6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bekatul

Bekatul atau rice bran merupakan hasil samping proses penggilingan padi

berasal dari lapisan terluar beras yaitu bagian antara butir beras dan kulit padi.

Warna bekatul padi bervariasi dari coklat muda sampai coklat tua. Bentuk bekatul

serta letak bekatul dalam padi dapat dilihat pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1. (a) bentuk bekatul dan (b) lapisan bekatul dalam butir padi

(http:www.nutracea.com/a_ricebran.php).

Sebenarnya bekatul memiliki karakteristik cita rasa lembut dan agak

manis. Namun pada kenyataannya, cita rasa bekatul sering digambarkan bau

tengik, apek, dan asam. Hal ini terjadi karena bekatul mudah mengalami

kerusakan. Penurunan mutu bekatul ditandai dengan bau tengik dan struktur

menggumpal. Hal ini disebabkan aktivitas lipase yang menghidrolisis lipid

bekatul menjadi asam lemak bebas dan gliserol (Widowati, 2001). Untuk

memperoleh bekatul yang tidak mudah tengik dan memperpanjang masa simpan,

(a) (b)

7

maka bekatul harus diawetkan segera setelah diperoleh dari penggilingan padi.

Teknik pengawetan bekatul bisa dilakukan dengan cara dibungkus rapat dan

disimpan dalam lemari es pada suhu -4oC atau diawetkan menggunakan autoklaf

yang dilakukan pada suhu 121oC selama 3 menit (Damayanthi dkk, 2004).

Selama ini penggunaan bekatul masih terbatas hanya sebagai pakan ternak.

Sebenarnya bekatul yang kaya akan kandungan gizinya dapat dijadikan bahan

baku industri makanan dan industri farmasi. Bekatul dapat dicampur dengan

bahan lain pada pembuatan biskuit dan kue serta sereal. Selain itu juga

pemanfaatannya sebagai minyak goreng telah banyak digunakan di luar negeri.

2.2 Minyak Bekatul

Minyak bekatul atau yang lebih dikenal dengan rice bran oil adalah

minyak hasil ekstraksi bekatul yang merupakan salah satu produk dari industri

penggilingan padi. Berdasarkan hasil penelitian Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Pasca Panen Pertanian (BB-Pascapanen), randemen minyak

bekatul yang dihasilkan sekitar 14-17%. Selanjutnya Tahira et al. (2007)

memperoleh randemen minyak bekatul rata-rata sebesar 19,32%. Berbedanya

randemen minyak bekatul ini tergantung kepada varietas padi, proses

penggilingan, metode ekstraksi minyak, serta kondisi dan lamanya penyimpanan

bekatul (Nursalim dan Zalni, 2007).

Ekstraksi minyak bekatul bisa dilakukan pada suhu tinggi maupun rendah.

Berdasarkan penelitian diketahui bahwa bekatul bisa diekstraksi dengan baik

menggunakan alat ekstraksi padat-cair dengan cara Soxhlet dan pelarut n-heksan.

8

Kualitas minyak yang dihasilkan berbau khas minyak bekatul dengan sedikit

berbau heksan, serta berwarna kuning kecoklatan (Nursalim dan Zalni, 2007).

Ekstraksi minyak bekatul dengan heksan pada suhu tinggi menghasilkan wax 3-

4%. Wax dapat dipisahkan dari minyak dengan cara kristalisasi atau diendapkan

pada suhu rendah. Selain itu juga bisa dihilangkan dengan cara sentrifugasi karena

minyak memiliki massa jenis yang lebih kecil dari wax (Marshall et al., 1994).

Asam lemak bebas yang dapat dihasilkan sekitar 5-7% dari berat minyak bekatul.

(Mazza, 1998).

Minyak bekatul umumnya dimanfaatkan sebagai minyak goreng dan

margarin. Minyak bekatul memiliki titik asap yang cukup tinggi yaitu 254oC,

lebih tinggi dibandingkan minyak nabati lainnya. Selain itu minyak bekatul

memiliki kandungan asam lemak tak jenuh yang tinggi, yang bisa menurunkan

kadar kolesterol, sehingga minyak bekatul merupakan minyak goreng terbaik

diantara minyak yang ada (Mulyana, 2007).

Minyak bekatul telah digunakan secara luas di beberapa negara Asia

Timur dan Amerika sebagai premium edible oil atau minyak makan berkualitas

terbaik (Mulyana, 2007). Beberapa tahun terakhir minyak bekatul telah diproduksi

dan dimanfaatkan sebagai minyak salad, bahan baku kosmetik, bahkan

dikonsumsi langsung sebagai suplemen kesehatan. Minyak bekatul yang tidak

termurnikan bisa dimanfaatkan dalam pembuatan sabun. Bekatul yang sudah

diekstraksi minyaknya mengandung 1-3% minyak sisa yang sangat baik untuk

binatang ternak. Produk samping lain dari ekstraksi minyak bekatul adalah malam

9

(wax) yang bisa menggantikan carnauba wax dalam penggosokan, pembuatan

kertas karbon, dan produk lainnya (Nursalim dan Zalni, 2007).

2.3 Komposisi Kimia Bekatul dan Minyak Bekatul

2.3.1 Komposisi Kimia Bekatul

Komposisi kimia bekatul sangat bervariasi, tergantung pada faktor

agronomis, varietas padi, dan proses penggilingannya (Ardiansyah, 2008). Secara

umum bekatul mengandung protein (11,5%-17,2%), lipid (10-23%), karbohidrat

(51,1%-55%), abu (8%-17,7%), serat kasar (6,2%-31,5%), mineral dan vitamin

(Mazza, 1998). Protein bekatul lebih rendah dari protein hewani namun lebih

tinggi daripada kedelai, biji kapas, jagung, dan terigu. Bekatul mengandung asam

amino lisin yang lebih tinggi dibandingkan beras (Damayanthi dkk., 2007).

Mineral yang paling banyak terkandung di dalam bekatul adalah fosfor.

Selain itu magnesium, kalium, besi, dan silikon dengan persentase yang cukup

tinggi serta natrium dan kalsium dengan persentase rendah. Bekatul kaya akan

vitamin B diantaranya adalah vitamin B1, B2, B3, B5, dan B6 serta tokoferol.

Serat yang terkandung dalam bekatul terdiri dari selulosa dan hemiselulosa. Serat

tersebut termasuk ke dalam serat yang tidak larut dalam air. Serat yang tidak larut

dapat memperlancar saluran pencernaan sehingga dapat mencegah konstipasi dan

menurunkan kolesterol dalam darah serta untuk kesehatan jantung (Mazza, 1998).

Seperti yang telah dikemukakan Marshall et al. (1994) bahwa kandungan bekatul

yang dapat berpengaruh pada penurunan kolesterol adalah tokotrienol, oryzanol,

β-sitosterol, hemiselulosa, β-glukan, asam lemak tak jenuh, dan protein.

10

Bekatul sangat potensial dijadikan bahan pangan fungsional karena

kandungan gizinya yang tinggi. Namun bekatul mengandung asam fitat yang

merupakan senyawa antinutrisi yang mampu berikatan dengan protein dan

mineral. Asam fitat bisa diubah menjadi senyawa lain yang lebih sederhana oleh

enzim fitase. Enzim fitase dapat diproduksi oleh mikroorganisme melalui

fermentasi. Saat ini sudah banyak dilakukan pengolahan bekatul dengan cara

fermentasi (Sujono, 2001).

Bekatul hasil fermentasi telah digunakan sebagai bahan campuran pakan

ternak yang memberikan efek kesehatan yang baik untuk ternak, yakni dapat

menurunkan kolesterol daging dari 54,44 mg menjadi 29,59 mg serta kolesterol

telur dari 252,07 mg/100 g bahan kering menjadi 196,49 mg/100 g bahan kering

(Sujono, 2001). Tidak hanya sebagai pakan ternak, bekatul hasil fermentasi bisa

digunakan sebagai sumber asam lemak tak jenuh. Berdasarkan hasil penelitian

Jang et al. (2000), diketahui bahwa bekatul merupakan substrat yang paling

efektif dibandingkan kacang tanah, gandum, dan ubi untuk menghasilkan asam

lemak tak jenuh dalam produksi minyak sel tunggal menggunakan Mortierella

alpina.

2.3.2 Komposisi Kimia Minyak Bekatul

Minyak bekatul merupakan minyak sehat yang sangat efektif untuk

menurunkan kadar kolesterol (Tsuji et al., 1997). Minyak bekatul mengandung

asam lemak tak jenuh dan fraksi tak tersabunkan yang larut dalam lemak yaitu

tokoferol, tokotrienol, dan oryzanol. Tokoferol dan tokotrienol merupakan

11

komponen pembentuk vitamin E. Kandungan vitamin E dan oryzanol bervariasi

tergantung pada varietas padinya yaitu sekitar 2-5% dari berat minyak bekatul

padi kasar (Moustapha et al., 1994).

Vitamin E berguna untuk memperbaiki sirkulasi darah dan berperan

sebagai antioksidan alami yang dapat melindungi minyak dari proses ketengikan

tanpa harus menambahkan antioksidan sintesis. Tokoferol, tokotrienol, dan

oryzanol merupakan antioksidan alami yang bermanfaat melawan radikal bebas

dalam tubuh terutama sel kanker, serta membantu menurunkan kadar kolesterol

dalam darah. Oryzanol merupakan antioksidan yang sangat kuat dan lebih aktif

daripada vitamin E dalam melawan radikal bebas, serta dipercaya sangat efektif

menurunkan kolesterol dalam darah dan kolesterol liver, menstimulasi sistem

saraf, serta menghambat waktu menopause (Ardiansyah, 2008). Oryzanol

termasuk ke dalam kelompok ester asam ferulat dalam alkohol triterpen dan sterol

(Rong et al., 1997).

Sterol merupakan kandungan utama dari fraksi tak tersabunkan minyak

bekatul. Kandungan bahan ini mencapai 5% dari berat minyak. Sterol yang

terdapat dalam jumlah banyak di dalam minyak bekatul adalah β-sitosterol yang

jumlahnya 50 persen dari total sterol (Ardiansyah, 2008). Sterol berperan dalam

menghambat penyerapan kolesterol plasma darah dan meningkatkan ekskresi

sehingga dapat menurunkan penyerapan kolesterol total (Faisal, 2003).

Kandungan kimia minyak bekatul dapat dilihat pada Tabel 2.1.

12

Tabel 2.1. Kandungan kimia minyak bekatul (Narasinga, 2000) Komponen Kandungan*

mg/100g Tokol 11 Tokoferol 4 Tokotrienol 7 Gamma Oryzanol 1176 Sikloartanol 106 Sikloartenol 482 24-Metilen Sikloartenol 492 Fitosterol 1806 Campesterol 51 Stigmasterol 271 β-sitosterol 885 Squalen 756 Fosfolipid 4200 Lilin 3000

Selain kandungan sterol, minyak bekatul mengandung asam lemak tak

jenuh yang tinggi yang memberikan efek ganda bersama sterol dalam penurunan

kolesterol darah. Asam lemak tidak jenuh telah terbukti berperan penting dalam

pencegahan dan pengobatan aterosklerosis (penyumbatan pembuluh darah),

hipertrigliseridaemia dan tekanan darah tinggi (Koswara, 2002). Asam lemak tak

jenuh menjadikan kolesterol darah pada tingkat kadar yang normal, khususnya

asam linoleat dan oleat. Hampir 80% komposisi asam lemak yang terdapat dalam

minyak bekatul adalah asam lemak tak jenuh (Ardiansyah, 2008). Asam oleat

merupakan asam lemak tak jenuh yang paling banyak terdapat dalam minyak

bekatul. Komposisi asam lemak minyak bekatul dapat dilihat pada Tabel 2.2.

13

Tabel 2.2. Komposisi asam lemak minyak bekatul (Parrado et al., 2005) Jenis Asam Lemak Jumlah (%)

Asam Miristat (14:0) 0,21

Asam Palmitat (16:0) 16,4

Asam Palmitoleat (16:1) 0,13

Asam Stearat (18:0) 1,72

Asam Oleat (18:1) 42,4

Asam Linoleat (18:2) 36,4

Asam Linolenat (18:3) 0,80

Asam Eikosanoat (20:0) 0.60

Asam lemak tak jenuh tunggal (oleat) pada minyak bekatul dapat

menurunkan resiko penyakit kardiovaskuler seperti hiperlipidemik. Asam lemak

tak jenuh ganda (linoleat dan linolenat) yang terdapat dalam minyak bekatul bila

digunakan untuk diet dapat mencegah peningkatan kadar gula dalam darah

(Drajat, 2003).

2.4 Manfaat Minyak Bekatul Untuk Kesehatan

Bekatul maupun minyak bekatul telah terbukti dapat digunakan sebagai

obat dan mencegah berbagai penyakit seperti kanker, hiperlipidemia, penyakit

jantung, dan arterosklerosis (Parrado et al., 2005). Beberapa penelitian

menunjukkan bahwa bekatul dapat memberikan efek hipokolesterolemik. Asam

lemak tak jenuh, hemiselulosa dan fraksi tak tersabunkan merupakan komponen

dari bekatul yang bisa menurunkan kolesterol. Hal ini dibuktikan pada hewan dan

manusia yang mengkonsumsi bekatul terjadi penurunan trigliserida darah yang

signifikan (Kahlon et al., 1996). Minyak bekatul menurunkan secara nyata kadar

low density lipo-protein (LDL) dan very low density lipo-prortein (VLDL), serta

14

minyak bekatul dapat meningkatkan kadar high density lipo-protein (HDL). Nilai

LDL dan HDL mempunyai implikasi terhadap kesehatan jantung dan pembuluh

darah. Nilai LDL yang tinggi dikaitkan dengan resiko tinggi terhadap penyakit

jantung, sebaliknya HDL tinggi dikaitkan dengan resiko rendah penyakit jantung

(Almatsier, 2001). HDL merupakan jenis kolesterol yang bersifat baik atau

menguntungkan (good cholesterol), karena mengangkut kolesterol dari pembuluh

darah kembali ke hati untuk dibuang sehingga mencegah penebalan dinding

pembuluh darah atau mencegah terjadinya proses aterosklerosis (Bahri , 2004).

Kandungan asam lemak omega-3 (asam linolenat) pada minyak bekatul

sangat berpengaruh terhadap penurunan kolesterol. Asam lemak omega-3 dapat

membersihkan plasma dari lipoprotein kilomikron dan VLDL, serta dipercaya

menurunkan produksi trigliserida dan apolipoprotein di dalam hati. Asam oleat,

dengan satu ikatan rangkap, bersifat netral terhadap LDL (tidak menurunkan atau

menaikkan), tetapi dapat meningkatkan lipoprotein HDL (Almatsier, 2001).

Disamping terbukti mampu menurunan kadar kolesterol darah, telah

terbukti bahwa fraksi bekatul mempunyai kemampuan menurunkan tekanan darah

dan meningkatkan metabolisme glukosa dengan menggunakan hewan percobaan,

yang disebut stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP), spesies tikus

yang secara genetik mengalami hipertensi dan hiperlipidemia. Hipertensi (tekanan

darah tinggi) dan hiperlipidemia (berlebihnya jumlah lemak) merupakan dua

kondisi penyebab penyakit kardiovaskuler dan aterosklerosis (Ardiyansyah,

2008).

15

2.5 Fermentasi

Fermentasi dapat diartikan sebagai suatu proses pengolahan pangan

dengan menggunakan jasa mikroorganisme untuk menghasilkan sifat-sifat produk

sesuai yang diharapkan. Winarno dkk. (1980) mengemukakan bahwa fermentasi

menyebabkan terjadinya perubahan sifat pada bahan yang difermentasi karena

terjadi segala macam proses metabolisme dengan bantuan enzim dari

mikroorganisme. Fardiaz (1992) mendefinisikan fermentasi sebagai proses

pemecahan karbohidrat dan asam amino secara anaerob, yaitu tanpa memerlukan

oksigen. Senyawa yang dapat dipecah dalam proses fermentasi terutama

karbohidrat, sedangkan asam amino hanya dapat difermentasi oleh beberapa jenis

bakteri tertentu saja.

Menurut jenis substratnya proses fermentasi dibagi menjadi dua yaitu

fermentasi substrat padat dan fermentasi substrat cair. Fermentasi substrat padat

merupakan proses fermentasi yang menggunakan substrat yang tidak larut tetapi

cukup mengandung air untuk keperluan mikroorganisme, sedangkan fermentasi

substrat cair adalah proses fermentasi yang substratnya larut atau tersuspensi di

dalam fase cair (Hardjo dkk., 1989).

Fermentasi substrat padat lebih menguntungkan dibandingkan dengan

fermentasi substrat cair karena dapat menggunakan substrat alami yang sifatnya

tunggal, persiapan inokulum yang lebih sederhana, dan dapat menghasilkan

produk dengan kepekatan yang lebih tinggi. Selain itu kontrol terhadap

kontaminasi lebih mudah dan kondisi inkubasi hampir menyerupai kondisi alami

sehingga tidak memerlukan kontrol suhu dan pH yang teliti, serta aerasi dapat

16

berlangsung lebih optimum karena ruang lebih besar. Sekitar 50% nutrisi dari

substrat pada fermentasi padat, digunakan kapang untuk pertumbuhan selnya

(Susana, 2004).

2.6 Mikroorganisme Oleaginous

Menurut Rahman (1992), mikroorganisme oleaginous adalah

mikroorganisme yang mampu menghasilkan lipid dengan kandungan lipid atau

minyak yang tidak tinggi. Secara umum yang termasuk mikroorganisme

oleaginous (Svedsen, 1994 dalam Debby dkk., 2003) yaitu :

a. Bakteri, seperti lemak dari Staphylococcus aureus, S. hycus, Bacillus,

Pseudomonas, dan Moraxella.

b. Kapang, seperti lemak dari Penicillium camemberti, Geotrichum candidum,

Aspergillus tereus, Mucor miehei, dan Humicola lanuginose.

c. Khamir, seperti lemak dari Candida antartika, C. Rugosa, dan C.

cylindraceae.

Mikroorganisme oleaginous memiliki tingkat pertumbuhan yang cepat

pada berbagai jenis substrat, mampu mensintesis senyawa, dan manipulasi

genetik. Mikroorganisme oleaginous mampu melakukan berbagai reaksi seperti

oksidasi, desaturasi, dan hidrogenasi yang bisa meningkatkan biomassa produk

baik karbohidrat maupun lipid. Penelitian menunjukkan bahwa mikroorganisme

oleaginous mampu mengkonversi karbohidrat menjadi lipid hingga 20% (Leman,

1997).

17

Minyak yang dihasilkan oleh mikroorganisme oleaginous berpotensial

menjadi minyak makan berkualitas tinggi karena mikroorganisme tersebut dapat

menghasilkan asam lemak essensial yang dibutuhkan untuk kesehatan manusia.

Sebagian besar khamir, kapang, dan bakteri telah diidentifikasi cukup berpotensi

untuk menghasilkan asam lemak, terutama untuk menghasilkan asam lemak tak

jenuh majemuk.

Jumlah lipid yang dihasilkan mikroorganisme bervariasi tergantung dari

spesiesnya. Lipid yang dihasilkan khamir dan kapang cenderung didominasi

menjadi triasilgliserol. Asam lemak yang dihasilkan khamir dan kapang terutama

adalah asam lemak C16 dan C18 seperti asam oleat, palmitat, linoleat, stearat, dan

palmitoleat. Karena itu khamir dan kapang bisa dijadikan sebagai pengganti

minyak tumbuhan menjadi minyak pangan yang komersial (Ratledge, 1992).

Kapang mempunyai kelebihan dibandingkan dengan khamir, dilihat dari

kemampuannya untuk menggunakan limbah dan pertumbuhannya yang cepat

pada limbah, serta dapat menghasilkan berbagai asam lemak. Penggunaan kapang

untuk memproduksi asam lemak tak jenuh lebih mendapat perhatian. Hal ini

disebabkan kapang mudah ditangani, dapat tumbuh pada kisaran pH yang rendah

sehingga dapat mencegah kontaminasi dari jenis bakteri maupun khamir. Selain

itu, kapang dapat mendeteksi sumber karbon yang kompleks sebagai sumber

makanannya, mampu tumbuh cepat pada limbah, dan mampu menghasilkan

berbagai asam lemak (Ratledge dan Wilkinson dalam Debby dkk., 2003).

18

2.7 Aspergillus terreus

Kapang Aspergillus tersebar luas di alam yang terdiri dari 180 spesies.

Beberapa spesies Aspergillus digunakan untuk fermentasi makanan tradisional

seperti kecap asin, miso (tauco), dan untuk industri sake. Selain itu, Aspergillus

telah digunakan untuk produksi enzim skala industri diantaranya amilase dan

protease. Penelitian menunjukkan bahwa spesies Aspergillus terreus (A.terreus)

dapat menghasilkan lovastatin yang bisa menurunkan kolesterol (Lubertozzi,

2008). Morfologi kapang Aspergillus ditunjukkan pada Gambar 2.2.

Gambar 2.2. Morfologi Kapang Aspergillus (http://en.wikipedia.org/wiki/File:Aspergillus.jpg)

Karakteristik genus kapang Aspergillus adalah miseliumnya terdiri dari

hifa yang bercabang-cabang dan berseptat, berwarna terang atau tidak berwarna.

Miseliumnya sebagian masuk ke dalam medium dan sebagian ke luar. Sel kaki

terkadang di dalam medium, terkadang di luar dan lebih besar dari bagian lain

serta berdinding lebih tebal. Dari sel kaki timbul batang konidiofor dan tumbuh

tegak lurus (Fardiaz, 1992).

Adapun ciri-ciri spesifik A.terreus yaitu dapat mencapai pertumbuhan

setelah 3-6 hari pada media agar miring potato dekstrosa agar (PDA), spora

19

aseksualnya diproduksi dalam jumlah banyak yang menyebar di permukaan media

agar, sporanya berukuran kecil dan ringan, berwarna coklat krem, koloninya

kompak serta tahan terhadap keadaan kering (Debby, 2003). Klasifikasi dari

A.terreus adalah sebagai berikut (Fardiaz, 1992):

Divisi :Amastigomycota,

Subdivisi : Deuteromycotina,

Kelas : Deuteromycetes,

Subkelas : Hyphomycetidae,

Ordo : Moniliales,

Famili : Moniliaceae,

Genus : Aspergillus, dan

Spesies : Aspergillus terreus.

Morfologi A.terreus baik secara mikroskopis maupun pada media PDA

dapat dilihat pada Gambar 2.3.

(a) (b) Gambar 2.3. Morfologi Kapang Aspergillus terreus (a). Morfologi

mikroskopis dan (b). Morfologi pada media PDA (http://www.doctorfungus.org).

20

A.terreus memiliki sel kaki yang tidak begitu jelas terlihat, konidioforanya

nonseptat, konidiofora membengkak menjadi visikel pada ujungnya dan

membentuk sterigmata tempat tumbuhnya konidia (Debby dkk., 2003).

2.8 Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroorganisme

Oleaginous

Banyak faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme

oleaginous untuk bisa mengakumulasi lipid, diantaranya yaitu suhu pertumbuhan,

pH, kadar air, kelarutan oksigen, waktu inkubasi, dan nutrisi.

2.8.1. Suhu

Suhu lingkungan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan

mikroorganisme. Suhu pertumbuhan optimal kapang yang bersifat mesofilik

berkisar 25–30oC. Peningkatan suhu pertumbuhan pada kisaran optimum

umumnya disertai dengan peningkatan kandungan lemak dari kapang (Shaw

dalam Debby dkk, 2003). Selanjutnya dari penelitian Moon et al. dalam Leman

(1997) diketahui bahwa kondisi optimum untuk mengakumulasi lipid dari

berbagai jenis kapang yaitu pada suhu 30oC baik pada kultur batch maupun yang

continuosly. Namun Ratledge (1992) menyatakan bahwa pertumbuhan sel dan

produksi minyak sel tunggal pada kapang Mortierella rammaniana var.

angulispora IFO 8187 tidak dipengaruhi suhu pertumbuhan (20 – 30oC), tidak ada

ketergantungan yang jelas antara suhu pertumbuhan dengan produksi biomassa

atau kandungan lemak pada miselium kapang. Berdasarkan penelitian Debby dkk.

21

(2003), diketahui bahwa produksi lipid dari A.terreus pada substrat onggok-ampas

tahu dilakukan pada suhu 30oC.

Pada suhu yang rendah, kapang dapat memproduksi lipid lebih besar. Hal

ini dibuktikan oleh Entomophthora exitalis yang tumbuh dalam kultur continuous

pada rentang suhu 20–300C. Kapang ini memproduksi asam lemak tak jenuh

(PUFA) jenis omega-3 dan omega-6 (Kendrick dan Ratledge dalam Leman,

1997).

Pengaruh suhu yang paling nyata terhadap produksi lipid adalah perubahan

pada komposisi asam lemaknya. Asam lemak tidak jenuh relatif meningkat pada

suhu pertumbuhan yang relatif rendah (Summer dan Morgan, 1969 dalam Debby

dkk., 2003). Perubahan komposisi asam lemak yang dipengaruhi oleh perubahan

suhu, ada hubungannya dengan aktivitas enzim desaturase. Enzim yang berperan

dalam pembentukan ikatan rangkap ini akan terhambat aktivitasnya pada suhu

yang tinggi. Hal ini memberi penjelasan mengapa pada suhu yang lebih rendah,

kandungan asam lemak tak jenuhnya tinggi (Gurr et.al. dalam Debby dkk., 2003).

2.8.2. pH

pH merupakan parameter yang mempengaruhi pertumbuhan kapang dan

pembentukan produk. Kebanyakan kapang dapat tumbuh pada kisaran pH yang

luas yaitu pH 2–8,5 , tetapi biasanya pertumbuhannya akan lebih baik pada

kondisi asam atau pH rendah (Fardiaz, 1992). Nilai pH optimum untuk

pertumbuhan kapang berkisar antara 5,0–7,0, sedangkan pH optimum untuk

22

produksi lemak bervariasi pada setiap spesies kapang (Cantrell et al. dalam Debby

dkk.,2003).

Nilai pH medium dipengaruhi oleh jenis sumber nitrogen yang digunakan.

Amonium sulfat menyebabkan pH medium turun tajam hingga 2,0 setelah 10 hari

inkubasi, sedangkan pemakaian urea sebagai sumber nitrogen menyebabkan pH

sedikit meningkat hingga 5,0 – 6,0. Kessell dalam Debby dkk. (2003) melaporkan

bahwa kapang tersebut dapat tumbuh dan menghasilkan kandungan lipid yang

sama baik pada pH 4,0 maupun 8,0.

2.8.3. Kadar air

Mikroorganisme memerlukan air untuk hidup dan berkembang biak. Oleh

karena itu, pertumbuhan sel mikroorganisme dalam suatu substrat sangat

dipengaruhi oleh kadar air yang tersedia. Selain merupakan bagian terbesar dari

komponen sel (70-80%), air juga dibutuhkan sebagai reaktan dalam berbagai

reaksi biokimia. Tersedianya air di dalam suatu bahan dapat dinyatakan dengan

istilah aw (aktivitas air). Setiap mikroorganisme memiliki kebutuhan aw minimal

yang berbeda-beda. Kapang membutuhkan aw untuk germinasi spora aseksual.

Nilai aw untuk germinasi spora adalah 62% untuk beberapa kapang. (Fardiaz,

1992).

Dalam kaitannya dengan fermentasi, air merupakan hal yang sangat

penting dalam fermentasi substrat padat. Pada fermentasi substrat padat biasanya

diperlukan keadaan yang cukup lembab sekitar 60% (Retno, 2005). Jang et al.

23

(2000) melaporkan bahwa kadar air optimum untuk produksi asam lemak tak

jenuh pada kapang Mortierella alpina yaitu antara 65%-68%.

2.8.4 Kelarutan Oksigen

Konsentrasi oksigen dalam substrat mempengaruhi tumbuhnya

mikroorganisme. Mikroorganisme dapat dibedakan berdasarkan kebutuhan akan

oksigen untuk pertumbuhannya, yaitu mikroorganisme yang bersifat aerobik,

anaerobik, dan anaerobik fakultatif. Kapang pada umumnya bersifat aerobik.

Respirasi aerobik adalah reaksi oksidasi substrat menjadi CO2 dan air,

membentuk energi dalam bentuk ATP (Fardiaz, 1992).

2.8.5. Waktu Inkubasi

Waktu inkubasi erat hubungannya dengan kesempatan mikroorganisme

untuk memanfaatkan nutrisi yang tersedia pada medium dan efektivitas sistem

metabolisme mikroorganisme dalam memanfaatkannya. Fase pertumbuhan

mikroorganisme terbagi dalam fase adaptasi, fase pertumbuhan awal, fase

logaritmik, fase pertumbuhan lambat, fase pertumbuhan stasioner, dan fase

kematian (Fardiaz, 1992). Menurut Nawangsari (1996), waktu inkubasi

mikroorganisme oleaginous terbaik berada pada fase stasioner dan tidak boleh

melebihi fase kematian. Untuk produksi asam lemak tak jenuh, diharapkan pada

akhir waktu inkubasi akumulasi asam lemak sudah mencapai titik maksimum.

Debby dkk. (2003) melaporkan bahwa produksi lipid pada kapang

Aspergillus terreus dalam substrat onggok-ampas tahu mencapai maksimum

setelah 6 hari inkubasi. Selanjutnya dari penelitian Nakajima et al. dalam Leman

24

(1997), diketahui bahwa kondisi optimum untuk meningkatkan kandungan asam

gamma linolenat dari kapang Mortierella alpina yaitu pada masa inkubasi 6-7 hari

dalam kultur terendam. Namun berbeda dengan Jang et al. (2000) yang

melaporkan bahwa produksi asam lemak tak jenuh oleh Mortierella alpina

meningkat pada 8-12 hari inkubasi, sedangkan Razavi et al. (2007) melaporkan

bahwa produksi asam lemak dari Sporobolomyces ruberrimus mencapai

maksimum pada waktu inkubasi 4 hari.

2.8.6. Nutrisi

Mikroorganisme membutuhkan nutrisi dalam melakukan metabolisme.

Nutrisi yang dibutuhkan mikroorganisme untuk tumbuh diantaranya adalah

karbon, nitrogen, dan mineral. Karbohidrat merupakan substrat karbon terbaik

untuk pertumbuhan kapang dan hingga 20% yang tersedia dikonversi menjadi

lipid. Kemampuan mengkonversi karbohidrat menjadi lipid bervariasi pada setiap

kapang. Pada beberapa kapang, glukosa merupakan karbohidrat yang efisien

untuk diubah menjadi lipid. Karbohidrat yang berlebih pada substrat dikonversi

oleh mikroorganisme menjadi lipid tanpa poliferasi sel lebih lanjut (Ratledge,

1992).

Berbagai hasil dan limbah pengolahan hasil pertanian dapat digunakan

sebagai sumber karbon, diantaranya adalah umbi-umbian, onggok, bekatul, dedak,

dan gandum ( Muljono dkk., 1992). Sedangkan sumber nitrogen yang digunakan

dapat berupa organik maupun anorganik. Sumber nitrogen dapat berasal dari

pepton, ekstrak khamir, urea, ammonium nitrat, ammonium sulfat, natrium nitrat,

25

dan kalium nitrat. Menurut Hansson et al. dalam Debby dkk. (2003), jumlah N

terbatas akan merangsang dominasi asam oleat.

Selain karbon dan nitrogen, akumulasi lipid pada kapang juga dipengaruhi

oleh kandungan mineral. Fosfat, kalsium, kalium, sulfur dan magnesium

merupakan mineral utama untuk pertumbuhan kapang. Ion Mg2+, Mn2+, Fe2+,

Ca2+, Cu2+, dan Zn2+ telah dilaporkan dapat mempengaruhi produksi lipid dan

asam arakidonat (ARA), serta asam gamma linolenat (GLA) pada Mortieralla

rammanniana var rammaniana. Selain itu diketahui bahwa penambahan Cu2+ dan

Zn2+ dapat menstimulasi produksi lipid pada berbagai spesies kapang Mortierella

(Leman, 1997). Produksi asam lemak tak jenuh dari Rhizopus nigricans juga telah

dipelajari. Diantara banyak mineral yang ditambahkan pada medium PDA, KCl

merupakan mineral yang paling efektif untuk meningkatkan produksi asam lemak

tak jenuh (Kakali et al., 2003).

Sajbidor et al. dalam Leman (1997) melaporkan bahwa Fe2+ dapat

menghambat secara kuat terhadap akumulasi lipid pada kapang Mortierella sp.

Akumulasi lipid dalam sel memerlukan nitrogen (N) yang terbatas, fosfor (P),

seng (Zn), besi (Fe), atau magnesium (Mg) yang memungkinkan mensuplai

kelebihan karbon (C) yang akan diubah menjadi lemak. Dengan demikian, sintesis

lipid dengan hasil terbaik diperoleh di bawah kondisi yang membatasi nitrogen

(Ghanem et al. dalam Razavi et al, 2007).

Kekurangan nutrisi tersebut dapat menimbulkan masalah metabolisme sel

mikroorganisme. Ketersediaan nutrisi yang terbatas menyebabkan pertumbuhan

sel mikroorganisme terbatas pula sehingga efisiensi produksi lipid tidak optimal.

26

Media pertumbuhan yang baik untuk menghasilkan lipid adalah dengan

kandungan nitrogen rendah dan karbon tinggi (Ratledge, 1992).

2.9 Biosintesis Lipid Pada Mikroorganisme Oleaginous

Akumulasi lipid pada sebagian mikroorganisme oleaginous yang tumbuh

mengikuti pola dua tahap. Tahap pertama ialah perkembangbiakan sel yang

tumbuh dengan laju maksimum. Tahap ini berlangsung terus sampai nitrogen dan

nutrisi lainnya telah habis kecuali karbon. Pembentukan sel-sel baru yang

membutuhkan sintesis protein seperti RNA dan DNA tidak dapat diteruskan

harena habisnya nitrogen (fosfat atau nutrien lainnya). Setelah itu, karbon yang

berlebih terutama glukosa akan terus dikonsumsi dan dikonversi oleh

mikroorganisme oleaginous menjadi lipid yang terakumulasi pada jaringan

intraseluler (Ratledge, 1992). Adapun skema perubahan glukosa menjadi lipid

dalam mikroorganisme oleaginous dapat dilihat pada Gambar 2.4.

27

Gliserol

Gliserol

Piruvat

Oksaloasetat

CO2 + ATP

ADP + Pi

NADH

NAD+

Piruvat Karboxilase

Malat dehidrogenase

MalatEnzim Malat

NADPH

NADP+

Piruvat

Asetil Ko-A

Sitrat

Piruvat dehidrogenase

Sitrat sintase

Oksaloasetat

Piruvat Karboxilase

Isositrat

2-Oksaloglutarat

Akonitase

Isositrat dehidrogenase

SitratAsetil Ko-A

Oksaloasetat

ATP sitrat liase

MalatMalat dehidrogenase

Malat

Malat dehidrogenase

AMPMalonil Ko-A

Asetil Ko-A karboxilase

Triasilgliserol

Glukosa

Fruktosa 6-fosfat

Fruktosa 1,6-bifosfat

Fosfoenolpiruvat

Piruvat kinaseMitokondria

Siklus asam trikarboksilik

Gambar 2.4. Skema Biosintesis Lipid dalam Mikroorganisme Oleaginous

(Ratledge dan Wynn dalam Makri et al., 2008).

Rangkaian tahapan proses biosintesis lipid tersebut adalah sebagai berikut:

1. Ketika nitrogen habis dalam substrat, konsentrasi AMP (Adenosin

Monophospat) intraseluler menjadi menurun dan akibatnya isositrat

dehidrogenase akan berhenti fungsinya karena aktivitasnya sangat

tergantung pada AMP tersebut. enzim ini merupakan syarat mutlak yang

harus dimiliki oleh mikroorganisme oleaginous (Botham et al. dalam

Ratledge dan Wynn, 2002).

28

2. Isositrat tidak dimetabolisme melalui siklus asam trikarboksilik dan

kemudian isositrat dan sitrat akan terbentuk. Penghentian aktivitas isositrat

dehidrogenase dengan cepat mengarah kepada pembentukan sitrat sebagai

isositrat, lalu dengan cepat menyeimbangkan dengan sitrat melalui

akonitase (Ratledge dan Wynn, 2002).

3. Sitrat diangkut keluar dari mitokondria lalu masuk ke dalam sitoplasma

yang dirubah menjadi asetil KoA dan oxaloasetat untuk biosintesis lipid

oleh ATP sitrat liase. ATP sitrat liase merupakan enzim yang hanya

dimiliki oleh mikroorganisme oleaginous yang bertanggung jawab atas

terbentuknya asetil KoA yang diperlukan untuk menghasilkan lipid.

Keberadaan enzim ini yang menjelaskan setiap mikroorganisme

oleaginous memiliki kemampuan yang berbeda-beda dalam

mengakumulasi lipid (Ratledge dan Wynn, 2002).

4. Pengangkutan sitrat keluar dari mitokondria dihubungkan dengan malat

yang berlawanan tanda panahnya. Malat ini dihasilkan dari oxaloasetat.

Banyaknya lipid yang terakumulasi juga dikontrol oleh aktivitas enzim

malat yang bertindak sebagai satu-satunya sumber NADPH yang

bergabung dengan asam lemak sintetase. Jika enzim malat dihambat, atau

secara genetis cacat, maka akumulasi lipid sangat rendah (Ratledge dan

Wynn, 2002).

29

2.10 Enzim Yang Dihasilkan Oleh Mikroorganisme Oleaginous

Mikroorganisme oleaginous menghasilkan banyak enzim dari aktivitas

metabolismenya. Ada beberapa enzim yang dapat mengkatalis pembentukan asam

lemak tak jenuh, diantaranya adalah desaturase dan elongase.

2.10.1 Desaturase

Desaturase adalah enzim yang dapat mengkatalis pembentukan ikatan

rangkap rantai karbon asam lemak, sehingga sangat berperan dalam pembentukan

asam lemak tak jenuh tunggal maupun majemuk (Cahoon et.al. dalam Panji dkk.,

2005). Ada beberapa jenis enzim desaturase yang diketahui, diantaranya ∆9, ∆12,

∆5, dan ∆6 desaturase (Ratledge dan Wynn, 2002).

1. ∆9 Desaturase

∆9 Desaturase adalah enzim yang mengkatalis reaksi pembentukan ikatan

rangkap pertama ke dalam asam lemak jenuh antara karbon nomor 9 dan

10 dari rantai asam lemak. ∆9 Desaturase dapat bekerja pada salah satu

asam lemak jenuh yang dominan, misalnya palmitat (16:0) dan stearat

(18:0) menjadi palmitoleat atau oleat. ∆9 Desaturase dari mikroorganisme

muncul untuk memanfaatkan 18:0. Enzim ini merupakan satu-satunya

enzim yang mengkatalis asam lemak jenuh.

2. ∆12 Desaturase

∆12 Desaturase mengkatalis reaksi konversi dari asam oleat (18:1ω-9)

menjadi asam linoleat (18:2ω-6) dengan menyisipkan ikatan rangkap

antara karbon nomor 12 dan 13 dari asam lemak tak jenuh tunggal.

30

3. ∆5 Desaturase

∆5 Desaturase mengkatalis reaksi konversi dari asam dihomo gamma

linolenat (20:3ω-6) menjadi arakidonat (20:4ω-6) atau asam

eikosatetraenoat (20:4 ω -3) menjadi eikosapentaenoat (20:5ω-3).

4. ∆6 Desaturase

∆6 Desaturase adalah enzim yang mengkatalis reaksi konversi asam

linoleat (18:2ω-6) menjadi asam gamma linolenat (18:3ω-3). Selain itu

mengkonversi asam gamma linolenat (18:3ω-3) menjadi stearidonat

(18:4ω-3).

Secara umum reaksi pembentukan ikatan rangkap yang dikatalis oleh

enzim desaturase dapat dilihat pada Gambar 2.5.

CH3(CH2)7 C C

H

H

H

H

(CH2)7 KoA

O2 + NADH + H+

NAD+ + 2H2O

CH3(CH2)7 C C

H H

(CH2)7 KoA

Enzim Desaturase

Gambar 2.5. Reaksi pembentukan ikatan rangkap yang dikatalis oleh enzim desaturase (Mayes dan Kathleen, 1999).

31

S

R

O

A K o(n karbon )

3-ketoasil-K oA s in te tase

O H

O

S

O

A K o

A sil-K oA

M alon il-K oA

A K o S H + C O2

R

O

S

O

A K o

N A D PH

N A D P

3-ketoasil-K oA reduk tase

S

O

A K o

O H

K etoasil-K oA

3-H idroksiasil-K oA

H 2O

S

O

A K o

3-H idroksiasil-K oA deh id ratase

(E )-2 ,3 -eno il-K oA

N A D PH

N A D P

(E )-2 ,3 -eno il-K oAreduk tase

S

O

A K oR(n+2 karbon)A sil-K oA

2.10.2 Elongase

Elongase adalah enzim yang sangat berperan dalam pembentukan asam

lemak berantai panjang. Pemanjangan rantai karbon terjadi melalui

penambahan 2 atom karbon secara berturut-turut pada asil KoA. Senyawa

yang berfungsi sebagai donor 2 atom C adalah malonil KoA. Reaksi

pemanjangan rantai karbon pada asil KoA oleh elongase ditunjukkan pada

Gambar 2.6.

Gambar 2.6. Reaksi penambahan rantai karbon pada asam lemak yang

dikatalisis elongase (Puyaubert et al., 2005).

32

Berdasarkan Gambar 2.6 dapat dilihat bahwa tahapan-tahapan reaksi yang

terjadi adalah reaksi kondensasi pada malonil KoA dan Asil KoA oleh 3-ketoasil-

KoA sintetase menghasilkan ketoasil-KoA, kemudian direduksi oleh 3-ketoasil-

KoA reduktase yang menghasilkan 3-hidroksil-KoA. Selanjutnya 3-hidroksil-KoA

diubah menjadi 2,3-enoil-KoA oleh 3-hidroksil-KoA dehidratase. Reaksi terakhir

adalah reduksi kedua yang dikatalis oleh 2,3-enoil-KoA reduktase yang

menghasilkan dua atom karbon pada asil-KoA (Puyaubert et al., 2005).

2.11 Proses Transesterifikasi

Proses transesterifikasi disebut juga alkoholisis merupakan reaksi

pertukaran antara alkohol dengan suatu ester untuk membentuk ester lain dalam

suatu proses yang menyerupai hidrolisis. Pada proses transesterifikasi digunakan

alkohol sebagai pengganti air. Alkohol yang dapat digunakan diantaranya

metanol, etanol, propanol, dan butanol. (Fukuda et al, 2001).

Transesterifikasi merupakan reaksi bolak-balik dan pada dasarnya

merupakan proses pencampuran reaktan. Adanya katalis dapat mempercepat

jalannya reaksi. Katalis yang dapat digunakan dalam transesterifikasi diantaranya

katalis asam, basa, maupun enzimatis (Kumar et al, 2007).

Pada prinsipnya proses transesterifikasi adalah mengeluarkan gliserin dari

minyak dan mereaksikan asam bebasnya dengan alkohol (misalnya metanol)

menjadi alkohol ester/ Fatty Acid Methyl Ester. Metil ester asam lemak yang

diperoleh melalui transesterifikasi bersifat stabil dan relatif nonpolar serta dapat

digunakan untuk analisis menggunakan alat GCMS.

33

1. Trigliserida (TG) + R'OH Digliserida (DG) + R'COOR1

katalis

Monogliserida (MG)2. Digliserida (DG)

R'OH

R'OH

+

+

katalis

katalis

+

+

R'COOR3

R'COOR2

3. Monogliserida (MG) Gliserol (GL)

Secara umum reaksi transesterifikasi menggunakan alkohol dapat dilihat

pada Gambar 2.7.

Gambar 2.7. Reaksi transesterifikasi secara umum

Pada dasarnya reaksi transesterifikasi merupakan reaksi bolak-balik.

Menurut Fukuda et al. (2001) reaksi transesterifikasi terjadi melalui beberapa

tahapan, yaitu langkah pertama adalah perubahan trigliserida menjadi digliserida,

diikuti dengan perubahan digliserida menjadi monogliserida, monogliserida

menjadi gliserol. Pada setiap langkahnya, tiap gliserida menghasilkan satu

molekul metil ester asam lemak. Reaksi bolak-balik dalam proses transesterifikasi

dapat dilihat pada Gambar 2.8.

Gambar 2.8. Reaksi bolak-balik dalam proses transesterifikasi

Adapun mekanisme reaksi transesterifikasi berkatalis asam pada minyak

tumbuhan menurut Schuchardt et al. (1998) dapat dilihat pada Gambar 2.9.

CH2R1COO HO

CH2

CHR2COO

R3COO

+ 3R'OHR1Katalis

R3

R2 COOR'COOR'

COOR'

+

CH2

CH2

CH

HO

HO

Trigliserida Alkohol Ester asam lemak Gliserol

34

CH2

O

R1COO

CH2

CHR2COO

CR3

O

BF3

CH2

O

R1COO

CH2

CHR2COO

CR3

OBF3

CH2

O

R1COO

CH2

CHR2COO

CR3

OBF3

Tahap 1

CH2

O

R1COO

CH2

CHR2COO

CR3

OBF3

+ O

H

R

CH2

O

R1COO

CH2

CHR2COO

CR3

O

RH

OF3B

H- BF3

CR3

OR

OCH2R1COO

CHR2COO

O CH2

+

H+

CR3

OR

OCH2R1COO

CHR2COO

HO CH2

+

Tahap 2

Tahap 3

Ester asam lemak Digliserida

Trigliserida

Gambar 2.9. Mekanisme reaksi transesterifikasi berkatalis asam

Tahap pertama (1) adalah protonasi oleh katalis asam pada gugus karbonil

dari ester yang menghasilkan karbokation. Tahap kedua (2) serangan nukleofilik

dari alkohol pada karbokation yang menghasilkan tetrahedral intermediet. Tahap

ketiga (3) eliminasi digliserida dan membentuk metil ester asam lemak serta

dihasilkan kembali katalis asam. Digliserida dan monogliserida diubah melalui

mekanisme reaksi yang sama untuk menghasilkan metil ester asam lemak dan

gliserol.