PEMBUATAN MEDIA ALAMI PLASMA DAN SERUM

Oleh:Nama: Ita Pratiwi KNIM: B1J012042Rombongan: IIKelompok: 3

LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN HEWAN

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO2014

I. PENDAHULUANA. Latar BelakangDarah dipandang sebagai jaringan penyambung terspesialisasi yang dibentuk dari sel-sel bebas dan suatu matriks cair (plasma).Sel-sel bebas atau sel-sel darah disebut sebagai unsur berbentuk yang terbagi menjadi 3 macam yaitu eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit. Plasma darah adalah komponen cairan darah, dimana sel darah ditutup.55% dari jumlah volume darah merupakan plasma darah. Plasma darah disiapkan oleh tuba darah segar yang berputar pada sentrifugal sampai sel darah jatuh ke dasar tuba. Apabila darah dikeluarkan dari sistem sirkulasi, darah akan membeku. Bekuan ini mengandung unsur-unsur berbentuk dan cairan kuning bening disebut serum, yang memisahkan diri dari koagulum. Darah yang ditampung dan dicegah dari pembekuan dengan menambahkan antikoagulan (heparin atau sitrat) akan berpisah bila disentrifugasi menjadi lapisan-lapisan yang menggambarkan sifat heterogennya (Anthea, 1993).Media adalah substansi yang memiliki peranan sangat penting dalam kultur suatu organ maupun jaringan dari hewan. Oleh karena itu, media yang digunakan dalam pengkulturan seharusnya mengandung komponen-komponen yang dibutuhkan oleh suatu organ atau jaringan untuk tumbuh dan berkembang.Media yang biasa digunakan adalah media plasma, serum dan ekstrak embrio. Sedangkan fungsi dari media kultur ini adalah:1. Menyediakan kondisi fisik, pH, ataupun tekanan osmosis yang diperlukan untuk kehidupan kultur.2. Menyediakan substansi kimia yang komplit dan dibutuhkan oleh jaringan, namun tak dapat disintesis sendiri.Perkembangan kultur sel meningkatkan kebutuhan akan media. Media mengandung nutrisi yang dibutuhkan sel untuk pertumbuhan dan perkembangan selama kondisi in vitro. Media yang akan digunakan harus disesuaikan dengan jenis atau tipe sel yang akan dikultur. Media yang diperlukan untuk kultur sel atau jaringan atau organ memerlukan pertimbangan antara lain, kondisi fisik dan kimia dari suatu media, komponen media, seleksi media dan serum, dan media tanpa serum (Roche, 2012). Komponen dasar yang terdapat di dalam media antara lain garam anorganik, glukosa, dan substansi organik lainnya. Komposisi dari komponen tersebut disesuaikan dengan kebutuhan khusus sel yang akan dikultur. Sebagian media yang komersial tersedia dalam bentuk larutan atau dalam bentuk bubuk yang dilarutkan dalam air. Air yang digunakan harus air yang telah didestilasi terlebih dahulu (Hlser, 2004).Media mengandung nutrisi, hormon, dan faktor pertumbuhan yang dibutuhkan untuk menunjang pertumbuhan dan perkembangan. Media juga harus diperhatikan pH dan osmolaritasnya tergantung pada jenis sel yang akan dikultur. Media awalnya berasal dari media alami yaitu dari ekstrak jaringan dan cairan tubuh yang mana harus diperlukan standarisasi untuk kultur jaringan. Media terbagi menjadi tiga yaitu media basal, media dengan pengurangan serum, dan media tanpa serum (Gibco, 2013).

B. TujuanTujuan dari praktikum pembuatan media alami plasma dan serum yaitu untuk membuat media alami berupa serum dan plasma darah yang berasal dari darah ayam dan ikan.

II. MATERI DAN METODEA. MateriAlat-alat yang digunakan pada praktikum pembuatan media alami plasma dan serum yaitu meja operasi, sentrifugator, tabung sentrifugasi mikro 0,6 mL dan 1,5 mL, spuit injeksi volume 1 dan 3 mL, alat bedah, mikropipet dan tip, lampu spiritus, refrigerator, bak pemeliharaan ikan.Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum pembuatan media alami plasma dan serum yaitu alkohol 70%, heparin/ EDTA, kain kassa steril/tisu, ayam jantan dewasa muda, umur kurang dari 1 tahun, kertas label, dan ikan nilem.

B. MetodeMetode yang dilakukan dalam praktikum ini adalah :a. Pembuatan serum dan plasma darah ayam 1. Alat dan bahan disiapkan2. Darah ayam diambil pada vena branchia yang terletak di bagian sayap dengan menggunakan syring (untuk pembuatan serum, syring tidak perlu diberi EDTA, sedangkan untuk pembuatan plasma syring harus dibasahi EDTA terlebih dahulu).3. Darah ayam ditampung di tabung falcon jika banyak atau ditampung di tabung eppendorf jika darah yang didapat sedikit. 4. Plasma dan serum ditampung pada tabung yang berbeda.5. Volume darah pada tabung falcon atau tabung eppendorf dicatat dan diberi label.6. Sediaan plasma dan serum darah ayam disimpan dalam lemari pendingin selama 1 hari.7. Sediaan plasma dan serum ayam disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm.8. Supernatan yang terbentuk diambil dengan mikropipet dan tip kemudian dipindahkan ke tabung eppendorf baru.9. Volume plasma dan serum ayam dicatat.b. Pembuatan serum dan plasma darah ikan :1. Alat dan bahan disiapkan2. Darah ayam diambil pada vena caudalis yang terletak di bagian pangkal ekor atu pada bagian jantung dengan menggunakan syring (untuk pembuatan serum, syring tidak perlu diberi EDTA, sedangkan untuk pembuatan plasma syring harus dibasahi EDTA terlebih dahulu).3. Darah ikan ditampung di tabung falcon jika banyak atau ditampung di tabung eppendorf jika darah yang didapat sedikit. 4. Plasma dan serum ditampung pada tabung yang berbeda.5. Volume darah pada tabung falcon atau tabung eppendorf dicatat dan diberi label.6. Sediaan plasma dan serum darah ikan disimpan dalam lemari pendingin selama 1 hari.7. Sediaan plasma dan serum ikan disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 12000 rpm.8. Supernatan yang terbentuk diambil dengan mikropipet dan tip kemudian dipindahkan ke tabung eppendorf baru.9. Volume plasma dan serum ikan dicatat.

III. HASIL DAN PEMBAHASANA. Hasil

Gambar 1. Serum dan plasma yang sudah disentrifugasi

SumberVoV1Warna

Ayam

P (VB)0,60,5Kuning

S (VB)0,20,1Kuning

Ikan

S1 (VC)0,240,15Kuning

S2 (Cr)0,220,12Jingga

S3 (Cr)0,290,13Jingga

S4 (VC)0,410,3JIngga

P1 (VC)0,480,18Merah Tua

P2 (VC)0,120 LMerah Tua

Tabel 1. Hasil Pengamatan Serum dan Plasma Ikan dan AyamKeterangan :P = PlasmaVc = Vena CaudalS = SerumCr = Cor (jantung)

B. PembahasanBerdasarkan hasil pengamatan bahwa pembuatan media alami yang dilakukan menggunakan serum dan plasma dari ikan dan ayam. Pengambilan dilakukan dengan mengambil darah dari vena di sayap ayam dan vena caudal di pangkal ekor ikan. Darah tersebut disimpan di dalam kulkas lalu keesokan harinya disentrifugasi 12000rpm selama 10 menit. Hasil yang didapatkan adalah plasma ikan 1 dan 2 berwarna merah gelap yang menandakan bahwa darah yang diambil telah lisis sehingga tidak terbentuk plasma. Serum ikan 1 warna serum kuning. Sedangkan untuk serum 2 dan 3 dan 4 ikan berwarna jingga. Warna plasma ayam adalah kuning dan serum ayam berwana kuning. Hasil pada plasma dan serum ayam serta serum ikan 1 sesuai dengan pernyataan Ouellet et al. (2006) yang menyatakan bahwa supernatan yang baik adalah supernatan yang berwarna kuning. Jika supernatan berwarna merah yang diperoleh,kemungkinan terdapat kesalahan pada langkah kerja sehingga masih terdapat sel darah pada serum yang diamati yang mengakibatkan timbulnya warna merah pada supernatan.Kesulitan yang dihadapi saat mengambil darah terutama pada darah ikan adalah saat mengambil darah pada bagian vena caudal darah tidak langsung terambil sehingga terlalu banyak bagian yang disuntikan dan hasil darah yang didapat pun sedikit. Kesulitan saat mengambil darah ayam saat praktikum yaitu banyak bagian vena branchial dari ayam yang sudah mengalami pembengkakan akibat luka sehingga darah tidak dapat diambil. Plasma darah adalah komponen darah berbentuk cairan berwarna kuning yang menjadi medium sel-sel darah, dimana sel darah ditutup. 55% dari jumlah/volume darah merupakan plasma darah. Volume plasma darah terdiri dari 90% berupa air dan 10% berupa larutanprotein, glukosa, faktor koagulasi, ionmineral, hormon dan karbon dioksida. Plasma darah juga merupakan medium pada proses ekskresi. Plasma darah dapat dipisahkan di dalam sebuah tuba berisi darah segar yang telah dibubuhi zat anti-koagulan yang kemudian diputar sentrifugal sampai sel darah merah jatuh ke dasar tuba, sel darah putih akan berada di atasnya dan membentuk lapisan buffy coat, plasma darah berada di atas lapisan tersebut dengan kepadatan sekitar 1025 kg/m3, or 1.025 kg/l (Anthea, 1993).Serum darah adalah plasma tanpa fibrinogen, sel dan faktor koagulasi lainnya. Fibrinogen menempati 4% alokasi protein dalam plasma dan merupakan faktor penting dalam proses pembekuan darah.Plasma darah merupakan zat anti bodi bagi manusia (Anthea, 1993). Plasma darah adalah cairan darah yang punya warna merah kekuningan.Hal ini dikarenakan Plasma darah tersusun dari 90% dan protein terlarut (albumin,globumin, dan fibrinogen). Apabila plasma darah diambil fibrinogennya maka yang akan tersisa adalah suatu cairan yang berwarna kuning yang biasa dinamakan seru dan di dalam serum inilah, terdapat suatu zat yaitu zat antibody (Octa, 2010). Plasma merupakan salah satu media yang digunakan dalam praktikum ini. Plasma yang biasa digunakan dalam pembuatan media pada kultur jaringan tradisional adalah koagulum. Plasma yang akan digunakan sebelumnya disentrifugasi terlebih dahulu lalu dipindahkan pada tabung lain yang steril serta disimpan di dalam kulkas. Kultur jaringan yang mesih bersifat tradisional menggunakan plasma yang berasal dari ikan dan ayam (Yadav and Tyagi, 2005). Penggunaaan media serum yang berasal dari darah ikan dan ayam masih dilakukan karena menghemat uang dan waktu. Contoh penggunaan media serum dari ayam dan ikan yaitu pada pembuatan kultur sel primer. Serum pada media bekerja dengan baik jika digunakan sebagai tambahan zat untuk kultivasi (Rathore et al., 2010). Serum hewan merupakan pencampuran yang kompleks, tinggi rendahnya biomolekul, dengan perbedaan keseimbangan fisiologis antara pemicu pertumbuhan dan penghambat pertumbuhan. Biologi selmodern dan biokimia melakukan identifikasi mengenai faktor pertumbuhan pada serum pada proses in vivo seperti proliferasi sel dan perbaikan jaringan, marturasi sel dan diferensiasi. Berikut ini adalah tabel mengenai kompenen di dalam serum (Brunner et al., 2010).Protein Components: Serum proteins

Transportproteins

Attachment andSpreading Factors

Enzymes

AlbuminGlobulins (e.g. Immunglobulins, IgG)1-Antitrypsin (ProteaseInhibitor)2-Macroglobulin (Protease Inhibitor)

TransferrinTranscortin1-Lipoprotein1-Lipoprotein

FibronectinLamininSerum Spreading Factor

Lactate Dehydrogenase Alkaline Phosphatase-Glutamyl TransferaseAlanine Amino transferase (ALT/GPT)Aspartate Amino transferase (AST/GOT)

HormonesInsulin Glucagon Corticosteroids Vasopressin Thyroid HormonesParathyroid HormoneGrowth HormonePituitary Glandotropic Factors Prostaglandins

Growth Factors and Cytokines

Epidermal Growth Factor (EGF) Fibroblast Growth Factor (FGF ) Nerve Growth Factor (NGF)Endothelial Cell Growth Factor (ECGF) Platelet-derived Growth Factor (PDGF) Insulin-like Growth Factors (IGFs)

InterleukinsInterferonsTransforming Growth Factors(TGFs)

FattyAcids andLipids

Freeand Protein-bound Fatty AcidsTriglycerides Phospholipids Cholesterol EthanolaminePhosphatidylethanolamine

VitaminsandTraceElements

Retinol/RetinoicAcid (VitaminA) VitaminB-Group:ThiamineRiboflavinPyridoxine/PyridoxalphosphateCobalamin FolicAcid Niacinamide/NicotinicAcidPanthotenicAcidBiotinAscorbic Acid (Vitamin C)-Tocopherol (VitaminE)

Selenium, Iron,Zinc,andCu, Co, Cr, I,F,Mn,Mo,V,Ni, Sn

CarbohydratesGlucose Galactose Fructose Mannose RiboseGlycolytic Metabolites

Nonprotein Nitrogens

Urea Purines/Pyrimidines PolyaminesCreatinineAmino Acids

IV. KESIMPULANA. KesimpulanBerdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa :1. Media alami dapat dibuat melalui pembuatan serum dan plasma darah dari ikan dan ayam melalui pengambilan darah dari vena di sayap ayam serta vena caudal di pangkal sirip ekor ikan.

B. SaranSaat melakukan pengambilan darah harus hati-hati agar darah yang didapatkan tidak lisis. Saat mengambil hasil serum dan plasma dari mikrosentifuge harus hati-hati agar nata atau darah yang menggumpal tidak ikut terbawa.

DAFTAR REFERENSIAnthea, 1993. Human Biology and Health. Englewood Cliffs, New Jersey, USA: Prentice Hall. ISBN 0-13-981176-1.Brunner, Daniel, J. Frank, H. Appl, H. Schffl, W. Pfaller, G. Gstraunthaler. 2010. Serum-free Cell Culture: The Serum-free Media Interactive Online Database. Altex.2010 ;27(1):53-62.

Gibco. 2013. Cell Culture Basics. Life Technologies Corporation. Indonesia.Hlser, F. Dieter. 2004. Brain Tumour Development and Invasion. Int. J. Dev. Biol. 48: 497-508 (2004).

Octa, 2010. Sistem Peredaran darah untuk makhluk hidup. http://klikbelajar.com/pelajaran-sekolah/pelajaran-biologi/sistem-peredaran-darah-pada-makhluk-hidup/. Diakses 7 Oktober 2014.Ouellet, S., Franois V., Maryse L., Steeve L., Rgen D., Sylvain L. G. 2006. Transcriptional regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21) gene by NFI in proliferating human cells. Universit de Sherbrooke, Qubec, Canada.

Rathore, G., N. Sood, R. Swaminathan. 2010. Primary Cell Culture from Fish Gills and Kidney Using Fish Serum. Indian J Exp Biol.936-8. PMID:11831381Roche, 2012.Culture of Animal Cells-Basic Techniques. Roche Diagnostics GmbH. Germany.

Yadav, P. R., R. Tyagi. 2005. Cell Culture. Discovery Publishing House. India. ISBN : 81-8356-019-9.