Kuliah ke-4 STERILISASI DALAM FERMENTASI

Tujuan Instruksional Khusus :

• Mahasiswa mampu menjelaskan sterilisasi dalam proses fermentasi

• Produk fermentasi diperoleh bila mikroorganisme tumbuh pada media yang sesuai

Bila terkontaminasi, maka :

Produktivitasnya menurun akibat kompetisi mikrobia

Kontaminan mendominasi kultur dan mengganti mikrobia yang diinginkan.

Mempengaruhi kualitas produk, misalnya pada produksi protein sel tunggal.

Kesulitan dalam ekstraksi produk Kontaminan akan mendegradasi produk, misalnya

pada produksi antibiotik. Kontaminan berupa bakteriofag dapat

menyebabkan sel mikrobia menjadi lisis. •

• Usaha-usaha untuk menghindari kontaminasi :

Penggunaan kultur murni

Sterilisasi medium

Sterilisasi tangki fermentasi

Sterilisasi bahan tambahan

Pemeliharaan kondisi aseptik.

Tergantung

proses

fermentasi

dan derajat

konsekwensi

Cara-Cara Sterilisasi

• Metode kimia

Untuk peralatan yang sensitif terhadap panas

→ ethylene oxide (gas untuk alat

→ 70% ethanol-air (pH=2) untuk alat/permukaan

→ 3% sodium hypochlorite untuk alat

• Proses pemanasan

• Radiasi

UV untuk permukaan

Sinar X untuk cairan

Metode umum : pemanasan basah atau kering

Cara-Cara Sterilisasi ......

• Sonikasi (sonik /getaran ultrasonik)

• Sentrifugasi kecepatan tinggi

• Filtrasi untuk bahan yang sensitif panas dan udara

Proses Sterilisasi

• Dilakukan pada reaktor baik dalam kondisi kosong maupun yang sudah diisi dengan media

• Reaktor dipanaskan engan uap jenuh (suhu 121 -141oC) menggunakan sistem pindah panas (double jacket atau alat penukar panas lainnya) dengan waktu sesuai dengan yang diinginkan reaktor didinginkan

Waktu dan Suhu Sterlisasi dari beberapa mikroorganisme

STERILISASI MEDIUM

• Caranya : - dengan filtrasi presipitasi

- dengan pemanasan yang utama

pemanasan basah mudah, ekonomis

KINETIKA KEMATIAN TERMAL MIKROBA

1. Laju Kematian

• Terdiri atas : - laju kematian logaritmik

- laju kematian non logaritmik

a. Laju Kematian Logaritmik

• Terdapat pada kultur murni

• Laju kematian logaritmik secara matematik :

kN

dt

dN

N= konsentrasi mikrobia (jumlah/ml)

k = konstanta laju kematian spesifik

(menit-1)

t = waktu (menit)

…………….Pers.1

• Integrasi dari persamaan (1) dengan batasan N = No dan t = to menghasilkan :

............Pers 2) atau

No = jumlah mikrobia pada awal sterilisasi

Nt = jumlah mikrobia pada akhir sterilisasi

kt

o

t eN

N

ktN

N

o

t ln ……..Pers 3)

o

t

N

N

o

t

N

Nln

Waktu (t) Waktu (t)

Gambar 1. Proporsi sel hidup pada mikrobia yang

mengalami sterilisasi berdasarkan

persamaan 2 dan 3.

Slope = k

• Slope kurva = k Nilai absolut k = pengukuran resistensi termal organisme, semakin kecil nilai k maka resistensi mikroba terhadap aktivitas termal semakin tinggi.

Gambar 2. Laju kematian tipikal bagi sel-sel vegetatif E.coli

T=54oC

T=56oC

T=58oC

T=60oC

N/No

10

1

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

0 2 4 6 8 10

Waktu (Menit)

b. Laju Kematian Non Logaritmik

• Sering terdapat pada spora bakteri

• Penyebab penyimpangan : germinasi spora, teknik eksperimen yang belum baik.

o

t

N

Nln

o

t

N

Nlnln N

Waktu Waktu Waktu

.............. = Kultur murni

________ = Organisme Sensitif

- - - - - - - = Organisme Resisten

Gambar 3. Penyimpangan kurva pada proses sterilisasi

akibat kultur campuran dan aktivasi spora

• Urutan kejadian untuk model kematian non logaritmik diusulkan oleh Prokop and Humprey (1970) inaktivasi spora terjadi dengan cara :

kR kR

NR Ns ND Spora intermediet mati

resisten sensitif

• Persamaan diferensial untuk model ini :

RRR Nk

dt

dN ………………….4)

ssRRs NkNk

dt

dN ………………...5)

NR = konsentrasi spora resisten (jumlah/ml)

Ns = konsentrasi spora sensitif (jumlah/ml)

ND = spora yang mati (jumlah/ml)

kR = laju inaktivasi spesifik spora resisten (menit-1)

ks = laju inaktivasi spesifik spora sensitif (menit-1)

t = waktu (menit)

• Penyelesaian persamaan (5) :

N = kosentrasi sel hidup yang dapat diperoleh

kembali setiap saat = Ns+ NR (jumlah/ml)

No = konsentrasi sel hidup awal (jumlah/ml)

)]exp()[exp(t

R

R

ss

sR

R

o

kk

ktk

kk

k

N

N

Pers 6)

• Pada sterilisasi medium fermentasi, kosentrasi dan tipe mikrobia seringkali tidak diketahui, sehingga digunakan resistensi termal relatif mikrobia untuk merancang siklus sterilisasi

Mikrobia Resistensi Relatif

Bakteri vegetatif dan khamir 1.0

Spora bakterial 3 x 106

Spora Kapang 2 – 10

Virus dan Bakteriofag 1 - 5

Tabel 1. Resistensi relatif dari berbagai mikrobia

terhadap panas uap air.

spora bakteri lebih resisten terhadap panas uap air siklus

sterilisasi dirancang berdasarkan destruksi spora bakteri

2. Pengaruh Suhu Terhadap Kinetika Kematian

• Teori yang sering digunakan : Teori Arrhenius

RTEAek / ………..Pers (7)

RT

EAk lnln ………..Pers (8)

E = energi aktivasi kematian (kal/mol)

R = konstanta gas (kal/molo K)

T = suhu (oK)

A = konstanta Arrhenius (menit-1)

• Kombinasi persamaan (3) dan persamaan (7) menghasilkan :

RTE

t

o eAN

N /..ln ………..Pers 9)

N

Noln = kriteria sterilisasi atau Del factor = V

= suatu destruksi sel mikrobia terhitung akibat

kenaikan suhu pada waktu tertentu.

)/(.. RTEetAV …………Pers 10) atau

)ln(lnA

V

RT

Et …………Pers 11)

3. Sterilisasi Media Secara Batch

• Informasi yang diperlukan :

a) Profil peningkatan dan penurunan suhu dalam media

b) Jumlah mikrobia awal

c) Karakteristik kurva destruksi mikrobia oleh panas. Pada umumnya dipilih spora bakeri yang tahan panas yaitu Bacillus stearothermophillus.

d) Resiko/derajat kontaminasi yang ditoleransi, misalnya 1 sel dalam 1000 atau Nt = 10-3 sel hidup.

• Bila jumlah mikrobia awal pada media = 1011 sel hidup, dan derajat kontaminasi yang ditoleransi 10-3, maka harga del factor :

3

11

10

10lnln

t

o

N

NV = ln 1014 = 32.2

diperoleh sejak pemanasan, sterilisasi sampai pendinginan,

sehingga :

Vtotal = Vpemanasan + Vsuhu sterilisasi + Vpendinginan

• Perhitungan del factor selama pemanasan dan pendinginan :

Dari persamaan 10 :

Pada periode ini suhu dianggap konstan sehingga perubahan hanya terjadi pada suhu sterilisasi.

Perubahan suhu secara grafis digambarkan sebagai berikut :

)/(.. RTEetAV

t1 t2 t3 t4 t5 t6

Suhu

Waktu

Gambar 4. Metode grafis yang digunakan untuk menggambarkan

hubungan waktu dan suhu serta perhitungan harga V.

• Harga V untuk setiap bagian : V1 = k1t, V2 = k2t, V3 = k3t dst.

• Nilai k1, k2 dst dicari dengan persamaan Arrhenius sedangkan harga t dapat dilihat dari kurva seperti pada Gambar 4.

• Dengan menggunakan persamaan Arrhenius, maka nilai k untuk spora B.stearothermophillus dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Korelasi antara kecepatan kematian spesifik (k) spora B.stearothermophilus dengan suhu pemanasan

• Contoh : Diketahui suhu sterilisasi 121oC dengan total del factor 32.2. Jika kenaikan suhu dari 100oC ke 121oC dicapai selama 30 menit dan penurunan suhu dari 121oC ke 100oC dicapai dalam waktu 17 menit, berapakah total waktu sterilisasi?

• Jawab : Dari Tabel 2 diperoleh nilai del factor pada suhu 121oC = 12.549, maka :

Vpemanasan 100-121o

C =

Vpendinginan 121-100o

C =

Vsuhu sterilisasi 121o

C =

21

30549.12 x = 17.93

21

17549.12 x = 10.16

32.2 – 17.93 – 10.16 = 4.11

V121o

C = k121o

C.t121o

C t121o

C = 54.2

11.4= 1.62 menit

total waktu sterilisasi = 30 + 1.62 + 17 = 48.62 menit

• Perhitungan waktu pada suhu sterilisasi (121oC) Vtotal = Vpemanasan + Vsuhu sterilisasi + Vpendinginan

Misal : Vtotal = 32.2 Vpemanasan = 9.8, Vpendinginan = 10.1, maka : Vsuhu sterilisasi = 32.2 – 9.8 – 10.1 = 12.3 Diketahui nilai k untuk B.stearothermophillus pada

suhu 121oC adalah 2.54/menit, maka waktu untuk suhu sterilisasi adalah :

V = kt t = V/k = 12.3/2.54 = 4.84 menit pada suhu 121o C

• Bila kontribusi pemanasan dan pendinginan diabaikan selama proses sterilisasi, maka :

= 12.68 menit pada 121oC.

68.1254.2

2.32

k

Vt total

Gambar 7. Proses Sterilisasi Secara Batch

Perencanaan Dalam Proses Sterilisasi Media

• Asumsi :

Kerusakan bakteri terjadi di atas suhu 100oC

Penetrasi panas atau pendinginan di atas suhu 100oC adalah linier.

o Scale up proses sterilisasi secara Batch :

Dasar perhitungan del factor : total kontaminan yang ada dalam media dan bukan volume media Jika ukuran fermenter bertambah maka total sel awal juga naik, tapi probabilitas sel yang digunakan untuk mencapai tingkat sterilisasi tertentu harus tetap sehingga nilai V akan naik.

• Contoh :

Proses sterilisasi skala pilot plant dengan 1000 l tangki media mengandung kontaminan 106/ml, diinginkan proses sterilisasi dengan probabilitas kontaminan 1/1000 maka :

Bila digunakan tingkat sterilisasi yang sama tetapi pada skala produksi 10.000 l media, maka :

5.3410ln10

)101010(ln 15

3

336

xxV

8.3610ln10

101010(ln 16

3

436

xxV

4. Sterilisasi Kontiniu

• Keuntungan :

1) Mudah dalam pengawasan proses

2) Reduksi kapasitas uap

3) Reduksi waktu siklus sterilisasi

4) Potensial dalam pengembangan hasil produk fermentasi

• Cara :

Medium dipanaskan secara tidak langsung dalam pipa atau plat dan penyangga panas

Dengan injeksi uap

Gambar 8. Proses sterilisasi secara kontiniu

Cooling heat

exchanger

Pre- heat

heat

exchanger

Venturi

valve

Flow diagram of a typical continuous injector flash cooler steriliser

Cooling Cooling Unsterile

water in water out medium in

Expansion

chamber

Expansion

valve

Holding coil

Sterile

medium out

Steam in

6. Sterilisasi Fermenter

• Jika media disterilisasi terpisah, maka fermenter juga harus disterilisasi

• Cara :

Mengalirkan uap panas pada suhu 121oC selama 20 menit

Semua bagian yang kontak langsung dengan media harus disterilisasi

7. Sterilisasi Udara

• Pada proses fermentasi aerob diperlukan aliran udara steril ke dalam media secara kontiniu.

• Cara : - dengan pemanasan

- dengan filtrasi lebih umum di industri

• Ada 2 jenis filter :

1. Filter absolut :

ukuran pori lebih kecil dari partikel/mikroba yang disaring. Contoh : 0.2

Efisien, tapi cepat mengalami pressure drop sehingga harus sering diganti.

2. Filter fibrous :

Ukuran pori lebih besar dari partikel/mikroba yang disaring. Misal : 0.5 – 1.5

Banyak digunakan untuk sterilisasi udara pada industri fermentasi

Terbuat dari kapas, kapas gelas atau kapas baja.

8. Perencanaan Sterilisasi Udara

• Contoh : dibutuhkan udara steril untuk fermenter berukuran 10 m x 60 m x 100 m proses fermentasi. Dari percobaan sebelumnya diperoleh kecepatan aliran udara optimum 0.15 m/detik pada nilai k = 1.535/cm.

Dimensi filter =

Udara dalam pabrik mengandung 200 mikroba/m3, sehingga :

No = total mikroba = volume udara x 200

= 10 x 60 x 100 x 200

= 12 x 106 mikroba

kxON

Nln

• Derajat kontaminasi yang ditoleransi = N = 10-3

10-3

ln = - kx ln 8.33 x 10-11 = -1.535 x

12x106

x = 15.12 cm tebal filter = 15.12 cm

Luas area filter yang digunakan =

Volume aliran udara

kecepatan linier 10 r2 = m2

radius (r) filter = 0.59 m 0.15 x 60

SOAL • Hitunglah waktu yang dibutuhkan untuk proses sterilisasi media fermentasi

berikut :

Jumlah awal bakteri pada media : 5 x 1012 per m3, dan jumlah akhir yang diinginkan adalah 1 per 1000.

Volume media 40 m3 dengan suhu awal 25oC. Media disterilisasi dengan sistem pemanasan langsung menggunakan uap jenuh dalam sebuat fermentor. Uap dengan tekanan 345 kPa (tekanan absoult) diinjeksikan dengan kecepatan 5,000 kg/jam, dan injeksi uap dihentikan ketika suhu sudah mencapai 122oC.

Suhu media ditahan pada 122oC. Panas yang hilang selama waktu pemanasan dapat diabaikan, kemudian media didinginkan dengan cara melewatkan air suhu 20oC dengan kecepatan 100 m3/jam melalui koil pendingin hingga suhu akhir media mencapai 30oC. Luas permukaan koil adalah 40 m3, and laju pindah panas overall (U) = 2500 kJ/jam.m2.K.

Resistensi panas spora bakteri adalah :

• kdo = 5.7 x 1039 per jam

• Ed = 2.834 x 105 kJ / kmol

Nilai Panas spesifik media (c) = 4.187 kJ/kg.K dan densitasnya (ρ) = 1000 kg/m3

Studi Kasus 1

Carilah proses persiapan media fermentasi untuk pembuatan Bir (dari Wort)

Bandingkan dengan persiapan media untuk produksi penisilin

Studi Kasus 2

• Cari perbedaan antara proses sterilisasi dengan sistem pemanasan langsung dan sistem pemanasan tidak langsung (menggunakan alat penukar panas)

• Berikan contoh aplikasi masing-masing pada industri pangan.