fnaialab llrniab ISSN Og5+ ^, O72gAGR,IPLf]SAdoutlah, Nla'ruf Tafsln, Amlnuddln Parakkasl, Andt Nlurft : PENGARUHSUPLEMENTASI BERBAGAI SERAT KOMERSIL TERHADAP KADAR KOLESTEROLSERUM DAN DAGING PADA MENCIT (Musmusculuc)

A. Bahrun z RESPON TANAIvIAN KEDELAI (Glyicine max L. Merr) TERHADAP SISTEMPENGAIRAN.

NIuhIdTn : TOLERAT{SI BEBERAPA VARIETAS KEDELAI TERHADAP CEKAMAI{ ALU.MINIUM PADA STADIA BIBIT

Takdlr Salll, Nlohamad Agvs Settadt, Srlhadl Agungprlyono, Nlozes R. Toehheredan Artef Boedtono : PENGARUH PENGERINGBEKUAN TERHADAP PERUBAHAI{MORFOLOGI SPERMATOZAA DOMBA

Nluhammod Tauftk dan Syalr : ISOLASI DNA PLASMID DENGAN METODE MINIPREP

QIAPREP (ISOLATING BACTEARIA PLASMID BY MINIPREP QIAPREP)

IUIuKhtaT : PROSPEK PENGEMBANGAN AGRIBISNIS KARAMBA JARING APUNGIKAI{ KERAPU TIKUS (Cromileptes altiuelis) DI KECAMATAN SOROPIA

Gusno Ff.S. dan Abdul Rahman: AIIALISIS PROTEIN DAN ISOZIM PLANLET PISAhIGBARAT.IGA}I HASIL INDUKSI FILTRAT FOC DAN BDB SECARA IN-YITRO

L.IW. HaTofah : PRODUKTIVITAS PEKERJA DAN STRATEGI KEBIJAKANPEMBANGUNAN SEKTOR PERTANIAN (STUDI PADA MASYARAKAT PEDESAANDI PROVINSI SULAWESI TENGGARA)

Hg/MflTUI Ho,dTN' : DESKRIPSI DAN KLASIFIKASI PISANG LOKAL ASAL KABUPATENBUTON PROVINSI SULAWESI TENGGARA

ISKAndaT : PENGARUH PENYAJIAN PESAN PUPUK AGRODYKE DAN PENGGUNAI{NVISUALISASI MELALUI VIDEO TERHADAP PENINGKATAN PENGETAHUAI{ PETAI{I

Ayub NI. Padanssran : ANALISIS PERTUMBUHAN DAN KEBUTUHAI{ INVESTASIOPTIMAL SEKTOR PERTANIAN DI SULAWESI TENGGARA

Husna, Robtatul Adau:tyah, Ls Ode Altmuddtn dan Fatsol Danu Tuheteru :

STATUS KEANEKARAGAMAN CENDAWAN MIKORIZA ARBUSKULA (CMA)PADA EMPAT TANAMAN LOKAL SULAWESI TENGGARA

DAFTAR ISI

Halaman

PENGARUH SUPLEMENTASI Bf,RBAGAI Sf,RAT KOMERSIL TERHADAPKADAR KOLESTEROL SERUM DAN DAGING PADA MENCIT(Mus masculus)Adawtyah, Ma'ruf Tafsln, Amlnuddln Parakkasi, Andi Murfi '85 * 89

RESPON TANAMAN KEDELAI (Glyictne max L Merr) TORIIADAP SISTEMPENGA,IRAN.A. Bahrun 90-97

TOLERANSI BEBERAPA VARIETAS KEDELAI TERHADAP CEKAMANALUMINIUM PADA STADIA BIBITMuhidln..... 98 - 106

Pf, NGARU H Pf, NG ERING BI]KUAN TERHADAP PERU BAHAN MORI'OLOG ISPERMATOZOA DOMBATaWir Saill, Mohamad Agus Setiodi, Srlhadi Agungpriyono, Mozes R.Toelihere danArlef Boedlono. .......... 107 _tt7TSOLASI DNA PLASMID DENGAN METODDE MINIPREP QIAPREP(ISOLATING BACTEARIA PLASMID BY MINIPREP QIAPREP)MahantmadTautihdanSyair ........ ll8-122PROSPEK PENGEMBANGAN AGRIBISNIS KARAMBA JARING APUNGIKAI{ KERAPU TIKUS (Cromilqta altlvelis) DI Kf,CAMATAN SOROPIAMukhtar 123 - 132

ANALISIS PROTDIN DAN ISOZIM PLANLET PISANG BARANGAN HASILINDUKSI FILTRATFOC DAN BDBSECARA IN-VITROGusna H.S, dan Abdul Rahman................... 133 - 137

PRODUKTIVITAS PEKERJA DAN STRATEGI KEBIJAKANPEMBANGUNAN SEKTOR PERTANIAN (STUDI PADA MASYARAKATPEDESAAN DI PROVINSI SULAWESI TENGGARA)L.M. Harafah .................. 138 - 148

DESKRIPSI DAN KLASIFIKASI PISANG LOKAL ASAL KABUPATENBUTON PROVINSI SULAWESI TENGGARAHamlrul Hadini .. .... ..... . ... 149 * 157

PENGARUH PENYAJIAN Pf,SAN PUPUK AGRODYKE DAN PENGGUNAANVISUALISASI MELALUI VIDEO TERHADAP PENINGKATANPENGETAHUAN PETANIIs kandar.......... 158- 166

ANALISIS PERTUMBUHAN DAN KEBUTUHAN INVE.STASI OPTIMALSEKTOR PERTANIAN DI SULAWESI TENGGARAAyub M. Padangaran ...........:.......... 167 - 172

STATUS CENDAWAN MIKORIZA ARBUSKULA (CMA) PADA EMPATTANAMAN LOKAL SULAWEST TENGGARAHusna, Robidul Adowiyah, La Ode Albnuddin dan Faisol Danu Tuhderu 173 - lg2

AGRIPLUS, Volume 16 Nomor: 02 Mei 2006, ISSN 085+0U8

PENGARUH PENGERINGBEKUAI{ TERHADAPPERUBAHAN MORFOLOGI SPERMATOZOA DOMBA

Oleh: Takdir Saitt , Mohamad Agus Setiadi2, Srihadi Agungpriyonot,Mozes RToetiherd, dan Arief Boedionor

ABSTRACT

Freeze drying is a technology of choise in cell preservation and have been widely airplied in manytypes of cell include spermatozoa. So far, the successful of freeze drying in spermatozoa is limited only inrodents such as mouse and rabbit. Therefore, the technology should be applied in farm animal such as sheepto prove whether the successful would be obtained. Moreover, the information related to membrane plasm andacrosome status and morphological changes on ram spermatozoa after freeze drying and storage was verypoor. The staining procedure was applied to prove the membrane plasm and acrosome changes onspermatozoa. The results revealed that the membrane plasm and acrosome of freeze-dried ram spermatozoawas disrupted and most of sperrnatozoa have morphological abnormally in its stail. Whereas during storage inrefreegerator (4-5"C) up 9 months, both membrane plasm and acrosome and morphological changes onspermatozga tend to be stable.

Key words : freeze drying, spermatozoa, membrane plasm, acrosome

PENDAHULUAI\

Penelitian tentang metode pengawetanspermatozoa dengan cara pengeringbekuantelah dilakukan pada beberapa pusat penelitianbaik di Amerika (Ward et al. 2003\. Jepang(Hoshi et al. 1994) maupun Australia(Pangestu et al. 2001). Metode ini pada awal-nya dikembangkan untuk menjawab per-masalatran dalam mengamankan sumbergamet jantan hewan percobaan (mencit) hasilrekayasa. Beberapa laboratorium yangmenggunakan hewan mencit sebagai uji cobamanipulasi genetik memilih untuk mengaman-kan sumber gamet jantan dalam kemasanspermatozoa hasil pengeringbekuan daripadamemelihara pejantan mencit untuk mendapat-kan sumber gamet (Kaneko et aI.2003; Wardet al. 2003). Hal ini dapat dipahami karenapemeliharaan hewan jantan memerlukanwakiu dan biaya. Demikian halnya denganpenyimpanan spermatozoa dalam kemasanbeku di dalam nitrogen cair membutuhkanperalatan dan biaya tambahan serta suplainitrogen yang terus menerus selamapenyimpanan. Sedangkan hasil pengawetanspermatozoa yang menggunakan metodepengeringbekuan dapat disimpan pada lemaries (suhu 3-5 "C) atau suhu kamar sehingga

dapat ditransportasikan dari satu tempat ketempat lain dengan mudah.

Pada proses pengeringbekuan, sper-matozoa terlebih dahulu dipapar pada nitrogencair dengan suhu -l96oC untuk mendapatkansediaan spermatozoa dalam keadaan beku.Selanjutnya dilakukan sublimasi untuk meng-uapkan fase air yang telah membeku sehinggapada akhimya akan didapatkan sediaan sper-matozoa dalam bentuk kering. Kedua proses

ini berpotensi dapat mengubah morfologispermatozoa bahkan mungkin dapat meng-hentikan fungsi biologis spermatozoa tersebut.Weitze dan Petzoldt (1992) melaporkanbahwa pendinginan dan pembekuan (Bag e/al. 2002) dapat menyebabkan kerusakan pada

membran plasma dan membran akrosomspermatozoa. Kerusakan membran ini padagilirannya akan menurunkan viabilitas sper-matozoa bahkan dapat menyebabkan kematianbagi spermatozoa. Namun demikian, denganmenggunakan metode intracytoplasmic sperminjection (lCSl), spennatozoa yang telahmengalami kerusakan membran plasma danakrosom masih mernpunyai kemampuan untukmembuahi seltelur.

Sejauh ini pengawetan spermatozoadengan cara pengeringbekuan masih terbataspada hewan laboratorium seperti mencit

t) Staf Pengaiar Juruun Produksi Temak Fafulas Pertanian Llniversitas Haluoleo, Kendan.

') Deparlenen Klinik, Reprofului dan Patologi FKH-IPB. Kanpus Darmaga, Bogor.t1 Departenen Arutomi, Fisiologi dan Fotiakologi FKHJPB. KonEus Damraga, Bogor

107

108

(Wakayama et al. 1998) dan kelinci (Liu et at.2004). Pada hewan ternak, upaya pengawetanspermatozoa dengan cara pengeringbekuantelah dilakukan oleh Kwon et al. (2004) padababi dan Keskintepe et al. (2002) pada sapi,sedangkan pada ternak domba belum pemahdilaporkan. Selain itu, informasi tentangpengaruh pengeringbekuan terhadap perubah-an morfologi spermatozoa sangat dibutuhkanuntuk mengetahui kondisi membran plasmadan akrosom spermatozoa hasil pengering-bekuan. Oleh karena itu pada penelitian iniakan dilakukan evaluasi terhadap perubahanmorfologi spermatozoa domba setelah prosespengeringbekuan dan penyimpanan di dalamlemari es (3-5"C) dengan menggunakanmetode pewarnaan. Evaluasi terhadap kualitassemen dan spermatozoa segar juga akandilakukan sebagai pembanding spermatozoahasil pengeringbekuan.

BAHAN DAN METODE

Penelitian ini dilakukan diLaboratorium Embriologi dan LaboratoriumRiset Anatomi serta Unit RehabilitasiReproduksi dan Unit Produksi Bahan BiologisFakultas Kedokteran Flewan. lnstitut PertanianBogor sejak bulan Juni 2004 sampai denganbulan Maret 2005.

Bahan yang digunakan adalah sernendomba yang diperoleh secara berkala dariseekor domba jantan lokal dengan kisaranumur tiga sampai empat tahun dan bobotbadan + 45 kg. Beberapa jenis medium yangdigunakan pada penelitian ini adalah mediumNaCl 0.032M dengan tekanan osmotik 53-63mOsmol/l untuk pengamatan status membranplasma spermatozo4 medium formal salinuntuk pengamatan keutuhan tudung akrosomspermatozoa dan medium phosphate bufersaline (PBS) pH 7.2 untuk pencuci dan pelarutspermatozoa. Selain itu juga digunakan larutaneosin B 2% (Sigma, E8017) untuk peng-amatan persentase spermatozoa hidup.

Di dalam proses pengeringbekuandigunakan tiga jenis medium, yaitu mediumethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)yang mengandung EDTA 50 mM, NaCl 50

mM dan penyangga Tris-HCl 10 mM, mediumethylene glycol-bis [beta-aminoethyl etherJ-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) yangmengandung EGTA 50 mM, NaCl 50 mM danpenyangga Tris-HCl l0 mM, dan mediumphosphate bufer saline (PBS) pH7.2 masing-masing sebagai medium pelarut spermatozoaserta nifogen cair unfuk membekukanspermatozoa sebelum dikeringkan.

Peralatan yang digunakan padapenelitian ini adalatr seperangkat alat vaginabuatan yang digunakan untuk penampungansemen. Sedangkan untuk membuat danmenyimpan medium digunakan alat timbang,mikropipet gelas ukur, gelas erlemeyer danbotol kecil dalam berbagai ukuran. Gelasobyek dan gelas penutup digunakan untukmembuat preparat spermatozoa bagi berbagaikeperluan pengamatan yang menggunakanmikroskop. Haemocytometer dan sentrifusmasing-masing digunakan sebagai alat untukmenghitung konsentrasi spermatozoa danmencuci silermatozoa- Di dalam prosespembuatan spermatozoa hasil pengering-bekuan dengan menggunakan metodepengeringbekuan digunakan tube berpenutupulir 1.5 ml (Cryo-tube, Greiner) untukmenyimpan spermatozoa serta mesinpengeringbekuan (Flery-dry) dan lemari esmasing-masing untuk membuat sediaanspermatozoa hasil pengeringbekuan dan untukmenyimpan spermatozoa hasil pengering-bekuan. Selain itu juga digunakan kertasindikator pH, water bath, magnetic stirer,pencatat waktu dan lain-lain.

Koleksi dan evaluasi semen dan sper-matozoa segar dilakukan dengan cara menam-pung semen seekor domba jantan lokal denganmenggunakan vagina buatan. Selanjutnyadilakukan evaluasi terhadap semen dan sper-matozoa baik secara makroskopis (volume,warna, konsistensi dan derajat keasamansemen) maupun mikroskopis (gerakan massqpersentase motilitas, konsentrasi, persentasemembran plasma ututr" penentase hidup danpersentase tudung akrosom utuh sertaabnormal itas spermatozoa).

Volume semen diketahui dengan caramembaca skala pada tabung penampung

AGRIPLUS, Yolume 16 Nomor : 02 Mei 2006, ISSN 085+0128

semen. Demikian halnya dengan wa.rna semendapat langsung dilihat pada tabungpenampung semen tersebut segera setelahsemen ditampung. Sedangkan konsistensisemen diketahui dengan cara mengirmati lajualiran semen pada dinding tabung. Aliransemen yang cepat digolongkan ke dalamkonsistensi semen yang encer sedangkanaliran semen yang lambat digolongkan kedalam konsistensi semen yang kental. Derajatkeasaman (pH) semen diketahui dengan carameneteskan semen di atas kertas indikator pHberskala 6.8 sampai 8.0. Perubahan warnapada kertas pH tenebut disesuaikan denganstandar perubahan wama yang menunjukkannilai pH pada tabel.

Gerakan massa spermatozoa diketahuidengan cara membuat tetesan semen padagelas obyek kemudian diamati di bawahmikroskop dengan pembesaran lensa obyektif10X. Sedangkan persentase motilitas sper-matozoa ditentukan melalui pengamatanspermatozoa di bawah mikroskop denganpembesaran lensa obyektif 40X pada enamlapang pandang. Penilaian yang diberikanmulai nol persen (tidak ada spermatozoa yangbergerak ke depan) sampai 100 persen (semuaspermatozoa bergerak ke depan).

Perhitungan'konsentrasi spermatozoadilakukan secara bersamaan dengan penentuankeutuhan membran plasma spermatozoa. Halini dimungkinkan karena spermatozoadiencerkan dengan larutan yang dipakai untukHypo-Osmotic Swelling lesl (HOS-Test) yaituNaCl 0.032M dan tekanan osmotik 53-63mOsmol fr. Metode ini merupakan modifikasimetode yang dikembangkan oleh FakultasKedokteran Universitas Indonesia yangberasal dari Correa dan Zavos (1994). Sampelsemen diencerkan 300 kali menggunakanlarutan HOS dan dibiarkan selama lima menitpada suhu kamar. Untuk keperluanpengamatan, diteteskan 10 pl sampel semenpada gelas haemocytometer dan evaluasidilakukan di bawah mikroskop denganpembesaran lensa obyektif l0X. Perhitungandilakukan pada lima kotak teracak terhadapspermatozoa yang mempunyai ekor melingkar(membran plasma utuh) maupun yang

109

mempunyai ekor lurus (membran plasma tidakutuh). Jumlah total kedua jenis spermatozoayang dihitung pada lima kotak teracak tersebut(Sh) merupakan faktor yang dipergunakandalam mengestimasi konsentrasi spermatozoayang menggunakan rumus (Hafez 1987): KS= Sh x FM x P. dimana: KS.= konsentrasispermatozoa; Sh = jumlah spermatozoa yangterhitung pada haemocytometer; FM = faktormultiplikasi dan P = pengenceran

Penentuan spermatozoa hidup dilaku-kan dengan menggunakan metode pewarn&meosin. Sebanyak l0 pl sampel semen dan l0 pleosin B 2%o dicampur di atas gelas obyekkemudian dibuat preparat ulas dan dibiarkanmengering sebelum dilakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan pembesaran lensaobyektif 20X. Spermarozoa yang dikategori-kan hidup adalah spermatozoa yang tidakmenyerap zat wama sehingga pada bagiankepala spermatozoa tidak terwarnai (putih),sedangkan spermatozoa yang dikategorikanmati adalah spermatozoa yang menyerap zatwarna sehingga pada bagian kepalanya akanberwarna merah. Persentase hidup sper-matozoa ditentukan berdasarkan.perbandin ganantara jumlah spermatozoa hidup denganjumlah total spermatozoa. Jumlah totalspermatozoa yang yang dihitung adalah 200spermatozoa.

Keutuhan tudung akrosom sper-matozoa dievaluasi menggunakan larutanformal saline. Sebanyak l0 pl sampel semendirnasukkan ke dalam I ml larutan formalsaline dan diinkubasi pada suhu kamar selamasatu jam. Selanjutnya dilakukan pengamatansebanyak 200 spermatozoa di bawah micros-kop dengan pembesaran lensa obyektif 20X.Spermatozoa yang memperlihatkan I ingkarantudung akrosom dikategorikan sebagai sper-matozoa dengan tudung akrosom utuh,sebaliknya spermatozoa yang tidak memper-lihatkan lingkaran tudung akrosom di-kategorikan sebagai spermatozoa dengantudung akrosom yang tidak utuh. Sedangkanpengamatan abnormal itas spermatozoa dilaku-kan terhadap spermatozoa yang mempunyaikelainan baik pada kepala maupun ekorspermatozo4 yang meliputi kepala besar atau

AGRIPLUS, Volume 16 Nomor : 02 Mei 2006, ISSN 0851-0125

r r0

kecil, berkepala dua atau berekor dua dankondisi abnormal yang lain. Pengamatan dibawah mikroskop dengan pembesaran lensaobyektif 40X dilakukan pada 200spermatozoa.

Sediaan spermatozoa dalam bentukkering diperoleh melalui penerapan metodepengeringbekuan yang diadopsi dari Kanekoet al. (2003) dengan sedikit modifikasi. Secarajelas dapat diuraikan sebagai berikut.Sejumlah 100 pl (2 x lOe spermatozoa ml-r)semen domba dimasukkan ke dalam tube 1.5ml kemudian ditambahkan medium pelarutEDTA, EGTA atau PBS dengan pH 8.0sebanyak 1.3 ml. Selanjutnya campuran sementersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama l0menit. Fraksi spermatozoa yang berada dibagian atas tube diambil secara perlahan-lahandan dipindahkan masing-masing sebanyak 100pl ke dalam tube berpenutup ulir 1.5 ml (Cryo-tube, Greiner). Tube tersebut selanjutnyadimasukkan ke dalam nitrogen cair hinggaproses pengeringbckuan dimulai. Prosespengeringbekuan diawali dengan pemasangantube ke alat pengeringbekuan, selanjutnyamesin dijalankan dan proses pengeringbekuanberjalan hingga terbentuk tepung spermatozoadi dalam tube tersebut. Tube selanjutnyadilepas dari mesin pengeringbekuan, ditutuprapat" divakum dengan menggunakan syringel0 ml dan disimpan di dalam lemari es (3-5"C)hingga digunakan.

Evaluasi terhadap perubahan mor-fologi spermatozoa dilakukan secara berkalayaitu, pada bulan ketiga, keenam dankesembilan setelah pengeringbekuan danpenyimpanan di dalam lemari es (3-5"C).Hasil evaluasi digolongkan ke dalam tigakategori, yaitu spermatozoa utuh, spermatozoadengan ekor abnormal dan spermatozoadengan ekor putus (terpisah antara kepala danekor). Hasil perhitungan ini kemudiandibandingkan dengan morfologi spermatozoasegar berdasarkan ketiga kategori di atas.Jumlah spermatozoa yang diamati pada setiapperlakuan adalah 300 spermatozoa.

Rancangan Percobaan dan Analisis DataPenelitian ini dirancang dengan

menggunakan Rancangan Acak Lengkap(RAL) pola faktorial 3 x 3 dengan tigaulangan. Faktor pertama adalah jenis mediumpelarut spermatozoa yang terdiri atas mediumEDTA, EGTA dan PBS. Sedangkan faktorkedua adalah waktu pengeringbekuanspermatozoa di dalam mesin pengeringbekuanyang terdiri atas satu, dua dan tiga jam.Dengan demikian akan terdapat sembilankombinasi perlakuan, yaitu medium EDTAdengan lama pengeringbekuan masing-masingsatu jam (EDTA-I), dua jam (EDTA-2) dantiga jam (EDTA-3) dan medium EGTAdengan lama pengeringbekuan masing-masingsatu jam (EGTA-I), dua jam @GTA-2) dantiga jam (EGTA-3) serta medium PBS denganlama pengeringbekuan masing-masing satujam @BS-1), dua jam (PBS-2) dan tiga jam(PBS-3).

Datz perubahan morfologi sper-matozoa hasil pengeringbekuan dianalisismenggunakan program SPSS versi 13 dengantaraf pengujian 5%. Hasil evaluasi semensegar disajikan dalam bentuk rata-rata danstandar deviasi.

HASIL DAI\ PEMBAHASAI\

Evaluasi Semen SegarEvaluasi semen segar dilakukan untuk

mengetahui kualitas semen dan spermatozoadomba pada awal penelitian sebelum diproseslebih lanjut. Evaluasi ini dibagi dalam duakategori, yaitu evaluasi secara makroskopisdengan perhatian utama pada semen yangmeliputi pengukuran volume, konsistensi,warna serta pH semen dan evaluasi secaramikroskopis dengan perhatian utama padaindividu dan massa spermatozoa yangmeliputi perhitungan konsentrasi, gerakanmass4 persentase motilitas, persentase hidup,persentase membran plasma utuh danpersentase tudung akrosom utuh sertaabnormalitas spermatozoa. Hasil evaluasisemen dan spermatozoa segar domba yangdigunakan pada penelitian ini dapat dilihatpadaTabel l.

AGRIPLUS, Volume 16 Nomor : 02 Mei 2006, ISSN 0854-0128

Tabel l. Hasil evaluasipenelitian

Persentase membran plasma utuh (%) 83.33+0.94Persentase tudung akrosom utuh (%) 83.83+1.61Persentase hidup (%o)

Abnormalitas (%)85.26+1.166.33*0.82

Volume SemenVolume semen yang dihasilkan seekor

pejantan domba dalam satu ejakulasi cukupbervariasi dan sangat tergantung dari umur,berat, status kesehatan dan reproduksi,kualitas makanan, frekuensi penampungan danbangsa domba (Toelihere 1993). Domba yangdigunakan pada penelitian ini adalah dombajantan lokal dengan kisaran umur tiga sampaiempat tahun (berdasarkan pergantian gigi) danbobot badan +45 kg. Nilai rata-rata volumesemen yang diperoleh pada domba tersebutadalah 0.57+0.t9 ml. Hasil ini lebih rendahdari nilai rata-rata volume semen domba lokalBogor (Toelihere 1993), yaitu 0.8-1.2 ml,tetapi lebih tinggi dibanding volume semendomba ekor gemuk di Jawa Timur 0.3-0.4 ml(Pamungkas et al. 1996).

Konsistensi dan Warna Semen sertaKonsentrasi Spermatozoa

Konsistensi dan warna semen umum-nya dijadikan indikator untuk memprediksikonsentrasi spermatozoa yang terdapat didalam semen secara cepat. Pada keadaan yangnormal dapat diasumsikan bahwa semen yangkental akan mengandung spermatozoa dengankonsentrasi yang tinggi. Semen domba yangdigunakan pada penelitian ini mempunyaikonsistensi yang kental dan berwama putihsampai krem serta konsentrasi 3052.0G113.18juta ml-r. Inounu et al. (2001) melaporkanbahwa warna semen domba garut berkisarantara bening sampai krem dengan konsistensiencer hingga kental dan konsentrasi 950-4080

llt

juta ml-r. Sedangkan Feradis (1999) menya-takan bahwa semen domba st.Croix rata-rataberwarna krem dengan konsistensi yang kentaldan konsentrasi 3785 juta ml-r.

Derajat Keasaman (ptl) SemenDerajat keasaman (pH) sernen me-

rupakan salah salu laktor pernbatas kelang-sungan hidup spernratozoa di dalam semen.Perubahan pH ke arah yang lebih asarn (angkalebih kecil dari 7) akibar penimbunan asamlaktat hasil metabolisme anaerob dapatmenurunkan tingkat kelangsungan hidupspermatozoa (Toelihere 1993). Derajatkeasaman semen domba yang diperoleh padapenelitian ini masih berkisar pada pH netral,yaitu pH 7.05+0.20. Toelihere ( 1993)melaporkan bahwa p[{ semen domba lokalBogor berkisar 6.2-1.0, sedangkan l{izal(2005) melaporkan bahwa pH semen dombaGarut berkisar antara 6.8-7.2.

Gerakan Massa dan Persentase MotilitasSperrnatozoa

Spermatozoa bergerak dalamkelompok (massa) yang rnenyerupai awandengan pola yang be rgelombang sehinggaakan terlihat perubahan gelombang tebal dantipis. Menurut Toelihere ( 1993), penilaianpergerakan massa spermatozoa dibagi kedalam beberapa kategori, yairu sangat baik(+#), baik (++;, cukup (+) dan jelek [N,necrospermia atau O, oligospermia). Cerakanm€lssa spermatozoa yang dipe roleh padapenelitian ini berkisar anrara baik (++) dansangat baik (+++). Hal ini menunjukkanbahwa kecepatan pergerakan massa sper-matozoa dapat dijadikan indikator untukmemprediksi motilitas individu spermatozoa.Sebagai pembanding dapat dikemukakanoahwa gerakan massa spermatozoa dombagarut rata-rata 2.89 (berkisar antara Z dan 3pada skala l-3) (Rizal 2005), sedangkanInounu et al'. (2001) melaporkan bahwa nilairuta-rab gerakan massa spermatozoa dombaGarut adalah 2.81 (berkisar antara I dan 4pada skala l -4).

semen segar domba

Variabel NilaiVolume (ml ejakulaf') 0.67*0.19

Putih - kremKental7.05+0.203052.00+r 3.18++(+)77.33+2.58

WarnaKonsistensipHKonsentrasi (iuta ml-')Gerakan massaPersentase motilitas (%)

AGRIPLUS, Volume 16 Nomor : 02 Mei 2006, ISSN 0854-0128

112

Persentase motilitas spermatozoa me-

rupakan salah satu indikator utama dalamproses evaluasi spermatozoa. Variabel inisangat erat hubungannya dengan daya fer-til i sasi spermatozoa. N i lai rata-rata persentase

motilitas spermatozoa domba yang digunakanpada penelitian ini adalah 77.33*2.58o/o. Nilaiini masih pada kisaran persentase motilitassperrnatozoa yang layak digunakan untukfertilisasi, baik secara in vivo maupun in vitro.Wuwuh (1990) melaporkan bahwa persentase

motilitas spermatozoa domba Prianganberkisar 66-80% dan domba lokal Bogor rata-rataTloh (Toelihere 1993). Sedangkan Rizal(2005) melaporkan bahwa persentase motilitasdomba Garut rata-rata 7 7 .07 o/o.

Keutuhan Membran Plasma dan AkrosomKeutuhan membran plasma bagi sper-

matozoa mutlak diperlukan untuk memenuhifungsinya sebagai pelindung organel di dalamsel dan penyaring bagi pertukaran zatintraseluler dan ekstraseluler. Demikian hal-nya dengan kondisi tudung akrosom yangharus tetap utuh untuk menjaga keamananenzim-enzim fertilisasi yang terdapat di dalamvesikel akrosom. Untuk mengamati keutuhanmembran plasma spermatozoa digunakanlarutan NaCl 0.032M dengan tekanan osmotik53-63 mOsmol l'r. Tekanan osmotik sel

mamalia termasuk sel spermatozoa rata-ratA300 mOsmol l'r, sehingga spermatozoa denganmembran plasma utuh yang dipapar pada

cairan hipoosmotik tersebut akan mengalamipenggembungan (sv,ollen) akibat difusi airdari luar ke dalam sel dan ekor spermatozoaakan melingkar (Cambar la). Hal ini tidakmuncul pada spermatozoa yang membranplasmanya tidak utuh lagi (Gambar lb).

Nilai rata-rata keutuhan membranplasma spermatozoa semen segar yang diper-oleh pada penelitian ini adalah 83.33+0.9404,sedangkan nilai rata-rata keutuhan tudungakrosomnya adalah 83.83+1.61%. Kedua nilaitersebut masih pada kisaran nilai normal untukvariabel yang dimaksud jika dihubungkandengan kemampuan fertilisasi seperti yang

dikemukakan oleh Revell dan Mrode (1994)

bahwa nilai persentase keutuhan membran

Gambar l. Spermatozoa dengan membran plasmautuh (ekor melingkar, a) danspermatozoa dengan membran plasmatidak utuh (ekor lurus, b).

Persentase Spermatozoa Hidup danAbnormalitas Spermatozoa.

Pemeriksaan fungsi membran untukmenentukan penentase hidup spermatozoajuga dapat dilakukan dengan menggunakanpewarna eosin B yang dicampur dengan ionsodium. Spermatozoa yang hidup masih mem-punyai sistem membran yang berfungsi ter-masuk fungsi pengaturan ion terutama ionsodium. Hal ini akan menyebabkan penahanandifusi medium pewarna (eosin B) yang me-ngandung ion sodium oleh sistem membranpada saat pemaparan spermatozoa ke dalammedium pewarna. Akibatnya spermatozoatidak terwamai oleh pewarna eosin B (Gambar2a). Sebaliknya pada spermatozoa mati, sistemmembrannya telah rusak sehingga denganmudah dapat dilewati eosin B dan sper-matozoa akan berwarna merah (Gambar 2b).

Abnormalitas spermatozoa merupakansalah satu faktor yang menjadi pertimbangandalam menilai kelayakan semen yang di-gunakan pada inseminasi buatan. Toelihere(1993) mengatakan bahwa semen domba yangbaik apabila mempunyai persentase abnor-malitas kurang da,"i l4o/o. Sedangkan Hafezdan Hafez (2000) menetapkan nilai abnor-malitas pada kisaran 5-20%. Nilai rata-ratapersentase abnormalitas spermatozoa yang di-peroleh pada penelitian ini sebesar 6.33+0.82.Nilai ini masih berada pada kisaran nilai

AGRIPLIJS, Volume 16 Nomot : 02 Mei 2(M6, ISSN 0854-0U8

'17

Gambar 3. Spermatozoa utuh (a), spermatozoa {engan ekor abnormal (b) spermatozoa dengan ekor putus (c)

I 13

Evaluasi Perubahan MorfologiSpermatozoa setelah Pengeringbekuan.

Evaluasi perubahan morfologi sper-matozoa dilakukan secara bertahap, yaitu padabulan ketig4 keenam dan kesembilan setelahF,roses pengeri n gbek uan. Perubahan morfo I o giyang berhubungan dengan keutuhan sper-matezoa dibagi tiga kategorf, yaitu sper-matozoa utuh, spermatozoa dengan ekorabnormal dan spermatozoa dengan ekor putus(terpisah antara kepala dan ekor) (Gambar3).

El0pn

penyimpanan setelah pengeringbekuan dapatdilihat berturut-turut pada Tabel 2, 3 dan 4.

abnormalitas spermatozoa yang memenuhisyarat untuk diproses lebih lanjut.

Spermatozoa hidup dengan kepalaberwarna putih (a) dan spermatozoamati dengan kepala berwarna merah (b)

t1

O

., ea--

lOpn

Hasil evaluasi terhadap perubahanmorfologi spermatozoa berdasarkan lama

Gambar2.

AGRIPLUS, Yolume 16 Nomor : 02 Mei 2006, ISSN 085,t-012g

114

Tabel 2. Perubahan morfologi spermatozoa hasil pengeringbekuan setelah disimpan 3 bulan padasuhu 3-5"C

perlakuan perubahan morfologi (%)tuTr sr raNudrr ur (o/o)

EDTA-2EDTA-3EGTA-IE,GTA-2ECTA-3PBS-IPBS-2PBS-3

2t(1)24(8)r 8(6)24(8)27(e)2t(7)24(8)

249(83)*240(80)b"261(87)"261(87)"258(96)""261(87)^252(84)*249(83

30(10)*36(1z)',2tQ)b'1s(s)MI 5(5)bd18(6)b"

24$)*d

300(r00)300(100)300(i00)300(100)300(100)300(100)300(100)

Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf uji 5%

Tabel 3 . Perubahan morfologi spermatozoa hasil pengeringbekuan setelah disimpan 6 bulan padasuhu 3-5oC

perlakuan -. . perubahan morfologi (%)1r+.,r. Er-^- ^L-^---r ni TOtal

kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyata pada taraf uji 5%

Ljtrh l (%)

EEDTA-2 I 8(6r" 243(8 I )b. 39( 1 3f" 300i I 00)EDTA-3 18(6)"" 246(82)* 36(r2)*d 300i100)EcrA- I 18(6)"" 258(86r" 24(8)bd" 300i100)EGTA-2 24(8)^" 258(36r" l8(6)b" :ooirooiEGTA-3 24(8)^." 261(87)^ ls(s)b 300(100ipBS-l 1sf ):: 255(8s)* roirb)"* :ooiroojpBS-2 I s(5)': 243(81)b" 42(14)' gooirooi

Nilai rata-rata persentase tertinggispermatozoa hasil pengeringbekuan yangmasih utuh setelah disimpan tiga bulan padasuhu 3-5oC diperoleh pada perlakuan EDTA-1(10%) dan EGTA-3 (9%) tetapi tidak berbedanyata (P>0.05) dengan perlakuan yang lain.Pada penyimpanan enam bulan, nilai rata-ratapersentase tertinggi spermatozoa hasilpengeringbekuan yang utuh diperoleh padaperlakuan EDTA-I (10%) yang berbedanyata(P<0.05) dengan perlakuan PBS-l (5%) danPBS-2 (5%) tetapi ridak berbeda nyata(P>0.05) dengan perlakuan EDTA-2 (6%),

EDTA-3 (6%), EGTA-1 (6%), EGTA-2 (8%),EGTA-3 (8%) dan PBS-3 (6%). Demikianhalnya dengan penyimpanan 9 bulan, nilairata-rata persentase tertinggi spermatozoahasil pengeringbekuan yang utuh diperolehpada perlakuan EDTA-I (9o/o) dan EGTA-3(8%) yang berbeda nyata (P<0.05) denganperlakuan PtsS-l (4%),PBS-2 (4%) dan pBS-3 (4%) tetapi tidak berbeda nyata (F>0.05)dengan perlakuan EDTA-2 (5%), EDTA-3(5%), EGTA-I (60/o) danEGTA-Z (7%).

Hurufyang berbeda pada

AGRIPLUS, Volume 16 Nomot : 02 Mei2006, ISSN0S54-0129

Untuk kategori spermatozoa hasilpengeringbekuan dengan ekor abnormal sete-lah disimpan tiga bulan pada suhu 3-5oC, nilairata-rata persentase terendah diperoleh padaperlakuan EDTA-3 (80%) yang berbeda nyata(P<0.05) dengan perlakuan EGTA-I (87o/o),

EGTA-2 (87o/o) dan PBS-I (E7o/o), tetapi tidakberbeda nyata (F0.05) dengan perlakuanEDTA-I (8s%), EDTA-2 (83%), EGTA-3(86%), PBS-2 (84%) dan PBS-3 (83%). Padapenyimpanan 6 bulan, rata-rata persentaseterendah spermatozoa hasil pengeringbekuandengan ekor abnormal diperoleh padaperlakuan EDTA-2 (81%) dan perlakuan PBS-

ll5

2 (81%) yang berbeda nyata (P<0.05) denganperlakuan ECTA-3 (87%), retapi tidakberbeda nyata (P0.05) dengan perlakuanyang lain. Sedangkan pada penyimpanan 9bulan, rata-rata persentase terendahspermatozoa hasil pengeringbekuan denganekor abnormal diperoleh pada perlakuanEDTA-I (81%), EDTA-2 (81%) dan PBS-2(81%) yang berbeda nyata (P<0.05) denganperlakuan EGTA-2, tetapi tidak berbeda nyata(P>0.05) dengan perlakuan EDTA-3 (82%),EG'I'A-1 (85%), EGTA-3 (86%), PBS-1(84%) dan PBS-3 (82%).

Tabel 4. Perubahan morfologi spermatozoa hasil pengeringbekuan setelah disimpan 9 bulan padasuhu 3-5oC

PerlakuanPerubahan morfologi (%)

Total(%)Utuh Ekor abnormal Ekor outus I vlsr \ / u'l

;Z;\E-EDTA.lEDTA-2EDTA-3EGTA-1EGTA-2EGTA-3PBS-IPBS-2PBS.3

27(9)"I 5(5)"'I 5(5)""1g(6)o'2t(7)*24(8)'l2(4)b"n(4)b"t2(4)b"

243(81)b"243(81)b"246(82)*255(85)""261(87)'259(96)""252(84)*243(81)b"246(92)^"

30(10)'"42(t4)*39( I 3)*27Q)bl8(6)bdI 8(6)M36( I 2)*45( I 5)"42,L4]}^"

300( r 00)300(100)300( r 00)300( I 00)300(100)300( r 00)300( r 00)300( I o0)300( l 00)

Total 156(5.8) 2247(83.2) 297(n) 27000 00)

Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang nyara pada taraf u.ii 5%

Sedangkan untuk kategorispermatozoa hasil pengeringbekuan denganekor putus setelah disimpan selama tiga bulanpada suhu 3-5oC, nilai rata-rata persentaseterendah diperoleh pada perlakuan EGTA-2(5%), EGTA-3 (5%) dan EDTA- 1 (5%) yangberbeda nyata (P<0.05%) dengan perlakuanEDTA-2 (10%) dan EDTA-3 (r2%). Padapenyimpanan selama 6 bulan nilai rata-ratapersentase terendah diperoleh pada perlakuanEGTA-3 (5o/o) yang berbeda nyata denganperlakuan EDTA-2 (13%), EDTA-3 (12%\PBS-I (10%), PBS-2 (14%) dan PBS-3 (t2%).Pada penyimpanan sembilan bulan, nilai rata-rata persentase terendah spermatozoa hasilpengeringbekuan dengan ekor putus diperoleh

pada perlakuan EGTA-? (6%) dan IIGTA-3(6%o) yang berbeda nyata (P<0.05) dengansemua perlakuan kecuali perlakuan LGTA-l(9%). Bahkan nilai terbesar didapatkan padaperlakuan PBS-2 (15%) yang berbeda nyata(P<0.05) dengan semua perlakuan ECT'A baiksatu, dua maupun tiga jam.

AGRIPLUS, Yolume 16 Nomot : 02 Mei 2006, ISSN 0854-0128

lr6

:560s50

r40l0

20

t0

0

tltuh Ekorabnornnl Elorputus

Gambar 4. Persentase perubahan morfologisperrnatozoa hasil pengering-bekuan pada semua perlakuansetelah disimpan selama 3, 6 dan9 bulan pada suhu 3-5"C

Berdasarkan kategori yang ditetapkandapat diketahui bahwa nilai rata-ratapersentase spermatozoa hasil pengeringbekuandengan ekor abnormal pada semua perlakuansangat mendominasi baik pada masapenyimpanan tiga bulan (84.7%), enam bulan(83.6%) maupun sembilan bulan (83.2%)dibandingkan spermatozoa hasil pengering-bekuan dengan ekor putus masing-masing7A% (tiga bulan), 9.8% (enam bulan) danl1% (sembilan bulan) serta spermatozoa hasilpengeringbekuan yang utuh 7.9o/o (tiga bulan),6.7% (enam bulan) dan 5.8% (sembilanbulan). Hasil ini berbeda nyata (P<0.05)dengan morfologi spermatozoa segar dengannilai rata-rata persentase spermatozoa utuhyang mendominasi (95%) diikuti spermatozoadengan ekor abnormal @%) dan spermatozoadengan ekor putus ( I %) (Gambar 4).

Hal ini menunjukkan bahwa selamaproses pengeringbekuan baik pada tahappembekuan di dalam nitrogen cair maupunpada tahap sublimasi di dalam mesinpengeringbekuan terjadi perubahan kondisiekstrim yang menyebabkan bagian ekorspermatozoa menjadi rapuh sehingga mudahterpotong atau berubah bentuk menjadiabnormal. Kaneko et al. (2003) menyatakanbahwa proses pengeringbekuan akan merusak

komponen struktural spermatozoa. Selain itujuga terjadi pemisahan kepala dan ekorspermatozoa. Namun demikian, beberapapenelitian menunjukkan bahwa kondisi ekorspermatozoa dan membran plasma yang utuhtidak diperlukan pada metode fertilisasi ICSI(Ward et al. 2003: Said er a/. 2003). Ekorspermatozoa yang utuh hanya dibutuhkanpada metode fertilisasi in vitro konvensionaluntuk membanfu pergerakan spermatozoamelakukan fertilisasi, sedangkan membranplasma dan akrosom spermatozoa dibutuhkanuntuk melindungi enzim-enzim fertilisasisebelum digunakan.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian dapatdisimpulkan bahwa: (1) Spermatozoa hasilpengeringbekuan mengalami kerusakanmembran plasma dan akrosom yang dibukti-kan melalui teknik pewarnaan dan bagian ekorspermatozoa sebagian besar mengalamiperubahan setelah pengeringbekuan dan (2)Perubahan morfologi spermatozoa banyakterjadi pada saat pengeringbekuan, sedangkanpada saat penyimpanan pada lemari es (3-5"C)morfologi spermatozoa cenderung stabil.

DAFTAR PUSTAKA

Bag S, Joshi A, Naqvi SMK, Rawat PS, Mittal JP.2002. Effect of freezing temperature, atwhich straw were plunged into liquidnitrogen, on the post-thaw motility andacrosomal status of ram spermatozoa.Anim Reprod Sci 72:17 5-183.

Correa JR, Zavos PM. 1994. The hypoosmoticswelling test: Its employment as an assayto evaluate the functional integrity of thefrozen-thawed bovine sperm membrane.Theriogenologt 42:35 l-360.

Feradis. 1999. Penggunaan Antioksidan dalamPengencer Semen Beku dan MetodeSinkronisasi Estrus pada ProgramInseminasi Buatan Domba St. Croix.Disertasi. Bogor: Program Pascasarjana,Institut Pertanian Bogor.

AGRIPLUS, Volume 16 Nomor : 02 Mei 2006, ISSN 0854-0128

Hafez ESE. 1987. Reproduction in Farm Animals.5th edition. Lea and Febiger, Philadelphia.

Hafez ESE, Hafez B. 2000. Reproduction in FarmAnimals. 76 edition. Baltimore: LippincottWilliams & Wilkins.

Hoshi K, Yanagida K, Katayose H, Yazawa H.1994. Pronuclear formation and cleavageof mammalian eggs after microsurgicalinjection of freeze-dried sperm nuclei.zygote 2:237-242.

Inounu I, Hidajati N, Jarmani SN, Priyanto D,Hastono SB, Subandriyo. 2001. Pengaruhinteraksi genetik dan lingkungan terhadapproduksi domba persilangan dan dombalokal pada beberapa lokasipengamatan:evaluasi kualitas semendomba hasil persilangan. Di dalamProsiding Seminar Hasil PenelitianBagian "Proyek Rekayasa TeknologiPeternakan/ARMP II". Pusat Penelitiandan Pngembangan Peternakan, Bogor.hlm 64-73.

Kaneko T, Whittingham DG, Yanagimachi R.2003. Effect of pH value of freeze-dryingsolution on the chromosome integrity anddevelopmental ability of mousespermatozoa. Biol Reprod 68:l 36-139.

Keskintepe L et al. 2002. Bovine blastocystdevelopment from oocytes injected withfreeze-dried spermatozoa. Biol Reprod67:409-415.

Kwon IK, Park KE, Niwa K. 2004. Activation,pronuclear formation, and development invitro of pig oocytes followingintracytoplasmic injection of freeze-driedspcrmatozoa. Biol Reprod 7 l:1430-1436.

Liu JL et a|.2004. Freeze-dried sperm fertilizationleads to full-term development in rabbits.Biol Reprod 70:1776-81.

Pamungkas D, Affandhy L, Umiyasih U. 1996.Pertumbuhan, libido dan kualitas semen

n7

domba ekor gemuk yang diberi pakandengan kandungan gizi yang berbeda. Didalam Prosiding Seminar NasionalPetemakan dan Veteriner. PusatPenelitian dan Pengembangan Peternakan,Cisaruq Bogor 7-8 Nopember 1995. hlm495-464.

Pangestu M, Lewin L, Shaw J, Lacham-Kaplan O,Trounson A.2001. Evaluation of embryodevelopment after ICSI with dried mousespermatozoa. lheri ogenol ogt

Revell SG, Mrode RA. 1994. An osmoticresistance test for bovine semen. AnimReprod Sci 36:77-86.

Rizal Amin M. 2005. Fertilitas SpermatozoaEjakulat dan Epididimis Domba GarutHasil Kriopreservasi MenggunakanModifikasi Pengencer Tris denganBerbagai Krioprotektan dan Antioksidan.Disertasi. Bogor: Sekolah Pascasarjana,lnstitut Pertanian Bogor.

Said S, Saili T, Tappa B. 2003. Pengaktifan danpembuahan sel telur tikus setelah disuntikdengan kepala spermatozoa. Ho,vatil0:96-99

Toelihere MR. 1993. lnseminasi Buaton padaTe r nak. Bandung: A n gkasa.

Ward MA et al. 2003. Long,-term preservation ofmouse spe rrnatozoa after freeze-dryingand freezing without cryoprotection. BiolReprod 69:2100-2 I 08.

Weitze KF, Petzoldt R. 1992. Preservation ofsemen. Anim ReprodSci 28:229-235.

Wuwuh MIS. 1990. Telaah Kualitas SemenDomba Priangan dan Silangan Suffolk-Priangan serta Upaya Inseminasi Buatandan Superovulasi. Disertasi. Bogor:Program Pascasarjana, Institut PertanianBogor.

AGRIPLUS, Volume 16 Nomot : 02 Mei 2006, ISSN 0g54-0128