pemisahan dengan kromatografi kolom

8/18/2019 Pemisahan Dengan Kromatografi Kolom

1/14

PEMISAHAN DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

Nama

Lab. Fitokimia Farmasi

Fakultas Ilmu kesehata !i"ersitas Muhamma#i$ah Mala%

A&STRAK


2/14

I. PENDAH!L!AN

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat

dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa,

dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi

analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi

preparatif hanya dilakukan juka diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan

secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat

fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah : (! "ecenderungan

molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan!, (#! "ecenderungan molekul untuk

melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan!, dan ($! "ecenderungan

molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian!.

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan

menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik

tersebut. "eempat teknik kromatografi itu adalah : "romatografi "ertas (""t!,

"romatografi %apis &ipis ("%&!, "romatografi 'as air ("'! dan "romatografi

air "inerja &inggi (""&!.

Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan

dan keatsirian senya)a yang akan dipisah. ""t dapat digunakan terutama bagi

kandungan tumbuhan yang mudah larut dalam air (karbohidrat, asam amino dan

senya)a fenolat!, "%& merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua

kandungan yang larut lipid (lipid, steroid, karotenoid, kinon sederhana dan klorofil!,

"' penggunannya terutama untuk senya)a atsiri (asam lemak, mono- dan

seskuiterpen, hidrokarbon dan senya)a belerang!, cara lain yaitu ""&, dapat

memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. ""& adalah suatu metode yang

menggabungkan keefisienan kolom dan kecepatan analisis. (#!

Pada bagian selanjutnya akan dibahas mengenai beberapa cara penggunaan

kromatografi kolom baik kolom kon*ensional maupun kolom *akum.

II.KROMATOGRAFI KOLOM

"romatografi kolom termasuk kromatografi cairan, adalah metoda


3/14

pemisahan yang cukup baik untuk sampel lebih dari gram. Pada kromatografi

ini sampel sebagai lapisan terpisah diletakkan diatas fase diam. Biasanya

sampel dihomogenkan dengan fase diam sehingga merupakan serbuk kering,

diatas

lapisan ini dapat diletakkan pasir untuk menjaga tidak terjadinya

kerusakan )aktu ditambahkan fase gerak diatas lapisan sampel. +ase diam dan

sampel ini berada di dalam kolom yang biasanya dibuat dari gelas, logam ataupun

plastik. Selama elusi fase gerak dialirkan dari atas, mengalir karena gaya gra*itasi

atau ditekan dan juga disedot dari arah ba)a. "omponen sampel akan

terpisah selama bergerak diba)a fase gerak didalam kolom (fase diam!. "omponen

yang paling tidak tertahan oleh fase diam akan keluar lebih dahulu dan diikuti

oleh

komponen lain. Semuanya ditampung sebagai fraksi, *olume tiap fraksitergantung besarnya sampel (kolom!.

"olom biasanya berbentuk seperti buret untuk titrasi, ukurannya

beragam. Perbandingan panjang kolom sekurang-kurangnya kalinya

diameternya, perbandingan ini tergantung mudah tidaknya komponen dipisahkan.

Perbandingan berat sampel dan fase gerak ( : $! biasanya cukup memadai

untuk pemisahan yang mudah, perbandingan dapat ditingkatkan hingga (:!

untuk komponen yang susah dipisahkan.

Fase Diam

kuran partikel fase diam bisanya lebih besar dari ukuran partikel fase

diam untuk "%&, ukuran yang digunakan antara /$-#0iim. kuran partikel lebih

kecil /$ jam fase gerak akan mengalir lebih lambat, sehingga perlu ditekan

atau dihubungkan dengan pipa hisap. Silika gel (Si1i! adalah fase diam yang

serba guna, banyak digunakan. Pada pembuatannya silika gel perlu diaktifkan

panaskan pada -/2 selama $-3

jam. +ase diam lain adalah alumina.

Pemiliha Fase %erak '(elarut)sol"e ) elue*

Pemilihan fase gerak sangat menentukan berhasil tidaknya pemisahan. ntuk

menentukan fase gerak yang akan digunakan, dilakukan pendekatan:


4/14

. Penelusuran literature4pustaka.

#. Mencoba dengan "%&.

ara ini dikerjakan dengan memilih fase diam "%& sejenis dengan fase

diam kolom yang akan digunakan. Biasanya dicoba dikembangfcan

dengan fase gerak non polar kemudian diikuti dengan fase gerak yang

lebih polar.

III. METODE KROMATOGRAFI KOLOM

5. Membuat kolom (packing!

Pengemasan kolom dapat dilakukan dengan cara basah atau cara kering.

ara

basah lebih mudah untuk memperoleh packing yang memberikan pemisahan yang baik. Sedangkan cara kering umumnya dilakukan untuk

alumina.

. ara basah

"edalam ujung kolom kromatografi (tempat keluarnya fase diam!

diatas keran diletakkan gelas )ool, tidak perlu ditekan kuat. 6iatasnya

ditaburkan pasir sehingga membentuk lapisan tebal 7 cm. Selanjutnya

dimasukkan petroleum eter sambil mencoba kecepatan menetes fase gerak

dengan memutar keran. 6i

dalam beker gelas dibuat bubur fase diam

dengan petroleum eter. 6engan bantuan batang pengaduk bubur

dimasukkan kedalam kolom berisi petroleum eter. Sambil diketuk-ketuk

butir-butir fase diam akan turun dan tersusun rapi didalam kolom. Bila

kolom penuh dengan petroleum eter keran dibuka untuk menurunkan

permukaannya dan petroleum eter yang keluar dapat digunakan lagi

untuk membuat bubur fase diam. Packing dihentikan sampai panjang kolom

yang dikehendaki. Selapis pasir diletakkan pada packing kolom untuk

melindungi kolom.

"olom dijaga untuk tidak kering, maka diatas lapisan pasir haras

selalu ada selapis fase gerak . Pada proses packing ini dinding luar kolom

gelas disemprot dengan aseton. Penyemprotan dimaksudkan untuk


5/14

mendinginkan kolom sehingga menghambat terbentuknya gelembung

udara. 5dapun untuk kolom yang diameternya kecil fase diam kering

dapat ditaburkan sedikit demi sedikit kedalam kolom yang berisi

petroleum eter. "olom ini digunakan setelah disimpan semalam.

#. ara kering

Selapis pasir diletakkan didasar kolom, kemudian fase gerak

dimasukkan lapis demi lapis sampil ditekan dengan karet atau alat

penekan lain. Selain ditekan dapat juga dibantu dengan dihisap, sehingga

dihasilkan packing fase diam yang mampat. 6iatas fase diam diletakkan

kertas saring dan diatasnya lagi sdapis pasir. Pada posisi keran terbuka

fase gerak dituangkan dan dibiarkan mengalir

keluar. Packing kolomdisimpan dengan mempertahankan selapis fase gerak berada diatas

lapisan pasir.

B. Penyiapan Sampel

Sampel ditimbang kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai,

kemudian dituangkan hati-hati diatas packing kolom. +ase gerak

dikeluarkan tetes demi tetes, diatur kecepatan menetesnya (tergantung besar-

kecilnya kolom! dan

dijaga kolom tetap terendam, untuk itu ditambah fase

gerak perlahan-lahan dan dijaga tidak merusak packing kolom. +ase gerak

yang keluar ditampung sebagai fraksi. 8olume fraksi tergantung berat

sampel dan pemisahan yang nampak pada kolom saat proses a)al elusi ini.

Makin kecil *olume fraksi, akan diperoleh pemisahan yang lebih baik,

namun akan dikumpulkan banyak fraksi. ntuk gram sampel biasanya

dikumpulkan fraksi dengan *olume a ml.

ara meletakkan sampel pada kolom yang lebih baik adalah

dengan mencampur dengan fase diam. Satu bagian sampel dilarutkan

dalam pelarut yang sesuai, biasanya pelarut yang digunakan adalah pelarut

yang digunakan untuk pembuatan ekstrak. %arutan ekstrak ini kemudian

dicampur dengan #,-$. bagian fase diam, dengan hati-hati campuran ini


6/14

dikeringkan didalam rotary e*aporator hingga diperoleh serbuk ekstrak

kering. Serbuk ini ditaburkan diatas packing kolom dan ditutup dengan

selapis pasir. Selanjutnya sampel siap dielusi.

. 9lusi (pengembangan!

+ase gerak (cairan pelarut pengembang!

+ase gerak dimasukkan kedalam kolom dengan cara dituangkan

sedikit demi sedikit atau dialirkan dari bejana yang diletakkan diatas

kolom sehingga fase gerak mengalir dengan sendirinya. ara yang

praktis adalah dengan memasukkan kedalam corong pisah, ujung corong

pisah dimasukkan kedalam

kolom dan ujung lain tertutup, sedangkan keranterbuka. +ase gerak akan keluar dengan sendirinya sesuai dengan keluarnya

fase gerak dari kolom. 6ibedakan dua jenis cara elusi:

+ Elusi isokratik yaitu selama proses elusi menggunakan fase gerak dengan

polaritas tetap.

+ Elusi %ra#ie (bertahap! yaitu selama proses elusi menggunakan fase

gerak berubah-ubah polaritasnya. ntuk membuat polaritas berubah-

ubah maka komposisi fase gerak berubah. Pada umumnya dimulai fase

gerak non

polar kemudian berubah kepelarut yang polar. Perubahan ini

dapat diprogramkan sesuai dengan pemisahan yang diinginkan.


7/14

'ambar 6iagram pemisahan dua komponen pada kromatografi kolom

9lusi dihentikan jika sudah tidak ada lagi sampel yang dapat diba)a

keluar lagi oleh fase gerak, bila digunakan elusi gradien sudah sampai

pada fase gerak yang paling polar.

6. Mendeteksi komponen yang dipisahkan

"romatografi kolom yang kon*ensional tidak dilengkapi detektor,

namun sekarang dapat digunakan dengan mengalirkan eluate (efluen! pada

detektor untuk mendeteksi komponen. ;ang umum digunakan dan mudah

dikerjakan adalah dengan memonitor fraksi dengan "%&. +raksi yang

mempunyai profil bercak "%& yang mirip digabungkan. Selanjutnya

gabungan ini dapat dianalisis lebih lanjut.

I,. KROMATOGRAFI KOLOM ISAP

• Su-tio olom


8/14

yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi.

• Ra(i#+Si%el


9/14

dengan kolom kon*ensional karena pada kolom mikrobor kecepatan

alir fase gerak lebih lambat (-=l4menit!

#. 5danya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal jika digabung dengan spectrometer massa

$. Sensiti*itas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel

terbatas missal sampel klinis

"erugian "8 ("romatogra*i 8akum air! :

. Membutuhkan )aktu yang cukup lama

#. Sampel yang dapat digunakan terbatas

'ambar "romatografi "olom 8akum @


10/14


11/14

'ambar "romatografi "olom "on*ensional :


12/14

,. KESIMP!LAN

a. Metode isolasi yang dapat digunakan untuk senya)a yang terkandung

dalam bahan alam adalah :

A "%& preparati*e

A "romatografi "olom

A "'

A ""&

b. "romatografi kolom kon*ensional memiliki berbagai keterbatasan dalam

penggunannya, kromatografi kolom *akum dapat meningkatkan laju

pengelusian dan mempersingkat )aktu kontak linarut dengan penjerap

,I. SARAN


13/14

DAFTAR P!STAKA

onners.5.". Pharmaceutical Analysis” Solvent Extraction.

. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka

Pelajar: ;ogyakarta.

D. B. Earbone. F>G. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis

um!uhan. Penerbit


14/14

pemisahan dengan kromatografi kolom

Documents