DNA REKOMBINANPengenalan DNA rekombinanPengenalan kepada metodologi DNA rekombinanKegunaan kejuruteraan genetik

PENGENALANDNA rekombinan adalah penyambungan semula molekul DNAHasil daripada teknologi pengklonanTeknik yang terlibat disebut sebagai penjuruteraan genetik

METODOLOGI DNA REKOMBINAN

DNArekombinanPCRPenjujukan(Sequencing)Penghibridan(Hybridisation)Oligonukleotida sintetikPencernaan DNA(DNA digest)Pengklonan(Cloning)

PenghibridanPenetapan DNA ke membran nilon atau nitroselulosa Penambahan prob bertanda radioaktif/ enzim yang akan menghibrid kepada jujukan DNA yang diminatiPengenalpastian DNA yang diminati pada DNA rekombinan/klonRajah 10.8

PenjujukanPenentuan jujukan nukleotida bagi fragmen DNA, DNA rekombinan yang terhasil, gen atau kromosomkaedah degradasi kimia ( Maxam dan Gilbert (1977) -Rajah 5-3Kaedah berenzim Sanger et al. (1977)-Rajah 5-4Terkini kaedah berautomasi

Output of a DNA sequence from an automated sequencer

PCRPenghasilan/amplifikasi fragmen DNA sasaran secara berganda (eksponen) 2n- 230- 268,435,456 molekul dsDNALangkah-langkah dibawah diulang sehingga 30-40 kali :-Denaturasi 94o C-Penyepuhan 45-72o C-Pemanjangan 72o CRajah 10.11

PCRKomponen yang perluTemplat DNA (sedikit)Pencetus (perlu tahu jujukan)Enzim polimerase stabil haba (Taq polimerase)dNTPMg++Alat kitar terma

PCR- Alat kitar terma

Pencernaan DNAPenglibatan enzim penyekat dalam memotong DNA kepada fragmen yang tertentuMengenal jujukan 4-8 bp yang spesifik (palindrom)Memotong DNA dwiheliks dengan spesifikFungsi semula jadi memusnahkan DNA asing yang masuk dalam bakteria

Enzim Penyekat

EcoRI dari E.coliG A A T T CC T T A A GA A T T CC T T A AGGHujung melekit

Tindakan Enzim Penyekat

G A A T T CC T T A A GJujukan PALINDROMA A G C T T Hind III dariT T C G A A Haemophilus influenzaEcoRI dariE.coli

PengklonanEmpat proses terlibat (Rajah 10.2):1) Pemotongan vektor dan fragmen DNA yang mengandungi gen yang diminati dengan enzim penyekat2) Penyambungan vektor dan fragmen DNA yang mengandungi gen yang diminati bagi membentuk DNA rekombinan (DNA ligase)

Enzim Penyambung - DNA LigaseMembentuk ikatan fosfodiester Tindakan DNA ligase berlawanan dengan tindakan enzim penyekatperlu ATP dan 5 fosfat dan 3 hidroksilBoleh menyambung DNA berhujung melekit atau berhujung tumpulLebih efisien menyambung DNA berhujung melekit

OH (P)

5-AATCGATCGTCC- -TTAGCTAGCAGG-5OHPPOH5-AATCGATCGTCC- -TTAGCTAGCAGG-5ATPLigase- Enzim DNA ligase tidak perlu jujukan spesifik

PengklonanEmpat proses terlibat (sambungan):3) Memasukkan ke dalam hos iaitu pembawa yang akan mereplikasi DNA rekombinan (transformasi)4) Mengenalpasti klon yang membawa DNA rekombinan (hibridisasi/pencernaan dengan enzim penyekat)Contoh vektor pengklonan (Rajah 10.4 dan 10.9)

Oligonukleotida sintetikDNA bebenang tunggal yang disintesis dalam makmal (Rajah 10.10)Jujukan DNA ditentukan oleh penyelidik mengikut keperluan ujikajidigunakan sebagai -- prob (penanda) dalam penghibridan- primer dalam PCR- proses mutagenesis terarah tapak(Rajah 10.15)

KEGUNAAN KEJURUTERAAN GENETIKKesihatan manusia:pelbagai produk kesihatanPertanian dan penternakan: Tumbuhan dan haiwan transgenikBioteknologi persekitaran: degradasi pencemarForensikBioteknologi industri

Bahan terapi yang terhasil daripada teknologi DNA rekombinanProtein darah,Hormon manusia, Pengatur imun, Vaksin (Jadual 10.1) Terapi gen:penghantar dadah, ganti gen cacat (Sistik fibrosis,Duchenne Muscular Dystrophy, Adenosine deaminase , Hemophilia, Thalassemia, Kanserpengaturan gen: RNA Anti-erti

PertanianPenghasilan tumbuhan transgenik menggunakan Agrobacterium tumefaciens (Rajah 10.19) Kelebihan tumbuhan transgenikBuah lambat masak/rosak Tumbuhan rintang penyakitTumbuhan rintang racun rumpai

Buah LambatmasakTomato-Flavr savr

TeknologiAnti-erti

Bioteknologi persekitaranMenyahtoksik logam berat Tukar ke molekul tidak toksik e.g. CuS04 dan PbSO4Lombong dan kawasan tercemarKawasan perawatan bahan buangan-Nyahtoksik bahan organik

Bioteknologi industriEnzimProses membuat minuman/makananDetergen (protease)Perasa, pewarna Asid organikAsid amino Vitamin

Teknologi ForensikDarah atau tisu Perlu segar (sebaik-baiknya) Tidak unik DNA Unik, lebih pasti Analisis RFLP dan pemblotan southern Banding DNA suspek dan mangsa Guna enzim penyekat dan elektroforesis PCR membanyakkan salinan DNA

Teknologi Forensik -pencapjarian DNA- jenayah, kemalangan, waris -Guna DNA berulang -mikrosatelit/short tandem repeat

Teknologi Forensik

Teknologi Forensik

Ringkasan proses yang terlibat dalam kejuruteraan genetikTeknik-teknik yang disebutkan sebelum ini adalah saling berkaitan antara satu sama lainRajah 10.23

DNA, gen & kromosom