LAPORAN PRAKTIKUM KULIAH KERJA LAPANGAN

EKSTRASI DNA(ISOLASI DAN ELEKTROFORESIS DNA)

OLEH KELOMPOK 8

1. Ihwan Fauzi S. 8. Dwi Ervi Agustina

2. Roris 9. Desi Okta

3. Ayu Ariska 10. Nuraini

4. Meliyani 11. Sri Utami (02)

5. Malinda Wati 12. Siti Salbiah

6. Sri Utami (01) 13. Pitri Kumalasari

7. Siti Nurhikmah

Dosen Pembimbing:

Syarifah, M.Kes

PRODI PENDIDIKAN STUDI

FAKULTAS TARBIYAH DAN KEGURUAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) RADEN FATAH

PELEMBANG

2015

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk

mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. Isolasi DNA

telah banyak dilakukan dan dikembangkan di dunia ilmiah karena teknologi-

teknologi modern telah menjamah ilmu genetika. Isolasi DNA ini dapat dilakukan

dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan teknologi modern. Mengenai hal

ini, pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain

organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik

ikan. Namun, penggunaan tumbuhan sebagai sumber lebih banyak dilakukan

dalam pengisolasian DNA dewasa ini. Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan

terutama untuk pengenalan DNA secara lebih jelas karena dari isolasi ini DNA

dapat terpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom. Setelah dilakukan isolasi,

biasanya DNA akan dielektroforesis.

Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi,

mengkarekterisasi dan purifikasi dari molekul DNA/RNA. Elektroforesis

merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar Ultra violet. Cara

pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat

pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik

untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA. Elektroforesis

digunakan untuk pengamatan DNA dalam penampakan flouresensinya.

Berdasarkan hal-hal tersebut diatas dan tak lepas dari tujuan peningkatan

khazanah ilmu pengetahuan terutama dalam bidang ilmu Genetika, maka kami

mengadakan praktikum isolasi hingga elektroforesis DNA.

2. Tujuan Praktikum

a) Untuk mengetahui cara mengisolasi DNA

b) Untuk mengetahui dan memahami proses elektroforesis pada sampel DNA

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian DNA

DNA (Deoxyribonucleic acid) adalah asam nukleat yang mengandung

materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh

bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan

kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan

berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan

kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain

itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan

sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola

pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA

prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA

eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Kirsman, 2010).

DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk

hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk

hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu

sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun

non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen

(Suryo, 2004).          

2.2 Isolasi DNA

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada

(ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan

buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu

prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik

untukmemisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul

yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan

molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan

menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas

dan pelet pada bagian bawah (Rachmat, 2012).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya

adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein

histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak

berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas

memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu.

Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.

Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon

dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki

protein histon.

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan

komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan

pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan

bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari

materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi

kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan.

DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu

sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh

polisakarida dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan

flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses

destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman

memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit

dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi diatas dapat

menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi

dsan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR.

Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari

DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan

membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah

organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada

nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana

metode tersebut merupakan bagian  dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).

Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang

signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA

menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu

secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma (Elrod, 2007).

Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma,

termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu

dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan

mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki

DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman

dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA

merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu

sentrifugasi dan presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan

campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai

berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan

berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam

fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian

bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu

komponen dari campuran (Albert, 1994).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian

DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel,

membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi.

Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA

murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan

dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus

menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan

dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah

untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA

(Rachmat, 2012).

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:

preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA.

Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada

setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini

dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi

yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan

sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi

hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di

dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan

sedikit (Kirsman, 2010).

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya

membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen

dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-

deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid

memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen,

sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Kirsman, 2010).

            Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA (Tohib, 2012) :

1. Melisiskan sel secara fisik, dengan cara penggerusan.

2. Pemecahan dinding sel

3. Pemecahan membran sel.

4. Pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan

tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan

adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan

secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan

kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel

dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran

dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur.

Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel

(DNA) bisa keluar (Tohib, 2012). 

Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain.

Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi

90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang

lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan

(Tohib, 2012).

CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen

yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan

karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel

terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke

dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa

pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa

fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh

oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk

melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase,

dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan

mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk

memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012).

Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan

dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang

mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar

terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol,

pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan

pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah

penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan

DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE

mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai

senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang

diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan

CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan

DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan

(differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode

CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di

bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris,

2010).

Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan

dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA

yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan

tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear

dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan

kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor

pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu

penyimpanan (Asris, 2010).

 2.3 Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan

listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel

yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan

listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika

molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian

dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka

molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. [2] Kecepatan

gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta

tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan

gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan

kondisi elektris lingkungan:

Keterangan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E

adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,

mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV

Jenis Elektroforesis

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas

sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,

terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi

konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas

tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang

digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas

zat terlarut.

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase

diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan

dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang

lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang

dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

BAB III

METEDOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ekstraksi DNA ini dilaksanakan pada hari Selasa 27 Januari

2015, Pukul 08.00-12.00 WIB, di Laboratorium Genetika Fakultas Sains dan

Tekhnologi, Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik Ibrahim Malang.

3.2 Alat dan Bahan

a. Alat

Pada praktikum ini alat yang digunakan adalah:

1) Gelas ukur 25 ml

2) Panci/ waterbath

3) Penyaring santan, sendok

4) Pipet tetes

5) Tube 2 ml

6) Sentrifuge

b. Bahan

Pada praktikum ini bahan yang digunakam adalah:

1) Metil Spiritus

2) Buah Sroberi dan Pisang

3) Handsoap atau Detergaen (yang mengandung SDS)

4) NaCl (garam)

5) Gelas bening/ Beaker Glass

6) Pisau

7) Timbangan

3.3 Cara Kerja

A. Isolasi DNA

1) Siapkan spiritus dalam es/ freezer sampai sangat dingin

2) Kupas buah dan potong kecil, kemudian dimasukan kedalam beaker glass

250 ml

3) Campurkan 2 gram garam, 5 ml cairan pencuci dan 50 ml air menjadi satu

kedalam beaker glass 500 ml, aduk dengan sendok makan hingga

menyatu/ homogen (15 menit)

4) Masukan larutan garam dan cairan pencuci piring tersebut kedalam beaker

glass 250 ml yang berisi potongan buah, biarkan selama 15 menit

5) Letakan beaker glass 250 ml yang berisi larutan garam, pencuci piring dan

buah tersebut ke waterbath selama 15 menit

6) Saring campuran larutan tersebut kedalam beaker glass 25 ml isi sepertiga

saja

7) Lakukan dengan hati-hati, tuangkan spiritusyang telah didinginkan tadi

melalui belakang sendok teh sehingga sepiritus membentuk lapisan

berwarna ungu diatas lapisan hijau, hentikan pengisian ketika ketinggian

mencapai 2/5 gelas, kemudin amati

8) Anda akan melihat lapisan putih yang terbentuk antara lapisan hijau dan

ungu, itulah DNA, kumpulkan DNA dengan ujung pipet tetes dan hisaplah

DNA dari gelas, atau bisa menggunakan mikroopipet 1 ml dengan

menghisap pada lapisan putih itu, dan masukan tube 1,5 ml

9) Purifikasi dengan menambahkan alkohol 70 % sebnyak 1 ml, kemudian

sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit, buang

supernatan dan ulangi sebnayak 2 kali.

10) Rehidrasi pelet DNA dengan 200 mikroolit rehydrasi slutin kit/ buffer TE,

dan simpan pada suhu dingin.

B. Elektroforesis

1) Pembuatan gel agarosa

a) Tentukan konsentrasi atau prosentasi agarosa yang dibutuhkan dan

hal ini tergantung dari ukuran fragmen DNA yang dianalisis.

Presentasi gel agarosa yang direkomendasikan adalah sebagai

berikut:

0,5 % agarosa untuk fragmen DNA Berukuran 1.000-

30.000 pb

0,7 % agarosa untuk fragmen DNA Berukuran 800-12.000

pb

1,5 % agarosa untuk fragmen DNA Berukuran 200-3.000

pb

2,0 % agarosa untuk fragmen DNA Berukuran 50-2.000 pb

b) Temptkan agarosa yang telah ditimbang kedalam erlenmeyer

dan isi dengan sejumlah larutan 1x buffer TAE, kemudian

kocok sampai merata

c) Panaskan dalam microwave atau hotplate sampai mendidih dan

larutkan agarosa kira-kira sampai 60o C

d) Setelah itu larutan dituang kedalam cetakan dan pasang sisir,

tunggu kurang lebih dai 30 menit atau sampai gel mengeras,

lepaskan sisir secara perlahan-lahan dan gel agarosa siap

digunakan untuk elektroforsis.

2) Proses Elektroforesis

a) Letakan cetakan yang berisisi gel agarosa didalam bak

elektroforesis dan tuang larutan 1x buffer TAE kedalam bak

tersebut hingga sekitar 1 mm diatas permukaan gel

b) Ambil sampel dengan mikropipet sekitar 8 µl. Letakan sampel

diatas parafilm atau plastic cling wrap dan tambahan loading

dye buffer sebanyak 2 µl kemudian gunakan mikropipet untuk

mencampur hingga rata. Ambil larutan tersebut dengan

mikropipet dan masukan kedalam sumur pada gel agarosa.

c) Setelah sempel dimasukan dalam sumur, tutup bak

elektroforesis dan hubungkan aparatus listrik (hati-hati

tegangan listrik cukup tinggi). Setelah itu proses elektroforesis

siap dijalakan

d) Lamanya elektroforesis tergantung presentase gel agarose,

tegangan arus listrik, dan ukuran molekul DNA. Sebagai

gambaran proses elektroforsis untuk tegangan listrik 100 volt.

Ukuran fragmen DNA yang dianalisis 50-2000 pasang basa

maka proses elektroforesis memerlukan waktu sekitar 30 menit

e) Setelah proses elektroforesis selesai, matikan arus listrik dan

ambil cetakan berisi gel dengn menggunakan sarung tangan.

3) Pewarnaan dan pengamatan

a) Letakan gel pada wadah yang berisi larutan etidium bromida.

Direndam selama 15 menit. (hati-hati karena etidium bromida

bersifat karsinogenik).

b) Gel yang telah direndam dipindahkan kedalam “Gel Doc” atau

UV transiluminator dan jika pita/band molekul DNA keliatan

terang maka ambil dokumentasikan melalui komputer yang

terinstal dengan “Gel Doc” atau menggunakan kamera Palaroid

jika menngunakn UV transiluminator.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Tabel 2. Pengamatan Urutan Poses Isolasi DNANo Gambar Urutan Proses Isolasi DNA Foto Hasil Pengamatan1 Isolasi DNA buah strawberry 0,1 mLWarna larutan merah pekat (merah darah)Strawberry pekat larutannyah, belum terbentuk endapan, butiran kasar masih tersebar di sekitar larutan.

2Setelah diinkubasi dalam penangas air suhu 60˚C selama 20 menitWarna larutan merah mudaBelum terlihat adanya endapan, hanya butiran halus yang tersuspensi.

3Setelah disimpan dalam wadah es selama 10 menitWarna larutan >> merah pucatTidak ada endapan

4Setelah di sentrifuge dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menitWarna larutan pink pudarTerbentuk endapan5Setelah sentrifuge kedua dengan kecepatan 14000rpm selama 10 menit.Warna larutan pink pudarWarna larutan bening dan tidak ada endapan6

Setelah ditambahkan alkohol 00% sebanyak 2x volume total sampel.Larutan beningDNA

3.2. Hasil Pengamatan Elektroforesis DNATabel 3. Pengamatan Urutan Poses Elektroforesis DNANo Foto Hasil Pengamatan Keterangan

1Sampel DNA ( telah dilarutkan dalan

TE sebanyak 30 mikroliter ) yang

telah disimpan pada suhu 4˚C selama

24 jam dan siap di elekstroforesis.

2

Loading dye,

Loading dye akan ditambahkan ke

dalam sampel dengan perbandingan 5

bagian sampel DNA dan 2 bagian

loading dye

3

4Sampel dimasukkan ke dalam sumur

yang terdapat dalam gel, alat siap

dipasang dan disambungkan ke

sumber listrik ( elektroforesis pada

daya 100 volt selama 30 menit )

4.2 Pembahasan Isolasi DNA

Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan merusak dinding dan

membrane sel dan juga membrane inti. Berdasarkan hasil pengamatan, larutan

yang berisi strawberry dan buffer berwarna merah sesuai dengan warna buah

strawberry. Penambahan buffer ekstraksi ini berfungsi untuk melisiskan membran

sel. Dan penambahan SDS 20% bertujuan untuk melisiskan dinding sel dan

mendenaturasi protein sehingga DNA pada jaringan buah strawberry dapat

diisolasi. Larutan dalam tabung tersebut dihomogenkan dengan menggunakan

vorteks.

Kemudian diinkubasi sehingga menghasilkan perubahan warna larutan.

Penginkubasian sampel dalam waterbath bersuhu 65oC selama 20 menit ini

dilakukan untuk mengoptimalikan kerja buffer ekstrak. Langkah selanjutnya

adalah penambahan Potassium asetat yang bertujuan untuk membentuk senyawa

kompleks CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel. Yang kemudian dilanjutkan

dengan sentrifugasi yang bertujuan untuk memisahkan debris dan komponen sel

lain yang menjadi pengotor dengan DNA. Proses ini menghasilkan larutan dengan

dua fasa, yakni fasa atas dan endapan. Kemudian, setelah fasa atas di ambil dan

dipindahkan ke dalam tabung baru, ditambahkan Phenol:Chloroform:Isolamyl

Alkohol (PCI) yang dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol

merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul lain

seperti polisakarida, yang diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi

DNA bebas kontaminan. Kloroform berfungsi sebagai pendenaturasi

protein,tetapi DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena tidak larut didalam

pelarut organik seperti kloroform.

Kemudian dilakukan penambahan alkohol sebagai presipitasi DNA setelah

dilakukan sentrifugasi dan pemindahan fasa. Penambahan alkohol ini berfungsi

sebagai penghilang kloroform. Sebab apabila kloroform masih berada di dalam

sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau

enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler. Dihasilkanlah larutan bening

dan gumpalan di dalam tabung. Gumpalan tersebut merupakan DNA dari jaringan

buah strawberry.

4.2. Pembahasan Elektroforesis DNA

Pada praktikum elektroforesis ini, sampel diambil dari sampel molekul

DNA yang telah dilarutkan dalam TE sebanyak 30 mikroliter dan telah disimpan

pada suhu 4˚C selama 24 jam. Lalu penambahan Loading dye ke dalam sampel

dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian loading dye.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam

sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian

dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul-

molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu

kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan

adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada

rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam

nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti

natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat

berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya

natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk linear dan

bermuatan negatif pada sisi luarnya sehingga pada saat dielektroforesis akan

menuju ke kutub positif secara seragam. Setelah proses elektroforesis selesai,

dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah

dapat dideteksi. Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium bromida

sebagai zat pewarnanya,. Etium bromida akan berinteraksi dengan basa dari

molekul DNA dan akan memberikan warna orange fluoresance yang dapat dilihat

di bawah sinar ultraviolet.

Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan terlihat pita-pita (band) pada

lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah pergerakan

sampel dari sumur gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir

elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama

elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekul-molekul

tersebut berukuran sama. Penanda (marker) yang merupakan campuran molekul

dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul

dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel

yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat

dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari

sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Dalam Hasil

pengamatan terlihat bahwa terdapat fragmen DNA yang terlihat terurai dan tidak

terurai. Semakin sedikit DNA yang terurai, maka semakin baik hasil elektroforesis

DNA nya.

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada

makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang

bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik

dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut

akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Elektroforesis ter bagi atas dua

yaitu:

Elektroforesis kertas yaitu jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas

sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,

terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi

konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas

tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang

digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas

zat terlarut.

Elektroforesis gel yaitu elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase

diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan

dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang

lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang

dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Untuk melakukan isolasi DNA dari jaringan tumbuhan, diperlukan

beberapa senyawa kimia tertentu. Senyawa-senyawa tersebut diantaranya buffer

ekstraksi yang berfungsi untuk melisiskan membran sel, SDS 20% yang berfungsi

untuk melisiskan dinding sel dan mendenaturasi protein, Potassium asetat yang

bertujuan untuk membentuk senyawa kompleks CTAB-Potassium asetat-protein-

debris sel, Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI) yang berfungsi untuk

mengekstraksi DNA dari kontaminan, Fenol yang berfungsi untuk mendapatkan

supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan, Kloroform yang berfungsi

sebagai pendenaturasi protein kecuali DNA dan RNA, dan alkohol yang berfungsi

sebagai penghilang kloroform.

Sedangkan, dalam melaksanakan elektroforesis DNA, diperlukan Buffer

TAE 10 x (400mM Tris asetat, 10 mM EDTA pH 8), Agarose, Loading Buffer,

DNA Marker, dan Etidium Bromida yang akan mewarnai DNA.

5.2. Saran

Pada saat praktikum, sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum

dilakukan dengan sesuai dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi dapat

mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini terutama dalam

penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah ditentukan dalam

petunjuk kegiatan praktikum.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka

Utama. Jakarta.

Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07.

Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 17 Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB.

Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah. http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada

tanggal 17 Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB.

Rachmat, 2012. Isolasi DNA. http://rachmatyusuf.blogspot.com. Diakses pada

tanggal 17 Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka

Wirausaha Muda dan USESE Foundation.

Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada

tangga17 Maret 2015, pada pukul 23.00 WIB.