Oleh :

SANDRA HERMANTO, M.Si.

BEBERAPA TEKNIK PEMISAHAN

Distilasi Kristalisasi Filtrasi Sentrifugasi Ekstraksi Kromatografi Elektroforesis

DISTILASI

• Proses pemisahan secara fisik bukan reaksi kimia• Didasarkan pada perbedaan titik didih/tekanan uap.• Contoh :

Destilasi sederhana (Pemisahan alkohol hasil fermentasi, pemurnian air laut, dll).Distilasi bertingkat ( Pemisahan fraksi-fraksi minyak bumi)Distilasi uap (pemisahan komponen atsiri, dll)

Distillation is a method of separating mixtures based on differences in their volatilities in a boiling liquid mixture .

PERANGKAT ALAT DISTILASI SEDERHANA

distilasi fraksinasi vs distilasi uap

SEJARAH DISTILASI• Bangsa Babilonia & India, FERMENTASI ALKOHOL (150 BC - 350 AD).• Jabir ibn Hayyan, (700-800 AD), Isolasi dan pemurnian senyawa kimia

(ex. Ester dan metanol/etanol)• Muhammad ibn Zakarīya Rāzi (Rhazes) Abad ke-9, Produksi kerosin dari

minyak bumi.• Ibnu Siena, Abad ke-11 (Produksi minyak atsiri via distilasi uap).• Awal abad 19, pengembangan teknik modern (pre-heating, fractination

and reflux).• British Patent, 1830 Pengembangan kolom fraksinasi untuk distilasi

wiski/minuman keras.• Ernest Solvay, 1877, US. Paten untuk distilasi ammonia.

Aplikasi teknik distilasi• The application of distillation can roughly be divided in four

groups: laboratory scale, industrial distillation, distillation of herbs for perfumery and medicinals (herbal distillate), and food processing.

KRISTALISASICrystallization is the (natural or artificial) process of formation of solid crystals precipitating from a solution, melt or more rarely deposited directly from a gas. Crystallization is also a chemical solid-liquid separation technique, in which mass transfer of a solute from the liquid solution to a pure solid crystalline phase occurs.

The crystallization process consists of two major events, nucleation and crystal growth. Nucleation is the step where the solute molecules dispersed in the solvent start to gather into clusters, on the nanometer scale, that becomes stable under the current operating conditions. These stable clusters constitute the nuclei. However when the clusters are not stable, they redissolve. Therefore, the clusters need to reach a critical size in order to become stable nuclei. Such critical size is dictated by the operating conditions (temperature, supersaturation, etc.)

APLIKASI KRISTALISASI• The fast expansion of the chemical

industry has required a thorough study of the dynamics of crystallization, and this unit operation is now used in many industrial manufacturing areas: table salt, sugar, sodium sulfate, urea, just to name a few, are produced by crystallization from solutions.

• Crystallizer technology has progressed alongside with the new processes. Once simple tanks in which, through cooling, evaporation or maybe through pH variation a crystal was obtained, nowadays continuous machines ensure a remarkable consistency in the product characteristics.

ULTRAFILTRASI

• Ultrafiltration (UF) is a variety of membrane filtration in which hydrostatic pressure forces a liquid against a semipermeable membrane. Suspended solids and solutes of high molecular weight are retained, while water and low molecular weight solutes pass through the membrane.

Prinsip kerja ultrafiltrasi

PERBANDINGAN UKURAN MOLEKUL

APLIKASI • Dialysis and other blood treatments • Concentration of milk before making cheese • Fractionation of proteins • Clarification of fruit juice • Recovery of vaccines and antibiotics from fermentation broth • Laboratory grade water purification • Wastewater treatment • Drinking water disinfection (including removal of viruses) • Removal of endocrines and pesticides combined with

Suspended Activated Carbon pretreatment

SENTRIFUGASIA centrifuge is a piece of equipment, generally driven by an electric motor (but some older models are still spun with hand), that puts an object in rotation around a fixed axis, applying a force perpendicular to the axis. The centrifuge works using the sedimentation principle, where the centripetal acceleration causes heavier particles to move out along the radial direction (the bottom of the tube).

F = mw2r or RCF = (1.118x10-5)(rpm)2(r)

F = intensitas gaya sentrifugal

m = massa efektif partikel

w = kecepatan rotasi dalam rad/det

r = jarak migrasi partikel dari sumbu rotasi

RCF = Relatif Centifugal Force

MACAM-MACAM ALAT SENTRIFUGE

Clinical centrifuge Microcentrifuge High Centrifuge

Ultracentrifuge

Faktor-faktor yang mempengaruhi kec. sedimentasi partikel :

1. Massa, bentuk dan ukuran partikel

2. Densitas partikel

3. Densitas medium

4. Kecepatan (rpm) yang digunakan

SEJARAH PENGGUNAAN ALAT SENTRIFUGE

• Antonin Prandtl, 1864, invented the first dairy centrifuge in order to separate cream from milk.

• Gustaf de Laval 1879, demonstrated the first continuous centrifugal separator, making its commercial application feasible.

INSTRUMENTASI SENTRIFUGE• Komponen dasar Sentrifuge terdiri dari 2 komponen yaitu motor

elektrik dan rotor sebagai tempat untuk menyimpan tabung/ sampel.

Tipe-tipe alat sentrifuge dan aplikasinya :

Koefisien sedimentasi

Koefisien Sedimentasi (S) : kecepatan sedimentasi per satuan waktu.

S = v/ω2r = mo(1-v ρ)/f

1 S = 1x10-13 detik

Konversi dari RPM ke RCF

Jenis Rotor

Fixed angle vs Swinging Bucket

APLIKASI SENTRIFUGASI

• ISOLASI & PEMISAHAN BIOMOLEKUL (DNA, PROTEIN, RNA)

• ISOLASI & PEMISAHAN ORGANEL SEL (RIBOSOM, INTI SEL, PLASMID)

• ISOLASI ENZIM, CLINICAL DIAGNOSYS

• DLL

Troubleshooting

HAL-HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN• Baca Operating Manual Sebelum Menggunakan.• Tentukan kondisi operasional (suhu, waktu, rpm/rcf).• Pemilihan jenis rotor/ tipe dan ukuran.• Pastikan rotor bersih dan tdk rusak.• Tempatkan tabung dalam keadaan seimbang.• Gunakan kecepatan putaran sesuai dengan kapasitas rotor.

EKSTRAKSI

EKSTRAKSI CAIR-CAIR

EKSTRAKSI CAIR-PADAT

EKSTRAKSI PADAT-CAIR

SOLID PHASE MICROEXTRACTION

DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI• Chromatography (from Greek χρώμα:chroma, color

and γραφειν: graphein to write) is the collective term for a set of laboratory techniques for the separation of mixtures.

• Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary (stationary phase) while the other (the mobile phase) moves in a definite direction.

• Chromatography is also be useful for identification. Each component moves a characteristic distance and can be identified by color or other property.

SEJARAH KROMATOGRAFIMikhail Semyonovich Tswett 1906, A Rusian Botanist who used columns of calcium carbonate for separating plant pigments during the first decade of the 20th century during his research of chlorophyll.

Classification of Chromatography

• Column Chromatography – the stationary phase is held in a narrow tube through which the mobile phase is forced under pressure or by gravity.

• Planar Chromatography – the stationary phase is supported on a flat plate or the interstices of a paper and the mobile phase moves through the stationary phase by capillary action or by gravity.

KROMATOGRAFI KOLOM VS PLANAR

Kromatografi kolomKromatografi Lapis Tipis

KROMATOGRAFI KERTAS & LAPIS TIPIS

Chromatogram of 10 essential oils coloured with vanillin reagent.

d1

d2

Rf = jarak yang ditempuh oleh senyawa (d1) jarak yang ditempuh oleh pelarut (d2)

APLIKASI KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

• Penentuan kemurnian senyawa• Penentuan komposisi suatu zat/ campuran.• Deteksi pestisida dan insektisida dalam makanan.• Analisa zat pewarna dalam beberapa kasus

forensik.• Analisis zat antioksidan.

JENIS DAN TIPEKROMATOGRAFI KOLOM

Mechanisms of Separation

(a) Partitioning (b) Adsorption(c) Exclusion(d) Ion Exchange(e) Affinity

(e)

BEBERAPA ISTILAH UMUM DALAM KROMATOGRAFI

• Analit : substansi zat (ion/molekul/senyawa) yang akan dipisahkan/ dianalisa dengan kromatografi.

• Fase diam (stasionary phase): suatu zat/material padat atau zat cair yang terimobilisasi dalam suatu matrik kolom dan memiliki sifat fisik tertentu (daya absortivitas, polaritas, porositas dan afinitas). Misalnya silika gel, alumina.

• Kromatogram : output visual yang dihasilkan dari suatu proses kromatografi. Biasanya muncul sebagai spot (planar chromatography) atau puncak-puncak (peaks) yang terpisahkan satu sama lain (column chromatography) berdasarkan perbedaan sifat fisikokimia dari masing-masing analit (polaritas, volatilitas, distribusi massa, densitas, dll.)

• Fase gerak (mobile phase) : material (zat cair atau campuran zat cair) atau gas yang bergerak dengan jarak dan arah tertentu dalam suatu matrik kolom atau lapisan fase diam selama proses kromatografi.

• effluent : fase gerak yang meninggalkan kolom.

Tipe kromatogram (a) peak (b) spot

BESARAN DALAM KROMATOGRAFI• Waktu retensi (tR) : waktu yang dibutuhkan oleh suatu analit untuk melewati suatu

sistem kromatografi hingga terdeteksi oleh detektor dalam suatu kondisi tertentu.• Retention factor (Rf) : Perbandingan jarak yang ditempuh oleh suatu analit dari

titik awal dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut/fase gerak dalam kromatografi planar.

• Faktor selektifitas () : faktor pemisahan yang merupakan rasio waktu retensi atau rasio k’ dari kedua puncak kromatogram yang nilainya dipengaruhi oleh jenis fase diam dan luas permukaan bahan pengisi kolom.

• Resolusi (Rs) : ukuran efektifitas pemisahan yang diperoleh dari perbandingan jarak kedua puncak kromatogram.

• Jumlah plat teoritis (N) : ukuran meluasnya pita kromatogram atau melebarnya puncak karena dipengaruhi jenis peralatan yang ada (panjang dan ukuran diameter kolom, luas permukaan dan keseragaman bentuk fase diam serta kecepatan alir fase gerak)

• HETP (H) : High Equivalent to Teoritical Plate, ukuran yang menunjukkan efisiensi kolom dalam proses pemisahan. H = L/N, dimana L = panjang kolom.

BESARAN DALAM KROMATOGRAFI

BESARAN DALAM KROMATOGRAFI

TEORI DASAR KROMATOGRAFI

• Kecepatan migrasi komponen adalah fungsi dari konstanta distribusi (KD),

• Komponen yang lebih menyukai berada dalam fase diam atau dengan nilai k lebih besar pada fase diam akan bermigrasi lebih lambat dari komponen yang memiliki nilai k lebih besar pada fase gerak.

• Perbedaan kemampuan berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak tersebut menyebabkan terjadi perbedaan kecepatan migrasi.

Pelat teoritis (Plate Theory)• Pelat teoritis adalah pelat imajiner dalam kolom yang

tebalnya sedemikian rupa, sehingga komponen dalam fase gerak yang keluar daripadanya mempunyai komposisi yang sama dengan andaikata benar-benar telah terjadi kesetimbangan partisi antara fase gerak dengan fase diam ditengah-tengah lapisan tersebut.

• Pelat teoritis dapat dianggap analog dengan satu tabung dari alat ekstraksi countercurrent Craig. Tebal dari pelat imajiner tersebut dikenal sebagai High Equivalent of Theoritical Plate (HETP) atau tinggi ekivalen pelat teoritis. HETP = L/N dan N = 16(tR/ω)2

Teori Kecepatan (Rate Theory) HETP = A + B/μ + Cμ dimana μ = kecepatan linier fase gerak• A = suku difusi Eddy yang mencerminkan reka-alur dari isi kolom.

Fase gerak dan komponen dapat bergerak melalui banyak jalur diantara butiran-butiran isi kolom. Pengaruh difusi Eddy dapat dikurangi dengan menggunakan isi kolom dengan butiran yang berbentuk sama, berukuran kecil dan disusun rapat serta rata di dalam kolom.

• B/μ = difusi longitudinal merupakan gaya-gaya difusi molekul yang menyebabkan molekul-molekul bergerak atau berdifusi dari bagian tengah pita ke kedua tepi pita.

• Cμ = suku pemindahan massa merupakan cerminan dari partisi komponen antara fase diam dan fase gerak.

Hubungan HETP dengan kecepatan linier fase gerak

Kondisi kromatografi yang memberikan nilai HETP kecil, apabila Nilai A biasanya kecil (kolom dipak dengan baik). Bila μ besar maka suku B/μ semakin kecil tetapi suku Cμ semakin besar. Pada μ optimum pengaruh ketiga suku setimbang satu sama lainnya dan nilai HETP menjadi minimum.