Laporan Praktikum Tanggal : Kamis, 26 Februari 2015Teknologi BioIndustri Gol/kel : P2/2

Dosen : Dr. Ir. Prayoga SuryadarmaAsisten :1. Ria Oktavia (F34110069)2. Imam Muharam (F34110062)

KINETIKA REAKSI ENZIMATIS

Disusun Oleh :

Inna Dinovita (F34120039)Asdani Muatika Sari (F34120041)Eka Listiana (F34120044)Irfan Arsyad (F34120060)Nur Amikalia (F34120066)Rachman Prabowo (F34120070)

DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR2015

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Enzim merupakan salah satu hasil dari bioteknologi yang terkenal. Enzim adalah protein pengkatalis reaksi biokimia yang secara kolektif membentuk metabolisme perantara dari sel. Enzim bekerja dengan urutan yang teratur, mengkatalisis ratusan reaksi yang menyimpang, mengubah energi kimiawi dan membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana. Enzim dapat mempercepat suatu reaksi tanpa ikut mengalami perubahan. Percepatan reaksi tersebut terjadi karena enzim dapat menurunkan energi aktivasi. Enzim mampu mempercepat reaksi kimia namun enzim sendiri tidak ikut bereaksi. Enzim dapat digunakan untuk menghasilkan suatu produk yang memiliki nilai jual yang tinggi.

Enzim masih dihasilkan dalam jumlah terbatas dan hanya digunakan untuk sekali pemakaian, maka nilai jualnya menjadi sangat tinggi. Kinetika enzim juga penting untuk awal perancangan produk, maka perlu sekali diketahui apa saja faktor-faktor yang mempengaruhinya dan juga bagaimana afinitas enzim yang terjadi terhadap beberapa perlakuan. Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim adalah konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, suhu, pengaruh pH, dan pengaruh inhibitor. Pengukuran jumlah enzim berdasarkan kecepatan reaksi yang dikatalisisnya. Untuk mengendalikan aktivitas enzim tersebut dalam kegiatan proses, maka perlu dipahami dasar-dasar kinetika reaksi yang dikatalisis oleh enzim, baik dalam satu substrat atau lebih. Kerja enzim dapat diaktifkan dengan adanya kofaktor, seperti ion logam, koenzim atau spesies yang lain. Enzim menaikan laju reaksi karena enzim dapat menurunkan energi aktifasi substrat yang terlibat dalam reaksi. Percepatan terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur kimia setiap enzim yang bersifat tetap, dan masing-masing memiliki kecepatan bekerja yang berbeda-beda sehingga kinetika enzim penting dan berkaitan erat dengan seberapa cepat enzim bekerja.

Tujuan

Praktikum kali ini bertujuan untuk mempelajari kinetika reaksi enzimatik α-amilase terhadap substrat amilum dan menghitung Km danVmax enzim.

METODOLOGI

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah water bath (suhu 90-95oC), spektrofotometer, tabung reaksi, gelas ukur, timbangan, Erlenmeyer dan stopwatch. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah enzim α-amilase, substrat (larutan amilum) dengan konsentrasi 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5% buffer fosfatsitrat pH 7.00 50 nM, standar glukosa, pereaksi DNS (garam Na Ktartarat + NaOH + akuades + DNS).

Metode

a. Pembuatan Kurva Standar

Mulai

Larutan glukosa murni, tanpa tambahan apapun

Larutan glukasa pada konsentrasi 0.0-0.35 mg/ml disiapkan

Blanko dibuat dengan akuades dan perlakuan yang sama

Larutan divortex dan dipanaskan selama 5 menit

Absorbansi diukur dengan spektrofotometer panjang gelombang

550nm

1ml larutan glukosa murni dimasukan ke dalam tabung reaksi

Kurva standar dibuat dengan memplotkan konsentrasi gula

(sumbu X) dan absorbansi (sumbu Y)

Selesai

b. Pengukuran Kecepatan Reaksi Enzim α-amilase terhadap Substrat Amilum pada Beberapa Konsentrasi Substrat

PEMBAHASAN

Mulai

10 ml substrat amilum diinkubasi pada suhu 90-95 oC selama 15 menit

Larutan ditambahkan enzim dan bufer 1:9

Absorbansi larutan diukur dengan spektrofotometer 550nm

Larutan dipanaskan selama 5 menit

Sampel diambil setiap 5 menit dan ditambahkan 3ml DNS

Kurva dibuat dengan memplotkan konsentrasi gula (sumbu X) dan

absorbansi (sumbu Y)

Selesai

Hasil[Terlampir]

Pembahasan

Enzim adalah senyawa katalis alami yang sebagian besar berupa protein, sehingga enzim memiliki sifat seperti protein. enzim molekul protein dapat memanipulasi molekul substrat enzim. Molekul ini mengikat ke situs aktif enzim dan diubah menjadi produk melalui serangkaian langkah yang dikenal sebagai mekanisme enzimatik (Poedjiadi, 1994)..Mekanisme ini dapat dibagi ke dalam mekanisme tunggal-substrat dan multiple-substrat. Studi kinetik pada enzim yang hanya mengikat satu substrat, seperti isomerase triosephosphate, bertujuan untuk mengukur afinitas dengan enzim yang mengikat ini substrat dan tingkat turnover.

Kinetika  enzim adalah studi reaksi kimia yang dikatalisis oleh enzim. Pada kinetika enzim, laju reaksi diukur dan dampak dari berbagai kondisi reaksi. Mempelajari kinetika enzim dalam hal ini dapat mengungkapkan mekanisme katalitik enzim, perannya dalam metabolisme, bagaimana aktivitasnya dikendalikan, dan bagaimana suatu obat atau agonis dapat menghambat sebuah enzim.

Kinetika reaksi enzimatis dapat digunakan untuk menentukan kadar enzim. Kinetika reaksi enzimatik dapat diukur dengan mengukur jumlah substrat yang diubah atau produk yang dihasilkan per satuan waktu, dan pada suatu waktu yang sangat pendek, atau pada satu titik tertentu pada grafik disebut kecepatan sesaat (instantaneus velocity). Kecepatan sesaat merupakan tangens dari garis singgung terhadap grafik pada suatu titik tertentu. Kecepatan sesaat pada waktu mendekati nol, yaitu saat grafik masih berupa garis lurus disebut kecepatan awal (Vo). Pada reaksi enzimatis, jika disebut kecepatan, umumnya yang dimaksud adalah kecepatan awal. Hal ini disebabkan karena pada keadaan awal reaksi, kita dapat mengetahui kondisi/ keadaan dengan lebih tepat. Disamping kecepatan sesaat dan Vo, juga dikenal istilah kecepatan rata-rata, yaitu perbandingan antara perubahan jumlah substrat terhadap waktu (Poedjiadi, 1994).

Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, aktivator dan inhibitor (Wirahadikusumah 1989). Faktor pertama adalah suhu. Pada suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih cepat. Disamping itu, karena enzim itu adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Apabila terjadi proses denaturasi, maka bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan reaksinya pun akan menurun. Kenaikan suhu sebelum terjadinya proses denaturasi dapat menaikkan kecepatan reaksi. Peningkatan suhu meningkatkan reaksi enzim yang terkatalisis dan yang tidak terkatalisis dengan cara meningkatkan energi kinetic dan frekuensi tubrukan dari besarnya molekul. Bagaimanapun energy panas dapat meningkatkan energi kinetic dari enzim ke titik yang mana kelebihan energy pelindung untuk dapat mengganggu

interaksi non-kovalen yang berfungsi mengatur struktur tiga dimensi dari enzim. Cincin polipeptida kemudian mulai terbuka atau terdenaturasi, yang disertai dengan pengurangan kecepatan dari aktivitas katalisis. Pada temperatur tertentu sebuah enzim berada dalam keadaan stabil, konformasi. Enzim pada umumnya stabil pada temperatur 45-55°C. Sebaliknya, enzim pada mikroorganisme termofilik yang berada pada sumber mata air panas gunung berapi, atau pada lubang hidrotermal bawah laut dapat stabil pada suhu kurang lebih 100°C. Enzim tersusun oleh protein, sehingga sangat peka terhadap suhu. Peningkatan suhu menyebabkan energi kinetik pada molekul substrat dan enzim meningkat, sehingga kecepatan reaksi juga meningkat. Namun suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan rusaknya enzim yang disebut denaturasi, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menghambat kerja enzim. Pada umumnya enzim akan bekerja baik pada suhu optimum, yaitu antara 30° – 40°C. Q10 atau koefisien suhu yaitu faktor yang meningkatkan proses biologis bila suhu naik 100 C. Umumnya enzim yang stabil pada peningkatan suhu maka Q10 = 2.

Faktor kedua adalah PH. Perubahan pH dapat mempengaruhi perubahan asam amino kunci pada sisi aktif enzim, sehingga menghalangi sisi aktif bergabung dengan substratnya. Setiap enzim dapat bekerja baik pada pH optimum, masing-masing enzim memiliki pH optimum yang berbeda. Sebagai contoh : enzim amilase bekerja baik pada pH 7,5 (agak basa), sedangkan pepsin bekerja baik pada pH 2 (asam kuat/sangat asam) (Anonim 2011).Seperti protein pada umumnya, struktur ion enzim tergantung pada pH lingkungannya. Enzim dapat berbentuk ion positif, ion negatif, atau ion bermuatan ganda. Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat. Disamping pengaruh terhadap struktur ion pada enzim, pH rendah, atau pH tinggi dapat pula menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini akan mengakibatkan menurunnya aktifitas enzim. Terdapat suatu nilai pH tertentu atau daerah pH yang dapat menyebabkan kecepatan reaksi paling tinggi. pH tersebut dinamakan pH optimum. Enzim intrasel bekerja optimum antara pH 5-9. Hilangnya atau tambahnya muatan akan merugikan atau membuat enzim tidak aktif.

Faktor ketiga adalah konsentrasi enzim. Kecepatan reaksi dipengaruhi oleh konsentrasi enzim, makin besar konsentrasi enzim makin tinggi pula kecepatan reaksi, dengan kata lain konsentrasi enzim berbanding lurus dengan kecepatan reaksi.

Faktor yang keempat adalah konsentrasi substrat. Hasil eksperimen menunjukkan bahwa dengan konsentrasi enzim yang tetap, maka pertambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi. Untuk dapat terjadi kompleks enzim substrat, diperlukan adanya kontak antara enzim dengan substrat. Kontak ini terjadi pada suatu tempat atau bagian enzim yang disebut bagian aktif. Pada konsentrasi substrat rendah, bagian aktif enzim ini hanya menampung sedikit substrat. Bila konsentrasi substrat diperbesar, makin banyak substrat yang dapat berhubungan dengan enzim pada bagian aktif tersebut. Dengan demikian, konsentrasi kompleks enzim substrat makin besar dan hal ini menyebabkan makin besarnya kecepatan reaksi. Namun dalam keadaan ini, bertambah besarnya konsentrasi susbstrat tidak menyebabkan bertambah besarnya konsentrasi kompleks enzim substrat, sehingga jumlah hasil reaksinya pun tidak bertambah besar.Peningkatan konsentransi substrat dapat meningkatkan kecepatan reaksi bila jumlah enzim tetap.

Namun pada saat sisi aktif semua enzim berikatan dengan substrat, penambahan substrat tidak dapat meningkatkan kecepatan reaksi enzim selanjutnya. Enzim mempunyai spesifitas yang tinggi. Apabila substrat cocok dengan enzim naka kinerja enzim juga akan optimal.

Faktor kelima adalah aktivator dan inhibitor. Aktivator merupakan molekul yang mempermudah ikatan antara enzim dengan substratnya, misalnya ion klorida yang bekerja pada enzim amilase. Inhibitor merupakan suatu molekul yang menghambat ikatan enzim dengan substratnya. Inhibitor akan berikatan dengan enzim membentuk kompleks enzim-inhibitor. Ada 2 jenis inhibitor, yaitu inhibitor kompetitif dan non-kompetitif. Inhibitor kompetitif adalah molekul penghambat yang strukturnya mirip substrat, sehingga molekul tersebut berkompetisi dengan substrat untuk bergabung pada sisi aktif enzim. Contoh : sianida bersaing dengan oksigen untuk mendapatkan Hemoglobin pada rantai akhir respirasi. Inhibitor kompetititf dapat diatasi dengan penambahan konsentrasi substrat.Menghambat kerja enzim dengan menempati sisi aktif enzim. Inhibitor ini besaing dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim. Pengambatan bersifat reversibel (dapat kembali seperti semula) dan dapat dihilangkan dengan menambah konsentrasi substrat. Inhibitor non-kompetitif merupakan molekul penghambat yang bekerja dengan cara melekatkan diri pada bagian bukan sisi aktif enzim. Inhibitor ini menyebabkan sisi aktif berubah sehingga tidak dapat berikatan dengan substrat. Inhibitor nonkompetitif tidak dapat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat. Inhibitor ini biasanya berupa senyawa kimia yang tidak mirip dengan substrat dan berikatan pada sisi selain sisi aktif enzim. Ikatan ini menyebabkan perubahan bentuk enzim sehingga sisi aktif enzim tidak sesuai lagi dengan substratnya. Contohnya antibiotik penisilin menghambat kerja enzim penyusun dinding sel bakteri. Inhibitor ini bersifat reversible tetapi tidak dapat dihilangkan dengan menambahkan konsentrasi substrat.

Kurva standar merupakan kurva yang dibuat dari beberapa larutan standar yang masih dalam batas linieritas sehingga dapat diregresi linierkan. Biasanya digunakan untuk menunjukan besarnya konsentrasi larutan sampel dari hasil pengukuran, sehingga konsentrasi sampel larutan bisa diperoleh dengan mudah. Kurvas tandar menunjukan hubungan antara konsentrasi larutan pada sumbu x dengan absorbansi larutan pada sumbu y, dari kurva tersebut dapat diperoleh persamaan y= ax + b, dengan a adalah slope atau kemiringan garis dan b adalah konstanta. Menurut Underwood (1990), kurva standar merupakan standar dari sampel tertentu yang dapat digunakan sebagai pedoman maupun acuan untuk sampel tersebut pada percobaan. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya, sehingga nilai konsentrasi sampel dapat diketahui.

Standar glukosa dibuat dengan menyiapkan larutan glukosa murni dengan konsentrasi 0.0‐0.35 mg/ml dengan selang 0.05. Sebanyak 1 ml dari masing‐masing larutan glukosa mumi dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 3 ml pereaksi DNS. Larutan divortex untuk homogenisasi kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama tepat 5 menit (gunakan stop watch). Blanko dibuat dengan mengganti sampel. dengan akuades dan diperlakukan sama. Setelah itu diukur absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang (X) 550 nm. Kurva

standar dibuat dengan memplot data konsentrasi glukosa (sumbu X) versus absorbansinya (sumbu Y).

Pada pembuatan kurva standar glukosa diperoleh data seperti yang terlihat pada tabel 1. Kemudian dari data tersebut, diolah menjadi persamaan garis linear sehingga diperoleh persamaan matematis x = (y + 0.094)/0.002 dimana x adalah konsentrasi glukosa dan y merupakan nilai absorbansi dari glukosa pada panjang gelombang 550 nm. Dari persamaan ini, maka diperoleh perhitungan kadar glukosa sebagai produk dari reaksi reaksi enzim α‐amilase terhadap substrat amilum pada beberapa konsentrasi substrat dengan menggunakan data hasil pengamatan nilai absorbansi dari tiap sampel seperti pada tabel 2. Data perhitungan kadar glukosa dapat dilihat pada tabel 3.

Pada pembuatan kurva standar glukosa diperoleh data nilai absorbansi yang berbeda pada tiap konsentrasi yang digunakan. Larutan standar yang digunakan dalam pembuatan kurva standar nilai absorbansi yang dihasilkan untuk konsentrasi amilum 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 dan 0.5 adalah masing-masing 0.0242, 0.0057, 0.0072, -0.0013, 0.0122. Kemudian dari data tersebut, diolah menjadi persamaan garis linear sehingga diperoleh persamaan matematis y = 35.843x - 230.01, dengan slope atau kemiringan sebesar 35.843, dimana x adalah konsentrasi glukosa dan y merupakan nilai absorbansi dari glukosa pada panjang gelombang 550 nm. Nilai slope ini merupakan nilai kecepatan enzimatik, dari nilai tersebut kemudian dapat dihitung konsentrasi glukosa yang digunakan untuk pengukuran reaksi enzim α-amilase terhadap substrat amilum pada beberapa konsentrasi substrat.

Tabel hubungan absorbansi terhadap waktu menunjukan konsentrasi glukosa yang dihidrolisis oleh enzim α-amilase, semakin tinggi konsentrasi amilum yang digunakan maka konsentrasi gula yang dihasilkan juga akan semakin tinggi dengan bertambahnya waktu (Wirahadikusumah 1989). Konsentrasi glukosa diperoleh dari kurva standar berdasarkan waktu dan absorbansinya pada λ 550 nm. Pada konsentrasi amilum 0.1% didapatkan nilai konsentrasi glukosa yang meningkat dari menit ke-0 hingga ke-30, dengan nilai regresi sebesar 0.9878. Untuk konsentrasi amilum 0.2% terjadi peningkatan konsentrasi glukosa pada menit ke-0 hingga menit ke-15 yang kemudian menurun pada menit ke-25 dan selanjutnya konstan hingga menit ke-30 dengan nilai regresi 0.1914. Untuk konsentrasi amulim 0.3% konsentrasi glukosa menurun pada menit ke-0 hingga ke-5, kemudian meningkat pada menit ke 10 dan kemudian konstan hingga menit ke 30, dengan nilai regresi 0.5929. Untuk konsentrasi amilum 0.4% konsentrasi glukosa meningkat pada menit ke-0 hingga ke 10 dan kemudian konstan hingga menit ke-30, dengan nilai regresi 0.0199. Sedangkan untuk konsentrasi amilum 0.5% konsentrasi glukosa meningkat dari menit ke-0 hinggamenit ke-30, dengan nilai regresi 0.8913.

Enzim adalah substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan berperan sebagai katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme. Katalisator adalah substansi yang mempercepat reaksi tetapi pada hasil reaksi, substansi tersebut tidak berubah. Enzim mempunyai ciri dimana kerjanya dipengaruhi oleh lingkungan. Amilase merupakan enzim yang menguraikan pati menjadi disakarida yang lebih sederhana, bahkan hingga menjadi monoskakarida seperti glukosa. Cara kerja enzim dipengaruhi oleh berbagai faktor diantaranya adalah suhu, pH, jumlah enzim, jumlah

substrat, dan keberadaan aktivator serta inhibitor enzim (Sutiamiharja, 2008: 30-31).Suhu sangat berpengaruh terhadap kerja enzim. Enzim sebagai protein akan

mengalami denaturasi jika suhunya dinaikkan. Akibatnya daya kerja enzim menurun. Hal ini juga terjadi karena semakin tinggi suhu semakin naik pula laju reaksi kimia baik yang dikatalisis maupun tidak. Pada suhu ruang, enzim masih dapat bekerja dengan baik walaupun tidak optimum (Gaman & Sherrington, 1994). Selain itu suhu rendah relatif lebih stabil bagi enzim (Winarno 1986). Suhu optimum untuk setiap organisme berbeda-beda. Suhu ideal kerja enzim 30 – 40oC, dengan suhu optimum 37oC. Namun pada praktikum ini digunakan suhu 90-95Oc ditujukan untuk mengoptimalkan aktivitas enzim amilase. Enzim amilase pada umumnya memilki aktivitas kerja pada kisaran suhu 25-95oC (Poliana dan Mc. Cabe 2007).

Pengaruh pH berhubungan dengan perubahan status ionik antara asam amino penyusun enzim dengan molekul substrat. Pada umumnya enzim menunjukkan aktivitas maksimum pada suatu kisaran pH yang disebut pH optimum, yang umumnya antara pH 4,5-8,0 (Winarno,1986). Hubungan aktifitas dan konsentrasi ion hidrogen menunjukan keseimbangan antara denaturasi enzim dan pH yang rendah atau tinggi dan pengaruh pada status muatan dari enzim, substrat dan keduanya. Jika pH terlalu tinggi atau terlalu rendah enzim akan mengalami denaturasi dan ini akan mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim. Enzim membutuhkan pH tertentu untuk menjalankan aktivitasnya. Setiap enzim membutuhkan pH yang berbeda-beda. α-amilase bekerja optimum pada pH netral yaitu pH 6-7,7. Enzim β-amilase memiliki pH optimum 4-5, sedangkan Υ-amilase optimum pada pH 3 (Shaw 2008).

Konsentrasi glukosa meningkat seiring waktu reaksi. Setelah mencapai waktu tertentu, konsentrasi glukosa tidak mengalami peningkatan yang signifikan kembali, hanya meningkat sedikit bahkan konstan. Hal ini dapat dipengaruhi juga dengan konsentrasi substrat. Jika jumlah substratnya sedikit, kecepatan kerja enzim juga rendah. Sebaliknya, jika jumlah substrat yang tersedia banyak, kerja enzim juga cepat. Pada konsentarsi enzim yang tetap, peningkatan konsentarsi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi enzimatis sampai mencapai kecepatan maksimum (Vmaks) yang tetap. Seiring berjalannya waktu, pada titik maksimum, semua enzim telah jenuh dengan substrat, sehingga penambahan substrat sudah tidak akan meningkatkan kecepatan reaksi (Sirajuddin, 2011).

Selain konsentrasi substrat, pH, dan suhu, faktor lingkungan lain seperti konsentrasi enzim, aktivator dan inhibitor juga dapat mempengaruhi kinetika reaksi enzimatis. Kecepatan enzim bereaksi dipengaruhi oleh konsentrasi enzim yang berfungsi sebagai katalisator. Jika konsentrasi enzim dengan substrat sudah seimbang, maka kecepatan reaksi kimia akan relatif konstan. Demikian juga dengan adanya aktivator yang berfungsi mengaktifkan enzim dan pada umumnya berasal dari bahan yang tahan panas dan berberat molekul yang relatif rendah. Aktivator merupakan molekul yang mempermudah ikatan antara enzim dengan substratnya, misalnya ion klorida yang bekerja pada enzim amilase. Inhibitor merupakan suatu molekul yang menghambat ikatan enzim dengan substratnya. Inhibitor akan berikatan dengan enzim membentuk kompleks enzim-inhibitor (Lehninger, 1982: 253-255).

Pada praktikum kali ini digunakan enzim untuk mempercepat pemecahan substrat pati menjadi glukosa. Enzim yang digunakan adalah enzim amilase. Secara

umum enzim ini memiliki sifat bekerja pada substrat tertentu serta memerlukan suhu dan pH tertentu. Enzim amilase adalah suatu katalisator organic yang dihasilkan oleh sel dan digunakan untuk memecah karbohidrat menjadi glukosa. Enzim amilase dibedakan menjadi tiga berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah yaitu α-amilase, β-amilase dan glukoamilase. Pada praktikum ini digunakan enzim α-amilase. Menurut Colby (1985) enzim α-amilase pada umumnya aktif bekerja pada suhu antara 25-40 0C. penambahan ion kalsium dan klorida dapat meningkatkan aktifitas kerja dan menjaga kestabilan enzim. Enzim ini akan memotong ikatan α-1,4 glikosidik pada molekul.

Kurva standar merupakan kurva yang dibuat dari beberapa larutan standar yang masih dalam batas linieritas sehingga dapat diregresi linierkan. Biasanya digunakan untuk menunjukan besarnya konsentrasi larutan sampel dari hasil pengukuran, sehingga konsentrasi sampel larutan bisa diperoleh dengan mudah. Kurva standar menunjukan hubungan antara konsentrasi larutan pada sumbu x dengan absorbansi larutan pada sumbu y, dari kurva tersebut dapat diperoleh persamaan y= ax + b, dengan a adalah slope atau kemiringan garis dan b adalah konstanta. Menurut Underwood (1990), kurva standar merupakan standar dari sampel tertentu yang dapat digunakan sebagai pedoman maupunacuan untuk sampel tersebut pada percobaan. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan nilai absorbansinya, sehingga nilai konsentrasi sampel dapat diketahui.

Hasil pengamatan menunjukan nilai absorbansi yang berbeda pada tiap konsentrasi yang digunakan, untuk larutan standar yang digunakan untuk membuat kurva standar nilai absorbansi yang dihasilkan untuk konsentrasi amilum 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 dan 0.5 adalah masing-masing 0.0242, 0.0057, 0.0072, -0.0013, 0.0122. nilai tersebut kemudian di plot pada grafik hubungan antara konsentrasi (sumbu x) dan absorbansi (sumbu y), kemudian hubungan tersebut di regresi linierkan dan didapatkan fungsi y = 35.843x - 230.01, dengan slope atau kemiringan sebesar 35.843. Nilai slope ini merupakan nilai kecepatan enzimatik, dari nilai tersebut kemudian dapat dihitung konsentrasi glukosa yang digunakan untuk pengukuran reaksi enzim α-amilase terhadap substrat amilum pada beberapa konsentrasi substrat.

Tabel hubungan absorbansi terhadap waktu menunjukan konsentrasi glukosa yang dihidrolisis oleh enzim α-amilase, semakin tinggi konsentrasi amilum yang digunakan maka konsentrasi gula yang dihasilkan juga akan semakin tinggi dengan bertambahnya waktu (Wirahadikusumah 1989). Konsentrasi glukosa diperoleh dari kurva standar berdasarkan waktu dan absorbansinya pada λ 550mm. Pada konsentrasi amilum 0.1% didapatkan nilai konsentrasi glukosa yang meningkat dari menit ke-0 hingga ke-30, dengan nilai regresi sebesar 0.9878. Untuk konsentrasi amilum 0.2% terjadi peningkatan konsentrasi glukosa pada menit ke-0 hingga menit ke-15 yang kemudian menurun pada menit ke-25 dan selanjutnya konstan hingga menit ke-30 dengan nilai regresi 0.1914. Untuk konsentrasi amulim 0.3% konsentrasi glukosa menurun pada menit ke-0 hingga ke-5, kemudian meningkat pada menit ke 10 dan kemudian konstan hingga menit ke 30, dengan nilai regresi 0.5929. Untuk konsentrasi amilum 0.4% konsentrasi glukosa meningkat pada menit ke-0 hingga ke10 dan kemudian konstan hingga menit ke-30, dengan nilai regresi 0.0199. Sedangkan untuk

konsentrasi amilum 0.5% konsentrasi glukosa meningkat dari menit ke-0 hingga menit ke-30, dengan nilai regresi 0.8913.

Kecepatan reaksi enzim α-amilase dipengaruhi oleh konsentrasi tertentu amilum berdasarkan waktu per menit. Pada konsentrasi substrat yang rendah, kenaikan substrat akan meningkatkan kecepatan reaksi enzimatis hampir secara linier yang berbanding lurus dengan waktu pemanasan sampai mencapai waktu optimum. Jika konsentrasi substrat tinggi, maka peningkatan kecepatan reaksi enzimatis akan semakin menurun sejalan dengan peningkatan jumlah substratnya hingga mengalami penjenuhan (Wirahadikusumah 1989). Hal ini terjadi pada saat konsentrasi amilum 0.1% dimana konsentrasi glukosa yang dihasilkan meningkat seiring waktu dan linier. Serta untuk konsentrasi amilum 0.2%, 0.3% dan 0.4% yang mengalami peningkatan kemudian konstan akibat konsentrasi amilum yang semakin tinggi. Sedangkan untuk konsentrasi amilum 0.5% kemungkinan belum mencapai waktu optimum sehingga masih meningkat hingga menit ke-30.

Semakin lama waktu hidrolisis juga semakin banyak pati yang dipecah menjadi glukosa. Apabila konsentrasi enzim semakin tinggi hingga mencapai kondisi optimum maka aktivitas enzim dalam proses hidrolisis semakin besar. Hal ini disebabkan oleh masih adanya kemampuan enzim untuk mengubah pati menjadi glukosa. Namun, semakin lama waktu, dan bertambahnya konsentrasi enzim hingga melampaui kondisi optimum, menyebabkan yield glukosa yang dihasilkan menurun dikarenakan kemampuan enzim untuk mengubah pati menjadi glukosa semakin menurun (Jamilatun et al 2004).

Grafik kecepatan reaksi enzim α-amilase merupakan grafik yang menunjukan suatu nilai regresi linear. Jika suatu nilai regresi linear mendekati nilai satu maka data tersebut semakin valid. Kecepatan reaksi enzim α-amilase dipengaruhi oleh nilai dari konsentrasi glukosa berdasarkan konsentrasi amilum dan waktu. Kecepatan reaksi enzimatik umumnya dipengaruhi kadar substrat. Penambahan kadar substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang tetap akan mempercepat reaksi enzimatik sampai mencapai maksimum. Penambahan substrat berikutnya tidak akan menambah kecepatan reaksi (Page 1981). Pada praktikum nilai regresi yang dihasilkan mendekati valid ketika konsentarsi 0.1% dan 0.5%, sedangkan untuk konsentrasi 0.2-0,4% kurang valid.

PENUTUP

Simpulan

Enzim adalah senyawa katalis alami yang sebagian besar berupa protein, sehingga memiliki sifat seperti protein. Kinetika  enzim adalah studi reaksi kimia yang dikatalisis oleh enzim, kinetika reaksi enzimatik dapat diukur dengan mengukur

jumlah substrat yang diubah atau produk yang dihasilkan per satuan waktu, dan pada suatu waktu yang sangat pendek. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi fungsi enzim diantaranya adalah suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, aktivator dan inhibitor. Pada praktikum ini pengujian hanya berfokus pada pengaruh perbedaan penambahan konsentrasi substrat pada kecepatan reaksi enzimatis. Kecepatan reaksi enzim dengan substrat dapat dilihat dari kekeruhan warna seletah pemansan, reaksi ini menggunakan DNS, larutan DNS berfungsi sebagai indikator adanya gula pereduksi. Semakin keruh larutan maka kadar gula pereduksi dan nilai absorbansinya semakin besar. Hasil kemudian diplot pada kurva standar dan kemudian didapatkan nilai KM dan Vmax

Berdasarkan pengujian yang dilakukan untuk berbagai konsentrasi amilum didapatkan hasil yang berbeda, untuk konsentrasi amilum yang rendah didapatkan kenaikan reaksi enzimatis yang bersifat linear, dan semakin tinggi konsentrasi yang digunakan kenaikan reaksi enzimatis hanya bersifat linear pada waktu awal dan pada akhirnya bersifat statis atau tidak ada penambahan lagi. Sehingga hasil ini sesuai dengan Sirajuddin (2011) Jika jumlah substratnya sedikit, kecepatan kerja enzim juga rendah. Sebaliknya, jika jumlah substrat yang tersedia banyak, kerja enzim juga cepat. Pada konsentarsi enzim yang tetap, peningkatan konsentarsi substrat akan menaikkan kecepatan reaksi enzimatis sampai mencapai kecepatan maksimum (Vmaks) yang tetap. Seiring berjalannya waktu, pada titik maksimum, semua enzim telah jenuh dengan substrat, sehingga penambahan substrat sudah tidak akan meningkatkan kecepatan reaksi. Nilai yang didapatkan untuk KM yaitu 0,0043 ppm/menit dan nilai Vmax yang didapatkan yaitu -0,1558.

Saran

Saat larutan dipanaskan di penangas air, terlalu banyak orang yang mengerjakan sehingga ada larutan yang tumpah dalam pengangas air dan harus diulang, seharusnya ada 1-2 orang saja yang mengerjakannya supaya dapat dikerjakan dengan baik dan benar.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. Parameter Michaelis-Menten.[Terhubung berkala]. http://artikel teknikkimia.blogspot.com/2011/12/parameter-michaelis-menten.html.(3 Maret 2015)

Colby. 1985. Biochemistry: A Chemistery. California: Lange Medical Publication.

Gaman, P.M & K.B. Sherrington. (1994). Ilmu Pangan, Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi

dan Mikrobiologi. Universitas Gadjah Mada press. Yogyakarta.

Jamilatun, S., Sumiyati, Y. dan Handayani, R. N., (2004), “Pengambilan Glukosa dari Tepung Biji Nangka dengan cara Hidrolisis Enzimatik Kecmbah Jagung”, Prosiding Seminar Nasional Rekayasa kimia dan Proses, pp. 1-5.

Lehninger. 1982. Dasr-dasr Biokimia. Volume ke-1.Suhartono, MT, penerjemah; Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari Principles of Biochemistry.

Page D. 1981. Prinsip-Prinsip Biokimia. Jakarta (ID) : Erlangga.

Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : UI Press

Poliana dan Mc. Cabe. 2007. Industrial Enzymes; Structure, Function, and Applications. Dordrecht : Springer. Halaman 20-22.

Shaw, 2008. Purification and properties of an extracellular a-amylase from Thermussp.http://ejournal.sinica.edu.tw/bbas/content/1995/3/bot363-08.html. Tanggal akses 2 Maret 2015.

Sirajuddin, Saifuddin. 2011. Penuntun Pratikum Biokimia. UNHAS, Makassar.

Sutiamiharja N. 2008. Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Amilase kasar Termofilik dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatera Utara. USU Repository. Sumatera Utara.

Underwood A L. 1990. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi ke Enam. Jakarta: Erlangga.

Winarno.1986. Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia

Wirahadikusumah M. 1989. Biokimia : Protein, Enzim, dan Asam nukleat. Bandung (ID) : ITB.

LAMPIRAN

Tabel 1. Kurva Standar

konsentrasi

konsentrasi glukosa murni (x) vs

absorbansi (y)0 0

0,05 0,1890,1 0,237

0,15 0,3520,2 0,456

0,25 0,5810,3 0,691

0,35 0,846

a = 0.02 y= a+bxb = 2.278 y= 0.02 + 2.278xr = 0.995 r kuadrat = 0.991

Grafik Kurva Standar

Tabel 2. Absorbansi bebrapa konsentrasi amilum yang dishidrolisis amylase

Waktu (Menit)

Absorbansi ƛ 550 nmAmilum

0,1%Amilum

0,2%Amilum

0,3%Amilum

0,4%Amilum

0,5%0 0.095 0.428 0.575 0.795 1.1155 0.495 0.773 0.483 1.507 1.405

10 0.621 1.345 1 1 1.678

15 0.902 1.354 1 1 1.77720 1.127 1 1 1 1.85525 1.512 1 1 1 1.96730 1.822 1 1 1 1.977

Grafik Hubungan Absorbansi terhadap Waktu

Tabel 3. Konsentrasi Glukosa

Waktu (Menit)

Konsentrasi glukosa ƛ 550 nmAmilum

0,1%Amilum

0,2%Amilum

0,3%Amilum

0,4%Amilum

0,5%0 0.03 0.18 0.24 0.34 0.485 0.21 0.33 0.20 0.65 0.61

10 0.26 0.58 0.43 0.43 0.7315 0.39 0.59 0.43 0.43 0.7720 0.49 0.43 0.43 0.43 0.8125 0.65 0.43 0.43 0.43 0.8530 0.79 0.43 0.43 0.43 0.86

Grafik Konsentrasi Glukosa dengan Waktu

Tabel 3. Slope

S 1/S V 1/V0.1 10.00 0.0242 41.320.2 5.00 0.0057 175.440.3 3.33 0.0072 138.890.4 2.50 -0.0013 -769.230.5 2.00 0.0122 81.97

Grafik hubungan 1/V dengan 1/S

Hasil Nilai SatuanVmax -0.0043 ppm/menitKm -0.1558

Lembar Pernyataan

Dengan ini kami menyatakan bahwa laporan praktikum Teknologi Bioindustri ini telah dilakukan secara berkelompok dengan pembagian tugas sebagai berikut.

Nama Tugas TTDNur Amikalia Membuat larutan Enzim,

Mengambil larutan tiap 5 menit sekali, memvortex,mengambil larutan DNS

Asdani Muatika Sari Membuat Larutan pati 0.2%Mengambil larutan DNSMemanasi sampel pada penangas selama 5 menit

Eka Listiana Membuat larutan Enzim,Mengambil larutan tiap 5 menit sekali, memvortex,mengambil larutan DNS

Rachman Prabowo Membuat larutan Enzim,Mengambil larutan tiap 5 menit sekali, memvortex,mengambil larutan DNS, menguji larutan dengan Spektrofotometer

Inna Dinovita Membuat Larutan pati 0.2%Mengambil larutan DNSMemanasi sampel pada penangas selama 5 menit

Irfan Arsyad Menguji larutan dengan spektrofotometer,memvortex