Macam-Macam Kromatografi

1. Ion Exchanger CromatographyMetode yang paling populer untuk pemurnian protein dan molekul lainnya yang dikenakan adalah kromatografi pertukaran ion. Dalam kromatografi penukar kation molekul bermuatan positif tertarik pada dukungan solid bermuatan negatif. Sebaliknya, dalam kromatografi pertukaran anion, molekul bermuatan negatif tertarik pada dukungan solid bermuatan positif. Mekanisme Untuk mengoptimalkan mengikat semua molekul bermuatan, fase gerak umumnya rendah konduktivitas menengah (yaitu, rendah untuk konsentrasi garam menengah) solusi. Adsorpsi molekul untuk dukungan yang solid didorong oleh interaksi ionik antara kelompok ionik malah dibebankan dalam molekul sampel dan dalam ligan fungsional pada mendukung. Kekuatan interaksi ditentukan oleh jumlah dan lokasi dari biaya pada molekul dan pada kelompok fungsional. Dengan meningkatkan konsentrasi garam (umumnya dengan menggunakan gradien garam linear) molekul dengan interaksi ionik terlemah mulai terelusi dari kolom pertama. Molekul yang memiliki interaksi ionik kuat memerlukan konsentrasi garam yang lebih tinggi dan terelusi kemudian dalam gradien. Kapasitas pengikatan resin pertukaran ion umumnya cukup tinggi. Ini adalah sangat penting dalam kromatografi skala proses, tetapi tidak penting untuk pemisahan skala analitis. Buffer pH Sebagai aturan, pH buffer fase gerak harus antara pI ( titik isoelektrik ) atau pKa ( asam disosiasi konstan ) dari molekul bermuatan dan pKa dari kelompok dibebankan pada dukungan solid. Misalnya, dalam kromatografi penukar kation, menggunakan kelompok fungsional pada dukungan solid dengan pKa 1,2, sampel molekul dengan pI 8,2 dapat dijalankan dalam buffer fase gerak pH 6,0. Dalam kromatografi pertukaran anion molekul dengan pI 6,8 dapat dijalankan dalam buffer fase mobile pada pH 8,0 ketika pKa dari dukungan yang solid adalah 10.3 (www.separations.us.tosohbioscience.com).

2. Hidrophobic Interaction ChromatographyPemisahan menggunakan HIC didasarkan pada interaksi reversibel antara protein dan ligan hidrofobik terikat pada matriks kromatografi. Asam amino hidrofobik protein dan peptida biasanya terletak jauh dari permukaan molekul. Namun, banyak biomolekul memiliki beberapa kelompok hidrofobik yang cukup terkena memungkinkan interaksi dengan ligan hidrofobik pada media. Dibandingkan dengan kromatografi fase terbalik, kepadatan ligan pada matriks jauh lebih rendah dan memungkinkan kondisi elusi ringan, membantu untuk melestarikan aktivitas biologis. HIC sangat cocok untuk sampel diendapkan dengan amonium sulfat atau dielusi dalam konsentrasi garam yang tinggi karena tinggi buffer kekuatan ion meningkatkan interaksi hidrofobik. Interaksi ditingkatkan oleh buffer dengan kekuatan ion yang tinggi, yang membuat HIC langkah pemurnian baik setelah pengendapan amonium sulfat atau setelah elusi garam tinggi selama kromatografi penukar ion (IEX). HIC sangat cocok untuk menangkap atau langkah-langkah perantara dalam skema pemurnian. Selama HIC, komponen sampel mengikat kolom di tinggi penyangga kekuatan ion, biasanya 1 sampai 2 M amonium sulfat atau 3 M NaCl. Konsentrasi tinggi garam, terutama amonium sulfat, dapat memicu protein. Oleh karena itu, periksa kelarutan protein target dalam kondisi yang mengikat untuk digunakan. Elusi biasanya dilakukan dengan menurunkan konsentrasi garam, bertahap atau menggunakan gradien. Protein dalam larutan air memiliki berbagai residu permukaan terkena pelarut untuk derajat yang berbeda, tergantung pada struktur protein. Residu ini dapat hidrofilik, misalnya mereka dapat membawa muatan, atau mereka dapat hidrofobik, seperti dalam alanin asam amino fenil, tyrosine dan tryptophan. Kelompok hidrofobik akan lebih memilih untuk mengubur diri secara internal dalam struktur 3D protein tetapi beberapa akan terkena. Garam dapat digunakan untuk mengendapkan protein atau mengkristal keluar dari solusi - menyebabkan protein untuk diri-asosiasi. Para ilmuwan telah menyadari, sejak Hofmeister, bahwa garam yang berbeda memainkan peran penting dalam diri-asosiasi atau asosiasi dengan permukaan hidrofobik. Fenomena ini membentuk dasar untuk kromatografi interaksi hidrofobik (HIC). Sebuah matriks kromatografi mengandung gugus hidrofobik, mengikat protein dari larutan air untuk luasan yang berbeda, tergantung pada struktur protein dan berbagai faktor dikontrol termasuk konsentrasi garam, pH, suhu dan pelarut organik seperti yang diilustrasikan pada gambar di bawah ini. HIC sesuai dengan semua tahapan proses pemurnian. Contoh aplikasi termasuk menangkap hasil tinggi, polishing antibodi monoklonal, menghilangkan spesies terpotong dari bentuk full-length, memisahkan aktif dari bentuk tidak aktif, dan pembersihan virus.

Sebuah ilustrasi elusi 4 protein dengan model struktur 3D yang berbeda mereka dari kolom HIC, menggunakan turun gradien konsentrasi garam. Warna kuning menunjukkan residu hidrofobik. Alur kerja yang disukai tergantung pada aplikasi; terutama, apakah pemurnian akan ditingkatkan dalam proses industri. Untuk banyak aplikasi dalam penelitian, pemilihan media ditentukan hanya dengan kemurnian diperlukan. Pilihan sukses menengah tergantung pada menemukan orang yang tepat mengikat selektivitas dengan recovery produk yang baik, sedangkan kebutuhan untuk metode optimasi dan karakterisasi umumnya kurang dari untuk sebuah proses yang akan ditingkatkan dan digunakan untuk produksi industri biasa. Alur kerja dimulai dengan cara yang sama untuk kedua jenis aplikasi, seperti yang diilustrasikan pada gambar di bawah.

Workflow untuk pemilihan HIC menengah dan studi lebih lanjut kondisi mengikat dan elusi. GE Healthcare memperkenalkan media pertama HIC komersial pada tahun 1977 dan sekarang menawarkan salah satu rentang terluas media HIC di pasar, yang meliputi laboratorium yang paling umum dan aplikasi industri. Selain berbagai produk HIC, interaksi hidrofobik sering memainkan peran dalam penggunaan media kromatografi multimodal. Media ini sering digambarkan sebagai penukar ion garam-toleran, atau penukar ion menawarkan selektivitas yang unik. GE Healthcare menawarkan Capto MMC dan Capto mematuhi di kelas ini. Keluarga Media Bioproses kami dikembangkan dan didukung untuk pembuatan skala besar biopharmaceuticals. Dukungan ini termasuk metode divalidasi manufaktur, memasok media jangka panjang aman, penanganan yang aman dan mudah, dan Dukungan Regulasi Files (RSF) untuk membantu proses validasi dan pengiriman ke pihak berwenang. Selain itu, Cepat Trak Training & Education menyediakan tingkat tinggi, pelatihan hands-on untuk semua aspek kunci dari pengembangan bioproses dan manufaktur. Menangkap ke Polishing Untuk mencapai potensi pemisahan penuh HIC dalam berbagai aplikasi menuntut berbagai media dengan hydrophobicities berbeda dan sifat operasional. Hal ini dicapai dengan memvariasikan matriks dasar dan sifat kimia dari ligan. Khusus untuk proses hilir industri, ukuran manik yang berbeda dapat dituntut oleh aplikasi, khususnya untuk menangkap atau polishing. Manik-ukuran pilihan menganggap kedua kekuatan menyelesaikan yang diperlukan dan penurunan tekanan atas tempat tidur - dipengaruhi oleh viskositas sampel dan sering dibatasi oleh spesifikasi peralatan dalam aplikasi skala besar. Akhirnya, kisaran meliputi media yang dengan struktur manik-manik yang lebih terbuka cocok untuk protein yang sangat besar, seperti Octyl Sepharose 4 Fast Flow dan Butyl Sepharose 4 Fast Flow. Angka ini menunjukkan hasil dari penelitian yang didasarkan pada 100 percobaan di mana enam protein model dengan ukuran berbeda, hidrofobik dan biaya dielusi dalam sama ammonium sulfat gradien.

Hidrofobisitas peta media HIC. Berdasarkan studi elusi dari enam protein Model: ovalbumin, a-chymotrypsinogen, ribonuklease, laktoferin, lisozim, a-amilase. Pilih Media Tepat Pemurnian protein dapat dibagi menjadi capture, pemurnian intermediate dan polishing, tergantung pada tujuan dan sifat tantangan. HIC dapat digunakan pada setiap tahap ini dan media Capto menawarkan berbagai kondisi operasi. Memilih media yang tepat sangat tergantung pada mendapatkan selektivitas mengikat tepat. 1. Secara umum, menggunakan media Capto untuk produktivitas optimal dalam menangkap atau langkah-langkah perantara. Rata-rata ukuran manik 75 m 2. Gunakan media yang Sepharose Fast Flow untuk menangkap pada arus hingga 300 cm / jam dan ketika Media Capto tidak menawarkan selektivitas mengikat diperlukan. Rata-rata ukuran bead 90 pM. 3. Akhirnya, tantangan yang berkaitan dengan polishing mungkin memerlukan manik-manik kecil untuk mencapai resolusi tinggi, seperti yang ditawarkan oleh media yang Sepharose High Performance. Rata-rata manik ukuran 34 m.

3. Size Exclusion ChromatographyPemisahan berbagai konstituen dengan meninjau perbedaan ukuran dan geometri molekul adalah dasar kromatografi eksklusi. Perbedaan ukuran menyebabkan beberapa partikel bergerak lebih cepat dari yang lainnya sehingga menimbulkan perbedaan permukaan migrasi. Kromatografi eksklusi dapat dikelompokkan dalam tiga kategori :a. Kromatografi permeasi gel atau filtrasi gelFiltrasi gel adalah suatu teknik yang menguraikan campuran zat-zat sesuai dengan ukuran molekulnya. Teknik ini didasarkan atas inklusi dan eksklusi suatu zat terlarut melalui suatu fase diam yang terbuat dari gel polimer yang berikat silang dan berpori heterogen. Dalam kromatografi elusi cair-padat, pemisahan terjadi antara fase cair di dalam partikel gel dan cairan di luar yang mengelilingi partikel gel. Akibat mekanisme perbedaan laju permeasi masing-masing molekul zat terlarut dari dan ke interior partikel gel, pemisahan akan terjadi. Dengan aliran cairan, molekul akan berdifusi ke seluruh bagian gel, hanya molekul yang mempunyai ukuran besar yang tidak dapat masuk ke daerah yang merupakan rongga-rongga gel. Akibatnya molekul dapat lewat dengan tanpa rintangan sepanjang kolom melalui interstisi volume cairan, sedangkan molekul kecil akan terpenetrasi secara dalam pada celah-celah gel. Sudah tentu molekul-molekul besar akan terelusi lebih dahulu baru kemudian diikuti oleh molekul -molekul lebih kecil yang diperosokkan dulu ke dalam rongga-rongga gel. Pemisahkan ini dimungkinkan akibat penahanan ukuran yang terjadi dalam partikel gel (Khopkar, 1990).Pemisahan suatu tipe gel tertentu sangat tergantung pada ukuran molekul dan sifatsifat kimia dari zat yang akan dipisahkan. Misalnya pada biogel 0-10 digunakan untuk zatzat yang mempunyai berat molekul yang berkisar antara 5000-17000 satuan. Molekul dengan berat molekul di atas $batas ini yaitu limit eksklusi, akan lewat saja tanpa rintangan dari gel. Di bawah limit eksklusi, zat tersebut akan terelusi pada volume elusi yang sesuai dengan volume bed total. Untuk bekerja dalam medium yang tidak berair, gel yang tepat digunakan adalah Sephadex LH-20 (Khopkar, 1990).

b. Eksklusi dan retardasi ionEksklusi Ion adalah suatu proses untuk memisahkan materi ionik dari materi nonionik didasari pada perbedaan distribusi kedua tipe zat pelarut ini di antara fase resin penukar ion dan larutan air. Suatu resin penukar ion tidaklah sama dengan absorbsi biasa. Dengan mengatur jaringan muatan suatu resin, dapat diperoleh suatu keadaan di mana hanya satu macam ion elektrolit yang dieksklusikan. Jumlah total elektrolit yang berdifusi ke dalam resin dibatasi oleh prinsip elektronetralitas. Makin kuat terionisasi suatu resin penukar makin efisien untuk eksklusi ion. Banyaknya garam yang berdifusi ke dalam resin berkurang dengan bertambahnya kapasitasnya penukar ion suatu resin. Sebagian besar ion elektrolit berberat molekul rendah yang mudah larut dalam air, bebas berdifusi ke dalam dan ke luar resin tidak peduli dengan besarnya kapasitas resin, sehingga cenderung berkonsentrasi sama pada kedua fase pada saat kesetimbangan tercapai. Selama ada perbedaan koefisien distribusi untuk berbagai zat terlarut, maka pemisahan mungkin akan terjadi (Khopkar, 1990).

Retardasi ion adalah suatu metode pemisahan dengan kolom yang sangat mirip dengan eksklusi ion tetapi menggunakan suatu resin penukar ion yang terdiri dari gugusan fungsi kation maupun anion dalam matriks resin. Resin akan mengadsorbsi kation-kation dan anion-anion dari larutan sampel. Afinitas absorbsi tersebut rendah sehingga air dapat digunakan untuk meregenerasi resin. Jadi perbedaannya dengan eksklusi ion adalah pada retardasi ion-ion juga dihambat lajunya selama mengalir sepanjang kolom, serta retardasi ion dapat digunakan untuk pemisahan elektrolit dari nonelektrolit yang berukuran besar, dan juga elektrolit dari elektrolit lain jika tetapan distribusinya cukup berbeda, misalkan NH4OH + NaOH; NH4Cl + ZnCl2; FeSO4 + ZnSO4 dapat dipisahkan dengan mudah dengan proses retardasi ion (Khopkar, 1990).c. Molecular Sieve Anorganic ZeolitZeolit alam dan sintesis membentuk suatu saringan molekul untuk pemisahan gas-gas dan molekul organik berukuran kecil. Volume suatu zeolit terbentuk dari suatu rongga rongga yang saling dihubungkan oleh saluran saluran (channels). Penyaringan dan aksi penghambatan dari saluran dikombinasikan dengan aktivitas adsorpsi permukaan matriks kristal sehingga memungkinkan digunakannya zeolit untuk memisahkan molekul-molekul yang lebih kecil dari ukuran saluran ini dari molekul yang lebih besar ukurannya dari saluran. Aktivitas permukaan dan geometris molekular berperan dalam pemisahan ini (Khopkar, 1990).Secara struktural zeolit adalah rangka tetrahedral yang bersatu membentuk struktur sarang tawon dengan rongga-rongga besar yang saling berhubungan melalui saluransaluran kecil. Penampang lintang dari saluran inilah yang menentukan ukuran molekul yang dapat masuk ke dalam rongga-rongga. Ukuran dari posisi ion logam (misalkan Na, Ca) dalam kristal zeolit, dan tipe struktur jaringan rangka tetrahedral alumina silikat zeolit menentukan diameter efektif dari saluran-saluran tersebut (Khopkar, 1990).Terdapat bermacam tipe zeolit, misalkan tipe molekular sieve 4 adalah [Na12(AlO2)12(SiO2)12]. Molekul berdiameter lebih kecil dari 4 j=ajab teradsorbsi, misalkan H2O, CO2, H2S, SO2 dan hidrokarbon dengan 1-2 atom karbon. Etana dapat masuk dalam molekular sieve 5, yang dibuat dari molekular sieve 4 dengan menggantikan Na oleh Ca dan K. Parafin rantai lurus dapat masuk ke dalamnya, demikian juga alkohol sampai dengan C4, tetapi siklopropana tidak dapat masuk, demikian juga asam naftanik dan molekul aromatik lainnya. Tipe 10 dan 13 adalah [Na8(AlO2)80(SiO2)106]. Senyawa ini mengadsorbsi molekul berdiameter sampai 10 (Khopkar, 1990). Molekular sieve mempunyai afinitas yang lebih besar terhadap molekul polar dan senyawa yang terpolarisasi karena induksi pada molekul non polar yang berukuran sama. Molekul-molekul polar tertahan dengan kuat dalam rongga kristal. Pada pemurnian dan industri gas, molekul sieve digunakan untuk menghilangkan molekul-molekul tidak jenuh (polar). Zeolit diguankan juga sebagai medium berlangsungnya reaksi. Bahan kimia di dalamnya sebagai hasil reaksi dapat dikeluarkan dengan teknik vakum atau dengan penggeseran menggunakan materi yang teradsorbsi kuat, misalkan air. Molekular sieve inidapat diaktifkan kembali dengan pemanasan 200-350oC. Mereka juga digunakan dalamkromatografi gas padat sebagai fase diamnya dalam kolom (Khopkar, 1990).

Schematic of molecular sieve membrane for separating hydrogen from mixed gas streams.

II. KOLOMKolom eksklusi mengandung partikel berpori dengan garis tengah pori yang berbeda. Solutyang disuntikkan ke dalam kolom akan berdifusi ke dalam pori yang garis tengahnya lebih besar daripada garis tengah efektif solut. Garis tengah efektif ditunjukkan pada gambar berikut :

(Khopkar, 1990).Perhatikan, walaupun bobot molekul sama, garis tengah efektifnya berbeda, dan komponen yang garis tengah efektifnya paling besar terelusi lebih dahulu. Selain itu, garis tengah efektif mencakup pula molekul solvasi apa saja (Khopkar, 1990).Dengan bertambah besarnya garis tengah efektif solut, jumlah pori yang dapat dimasukinya dan kemampuannya berdifusi ke dalam pori menurun. Jadi, jika solut bergaris tengah demikian rupa sehingga tidak dapat berdifusi ke dalam pori yang mana pun, maka solut tersebut dapat dikatakan dieksklusi sempurna dan tidak ditahan, artinya solut itu terelusi dalam volum mati (Vo) kolom. Solut yang mampu berdifusi sempurna ke dalam semua pori dikatakan berpermerasi sempurna ke dalam kemasan. Solut jenis ini memerlukan volum pelarut yang jauh lebih besar untuk mengelusinya dari kolom. Pemisahan komponen dapat tercapai jika komponen itu terelusi dengan volum tambat antara Vo dan volum permeasi total (Khopkar, 1990).Volum kolom eksklusi terdiri atas tiga komponen yang jelas, yaitu : 1. volum mati, Vo volum ruang antarpartikel yang ditepati fase gerak yang mengalir, 2. volum yang ditempati oleh bagian padat kemasan,3. volum pori (Vp) volum yang ditempati fase gerak yang mandek. Pada kromatografi eksklusi, ini dapat disamakan dengan volum fase diam (Khopkar, 1990).Kita dapat mendefinisikan koefisien distribusi K solut sebagai nisbah volum pori yang dapat dimasuki solut (Va) dan volum pori total (Vp), yaitu:K=Maka volum tambat (Vr) solut dinyatakan dengan persamaan berikut : Vr = Vo + KVp Rentang K antara 0 sampai 1, karena jika solut dieksklusikan seluruhnya, maka K= 0, dan jika solut berpermerasi ke pori seluruhnya, maka K=1 (artinya, V a = Vp jika kolom berperilaku secara eksklusi ideal (Khopkar, 1990).Maka jelaslah bahwa untuk memperoleh pemisahan semaksimum mungkin kita menginginkan volum mati yang kecil dan volum pori yang besar. Harus diingat pula bahwa untuk sistem tertentu, volum yang diperlukan untuk mengelusi semua komponen cuplikan besarnya tertentu (artinya Vo dan V p ). Jadi,harus dilakukan segala usaha untuk meminimumkan pelebaran pita (Khopkar, 1990).Memilih ukuran pori kemasan umumnya bergantung pada ukuran molekul solut yang akan dipisahkan. Sering cuplikan ukurannya sangat beragam (artinya bobot molekul sangat berbedabeda) dan kemasan dengan satu ukuran pori saja tidak memadai untuk memisahkan semua jenis molekul. Beberapa mungkin dieksklusi seluruhnya dari pori (K=0) dan terelusi sabagai satu puncak dengan volum mati (Vo), sedangkan yang lain berpermeasi ke semua pori (K=1) dan terelusi sebagai satu puncak dengan volum permeasi total (Vo+Vp). Yang lainnya lagi berpermeasi ke pori secara selektif, bergantung pada ukuran nisbinya, dan terelusi dengan volum tambat Vr yang dinyatakan oleh persamaan Vr = Vo + KVp ini ditunjukkan berupa bagan dalamgambar :

DETEKTORDalam SEC, konsentrasi dari berat polimer dalam eluen mungkin dapat dipantau terusmenerus dengan sebuah detektor. Ada banyak macam detektor yang tersedia dan dapat dibagi menjadi dua kategori. Yang pertama adalah konsentrasi detektor sensitif meliputi serapan UV, indeks refraktometer diferensial (DRI) atau indeks bias (RI) detektor, inframerah (IR) penyerapan dan kepadatan detektor. BM-sensitif detektor termasuk detektor cahaya hamburan sudut rendah (LALLS), multi-sudut hamburan cahaya (MALL). Kromatogram yang dihasilkan oleh distribusi berat polimer sebagai fungsi volume retensi (Trathnigg, 1995). Detektor yang paling sensitif adalah diferensial fotometer UV dan detektor yang paling umum adalah refraktometer diferensial (DRI). Ketika karakterisasi kopolimer, perlu untuk memiliki dua detektor dalam rangkaian. Untuk penentuan komposisi akurat kopolimer setidaknya dua dari detektor tersebut harus detektor konsentrasi (Sandler, 1998). Penentuan komposisi kopolimer yang paling dilakukan dengan menggunakan detektor UV dan RI, meskipun kombinasi lain dapat digunakan (Pasch, 2000).1. Refraktor diferensial

Detektor indeks bias dibangun sebagai aliran melalui refraktometer diferensial yang terus menerus mengukur perbedaan indeks bias eluat dan eluen murni. menunjukkan skema jalur sinar melalui instrumen. Cahaya yang dipancarkan dari 1 melewati celah LED 2 sebelum dibelokkan oleh cermin semi-transparan 3 dan melintasi dua bagian dari sel, mengukur 4 cermin semitransparan 3, dan sejajar bidang pelat kaca 6. Akhirnya, sinar dibagi menjadi dua parsial balok oleh prisma 7. Intensitas dari balok di 8a, 8b yang menggunakan foto dioda dan digunakan sebagai ukuran untuk posisi sinar asli.

(Limanto, 2011).

DAFTAR PUSTAKALimanto, Kenny R., Bernadetta Arum W., Rachelia Octavia, Jenny Marina, Ina Juni A., Kristina Nety. 2011. Size Exclusion Chromatography. Yogyakarta : Universitas Sanata Dharma.Khopkar, S.M..1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press.