yang digunakan untuk pengujian senyawa-senyawa tertentu

dengan bantuan bakteri misalnya medium untuk menguji vitamin-

vitamin, antibiotika dan lain-lain.

7. Medium perhitungan jumlah mikroba yaitu medium spesifik yang

digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan,

misalnya medium untuk menghitung jumlah bakteri E.coli air

sumur.

2.2 Sterilisasi

Sterilisasi merupakan proses untuk mematikan semua mikroorganisme

yang hidup. Adanya pertumbuhan mikro menyatakan bahwa pertambahan

bakteri masih berlangsung dan tak sempurnanya proses sterilisasi. Jika proses

sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk

paling resikan dari kehidupan mikroba tak akan terlihat lagi. Sterilisasi

merupakan metode praktis yang dirancang untuk membersihkan dari

mikroorganisme, atau sengaja untuk menghambat pertumbuhannya.

Mikroorganisme sangat berbeda, dalam kelemahannya terdapat berbagai

macam agen antimikroba (Suriawiria, 2005).

Cara kerja sterilisasi ialah cara kerja agar terhindar dari kontaminasi,

cara steril ini digunakan pada pembuatan media, dan pembuatan preparat.

Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara: (Anonim, 2009)

1. Fisik yang dibagi menjadi beberapa bagian:

a. Dengan hot air sterilisation oven, bahan dari gelas di bungkus dengan

aluminium foil, dengan suhu 170°-250°C selama 2 jam.

b. Panas basah dengan tekanan suhu 121°C selama 15 menit. Alat yang

digunakan adalah autoclave.

c. Pressure cooker, panaskan air mendidih, biarkan klep uap terbuka

agar keluar uap kemudian klep uap ditutup, lihat suhu dan tekanan,

bila suhu telah 121°C dengan tekanan 1,5 atm, dijaga konstan selama

15 menit. Kemudian buka klep uap hingga tercapai tekanan nol, dan

setelah suhu mencapai suhu kamar, alat dan bahan dikeluarkan.

2. Kimia, dengan menggunakan zat-zat kimia seperti desinfektan, antiseptik.

3. Radiasi dengan sinar ultra violet, biasanya digunakan pada ruangan dan

alat – alat plastik.

4. Filter dengan membran filter dan vacum pump.

Alat-alat yang dipakai ketika penanaman, harus dalam keadaan steril.

Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam

seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau

dengan pemanasan dalam bacticinerator (Irianto, 2006).

Sterilisasi dengan panas adalah unit operasi dimana bahan dipanaskan

dengan suhu yang cukup tinggi dan waktu yang cukup lama untuk merusak

mikroba dan aktivitas enzim. Sebagai hasilnya, bahan yang disterilkan akan

memiliki daya simpan lebih dari enam bulan pada suhu ruang. Contoh proses

sterilisasi adalah produk olahan dalam kaleng seperti kornet, sarden dan

sebagainya (Irianto, 2006).

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Mikrobiologi dengan judul Sterilisasi dan Pembuatan Media

dilaksanakan pada hari Senin, tanggal 18 November 2013, pada pukul 13.20 WIB

hingga selesai. Praktikum ini bertempat di Laboratorium Biologi Institut Agama

Islam Negeri Raden Fatah Palembang.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan yaitu:

1. Timbangan Analitik

2. Gelas Ukur

3. Erlenmeyer

4. Tabung Reaksi

5. Kaca Pengaduk

6. Autoklaf

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan yaitu:

1. Aquades

2. Kapas

3. Aluminium Foil

4. Alkohol

5. Kentang 200 gram

6. Dektrosa/gula

7. Agar-agar

8. Kompor Gas/Listrik

3.3 Cara Kerja

Pembuatan Media

1. Membuat media umum/konvesional untuk pertumbuhan bakteri (Nutrient

Agar):

Beef extract (ekstrak daging) .................................................10 g

Pepton .......................................................................................10 g

Agar-agar ................................................................................15 g

Aquades ..............................................................................100 ml

Catatan: ekstrak daging bila tidak tersedia dapat dibuat sendiri, dengan

cara sebagai berikut:

1. Buat ekstrak daging (daging 0.5 kg direbus dalam air 1000 ml hingga

volume air menjadi setengah atau direbus selama 1-2 jam.

2. Saring ekstrak daging dengan kertas saring, kemudian tambahkan

aquades hingga volume menjadi 1000 ml.

3. Masukkan pepton dan agar-agar, lalu diaduk sampai homogen.

4. Biarkan diatas api sampai hampir mendidih

5. Masukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml untuk agar miring,

dan disimpan dalam erlenmeyer

6. Semua tabung dan erlenmeyer yang berisi medium ditutup dengan

kapas dan aluminium foil.

7. Sterilkan dengan autoklaf.

8. Setelah disterilkan tabung reaksi yang berisi 5 ml dimiringkan untuk

media agar miring dan di erlenmeyer disimpan dalam inkubator/water

bath.

2. Membuat media umum untuk jamur (Potato Dectrosa Agar)

Kentang ...............................................................................200 gr

Dektrosa/gula ..........................................................................10 gr

Agar-agar ...............................................................................15 gr

Aquades ............................................................................1000 ml

Cara Kerja:

1. Bersihkan kentang lalu dipotong kecil-kecil. Kemudian dimasak dalam

500 ml aquades. Biarkan mendidih selama 1 jam, jaga volume agar

tetap.

2. Saring ekstrak kentang, ambil fitratnya.

3. Tambahkan dektrosa/gula sambil dipanaskan dengan menggunakan api

sedang.

4. Tambahkan agar-agar, panaskan dan aduk hingga homogen. Setelah

mendidih diangkat dan dimasukkan ke dalam botol/erlenmeyer.

5. Tutup dengan kapas dan aluminium foil, kemudian sterilisasi dengan

autoklaf.

Sterilisasi Fisika (Autoklaf)

1. Sebelum dihidupkan periksa alat Autoclave-Pressure Steam Sterilizers,

sudah bersih atau belum.

2. Isi air dalam alat sebatas saringan.

3. Masukkan bahan-bahan yang akan di sterilisasi, sebelumnya diberi

indikator tanda sudah steril atau belum dengan autoclave tape.

4. Tutup covernya dengan mencocokkan dengan tanda kuncinya.

5. Rapatkan kunci-kunci secara diagonal sampai rapat betul. Posisi alat pada

high.

6. Tekan Power/ON dengan menutup katup agar uap air tidak keluar.

7. Bila tekanan sudah sampai pada tanda 15 (tekanan sudah mencapai 121°

C) atau caution.

8. Tekan timer selama 15 menit.

9. Bila sudah 15 menit, maka katup dibuka. Bersamaan dengan itu matikan

power.

10. Bila alat sudah dalam posisi 0, maka buka katup. Biarkan alat dingin

dahulu.

11. Buka metal to metal secara diagonal.

Ambil hasil sterilan, lihat indikator autoclave tape-nya.

Sterilisasi cara Kimia

1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam

tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang

memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih

dahulu.

2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu

dibakar.

3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin

dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk

mempercepat transfer panas yang terjadi.

4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke

bagian api.

5. Jika kerja di safety cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi

jika diluar safety cabinet maka semakin banyak sumber api semakin

terjamin kondisi aseptisnya.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Hasil akhir dari proses sterilisasi sesuai dengan petunjuk praktikum

yang kita dapatkan setelah menginkubasi alat dan bahan ke dalam autoklaf

pada suhu 121℃ selama 15 menit, alat dan bahan tersebut menjadi steril

(matinya mikroorganisme yang terdapat pada alat dan bahan).

Nama

MediumFungsi

Pengamatan

Sebelum

Pengadukan

Pengamatan

Sesudah

Pengadukan

PDA

Sebagai tempat

pembiakan

mikroba

Warnanya

bening, agak

keruh, cair

Kuning keruh,

dan sedikit

kental

4.2 Pembahasan

Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan

mikroorganisme di atas atau di dalamnya, medium tersebut harus memenuhi

syarat-syarat, antara lain adalah harus mengandung semua zat hara yang

mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan

permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan

ditumbuhkan, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat

pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan,

agar mikroba yang di tumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Hadioetomo,

1993). Percobaan kali ini yaitu pembuatan medium NA dan PDA.

NA (nutrient agar) digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri.

Pembuatan medium percobaan ini dengan menggunakan NA (nutrient agar),

dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu dengan cara menimbang bahan

yang akan digunakan kedalam neraca analitik sesuai dengan jumlah yang

diperlukan kemudian memasukkan bahan kedalam erlenmeyer 250 ml,

dimana bahan tersebut adalah aquades 250 ml, NA 3,75 dan agar 7 gram

setelah itu dipanaskan diatas hot plate 440oC di ikuti oleh pengadukan dengan

menggunakan magnetic stirrer, tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini

adalah untuk menghomogenkan NA dengan aquades, dimana dengan

pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari NA dan aquades. Setelah

dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna dari keruh menjadi kuning

kecoklatan hal ini menandakan larutan telah homogen. Kemudian

dimasukkan kedalam autoklaf dengan mulut erlenmeyer disumbat dengan

kapas dan dilapisi kertas aluminium diluarnya. Tujuan dari penutupan ini agar

meminimalkan kontaminasi. Pembuatan NA berdasarkan konsistennya

termasuk medium padat dan menurut kegunaannya termasuk medium umum.

PDA (Potato Dextrose Agar) digunakan untuk menumbuhkan fungi

atau jamur. Pembuatan medium pada percobaan ini dengan menggunakan

PDA (Potato Dextrose Agar) dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu

dengan cara memasukkan 200 ml aquades dan 50 ml ekstrak kentang, 3,75

deglucose dan 7 gr agar kemudian dipanaskan diatas hot plate 440 oC diikuti

oleh pengadukan dengan tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini untuk

menghomogenkan PDA dengan aquades, dan pemanasan bertujuan

mempercepat pelarutan dari PDA. Setelah dipanaskan beberapa menit larutan

berubah warna dari keruh menjadi kuning tua, hal ini menunjukkan larutan

telah homogen. Setelah itu dimasukkan kedalam autoklaf tetapi sebelum

dimasukkan mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas dan kemudian dibungkus

dengan kertas, hal ini bertujuan agar meminimalkan kontaminasi. PDA

termasuk medium nonsintetik karena termasuk medium padat sedangkan

menurut fungsinya termasuk medium umum.

Autoklaf adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi. Autoklaf

termasuk dalam teknik sterilisasi secara fisika dengan prinsip arus uap dan

tekanan. Alat ini sering digunakan dalam teknik pensterilan karena tingkat

koefisien dan sifat alat yang tidak merusak kandungan dalam media

pertumbuhan yang dipakai yaitu NA, PDA, MEA dan LB (Suriawiria, 2005).

Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi,

yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi merupakan

suatu proses (kimia dan fisika) yang membunuh semua bentuk hidup terutama

mikroorganisme (Suriawiria, 2005). Sterilisasi yang digunakan dalam

percobaan ini adalah secara fisika yaitu menggunakan panas, dimana panas

yang digunakan adalah bersama uap air yang biasanya disebut sterilisasi

basah.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Sterilisasi merupakan proses untuk mematikan semua mikroorganisme

yang hidup. Cara kerja sterilisasi ialah cara kerja agar terhindar dari

kontaminasi, cara steril ini digunakan pada pembuatan media, dan pembuatan

preparat. Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara fisik, kimia, radiasi dan

filter. Medium adalah substansi yang terdiri atas campuran zat-zat makanan

(nutrien) yang dipergunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan

mikroorganisme.

5.2 Saran

Sebaiknya pada saat praktikum praktikan sudah bisa menguasai teknk-

teknik atau cara kerja dari praktikum yang akan dilaksanakan sehingga tidak

akan terjadi kekeliruan yang bisa menghambat jalannya praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2009. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Universitas Indonesia: Jakarta.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.

Hadioetomo, R. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi.

Gramedia: Jakarta.

Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Jilid 1. Yrama Widya: Bandung.

Pelgzar & Reid. 1958. Mycrobiology. Mc Graw-Hill Compan: Tokyo.

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti: Jakarta.