Kromatografi Kolom Konvensional

Kromatografi Kolom KonvensionalDosen Pembimbing :Arif Sholahuddin, S.Pd, M.Si.Drs. Abdul Hamid, M.Si.

LATAR BELAKANGKromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponen molecular.Semua kromatografi memiliki fase diam (dapatberupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas).Kromatografi ini dikembangkan menjadi beberapa jenis, yaitu kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas, kromatografi gas dan kromatografi kolom.LATAR BELAKANGJenis-Jenis KromatografiKromatografi cair-padat (Kromatografi Adsorpsi)Kromatografi Cair-cair (Kromatografi Partisi)Kromatografi Gas-padat (KGP)Kromatografi Gas-Cair (KGC)Kromatografi Penukar IonKromatografi Kertas (KT)Kromntografi Lapis Tipis (KLT atau TLC = Thin Layer Chromatography)Kromatografi Filtrasi GelKromatografi Elektroforesis Kontinyu

Lanjutan...Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorbsi. Kromatografi kolom digolongkan kedalam kromatografi cair padat (KCP) kolom terbuka.

Sejarah Penemuan dan Perkembangan Alat KromatografiMikhail Semyonovich Tsvet Seorang botanist Rusia, pada tahun 1900 menemukan teknik kromatografi untuk pertama kali melalui riset pada klorofil. Pada 1952 Archer John Porter Martin dan Richard Laurence Millington Synge memenangkan anugerah Nobel bidang Kimia untuk temuannya mengenai kromatografi partisi.Penemu Alat Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1930, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang barisi kapur (CaSO4). Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom.

Penyelidikan tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC)Pada tahun 1938 Alat kromatografi lapisan tipis (TLC) oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958Tahun 1941 Martin dan Synge tidak hanya mengubah dengan cepat alat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan alat kromatografi gas dan alat kromatografi kertas. Di Indonesia, alat ini diperkenalkan pada tanggal 4-5 Juni 1979 di Lembaga Kimia Nasional di Bandung yaitu Seminar tentang alat High Performance Liquid Chromatography (HPLC) .Lanjutan Definisi Kromatografi kolomSebenarnya kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal yang pertamakali di lakukan oleh D.T.Davy (1987) yaitu untuk membedakan komposisi minyak bumi. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorbsi. Jenis metode kromatografi kolom Berdasarkan interaksi komponen dengan adsorbenBerdasarkan gaya yang bekerja pada kolomBerdasarkan jenis fasa diam dan fasa gerakBagian-Bagian Kromatografi Kolom

11Adsorben Dan Pelarut Dalam Kromatografi KolomAdsorbenSilika gel (SiO2) dan alumina (Al2O3) adalah 2 adsorben yang paling umum digunakan untuk kromatografi kolomUkuran partikel dari adsorben sangat mempengaruhi bagaiman eluen bergerak melewati kolom. Partikel yang lebih kecil digunakan untuk kromatografi kolom tekanan sedangkan adsorben partikel yang lebih besar digunakan untuk komatografi kolom gravitasi.

Selain silika gel dan alumina adsorben yang digunakan dalam kromatografi kolom diantaranya arang, magnesium silikat,kalsium sulfat dan serbuk selulosa.

Lanjutan PelarutPelarut mempunyai peranan yang penting dalam mengelusi sampel yang dapat menentukan keberhasilan pemisahan secaa kromatografi kolom.

Pelarut yang mampu menjalankan elusi terlalu cepat tidak akan mampu mengadakan pemisahan yang sempurna. Sebaliknya elusi yang terlalu lambat akan menyebabkan waktu retensi yang terlalu lamaSistem pelarut dengan kepolaran yang bertingkat sering juga digunakan adalah pelarut mengelusi kolom.

Beberapa jenis pearut yang sering digunakan dalam kromatografi kolom:Eter, minyak tanah, Karbon tetra klorida, Sikloheksan, Karbon disulfida, Eter, Aseton, Benzen, Ester, Kloroform, Alkohol, Air, etanol, metanol, petroleum benzen

Lanjutan Syarat-syarat Adsorben dan PelarutAdsorben:Harus memiliki luas permukaan besarHarus mudah diregenerasiTidak cepat kehilangan kapasitas serap

Pelarut:Pemilihan pelarut tergantung dari sifat kelarutan dan kepolarannyaMencoba dengan KLT, cara ini dikerjakan dengan memilih fase diam KLT sejenis dengan fase diam kolom yang akan digunakan.

Contoh lain zat penyerap dan fase gerakZAT PENYERAPFASE GERAKSukrosaPatiInulinTalkNatrium KarbonatKalsium KarbonatKalsium FosfatMagnesium KarbonatMagnesium OksidaKalsium HidroksidaMagnesium silikat aktifAlumina aktifArang aktifEter minyak tanahKarbon tetra kloridaSikloheksanKarbon disulfidaEterAsetonBenzenEsterEsterKloroformAlkoholAirPiridinPrinsip Kerja Kromatografi Kolom KonvensionalPrinsip kerja kromatografi kolom adalah adanya perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu dimasukkan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap.Cara Penyiapan Kolom

Labu PenampungKertas saring atau bahan penyaringBahan penyaring bila perluSumbatan kapas atau serabut gelas

Fase GerakCadangan Fase GerakPemilihan Kolom

Pada pemilihan ukuran kolom harus diperhitungkan jumlah contoh.Perbandingan bobot zat penyerap dan contohPerbandingan panjang kolom dengan diameterUntuk contoh multi komponen dan contoh komponen-komponennya mempunyai afinitas yang sama terhadap zat penyerap digunakan kolom panjangUntuk contoh komponen yangmempunyai afinitas berbeda terhadap zat penyerap digunakan kolom pendekCara memasukkan zat penyerap ke dalam kolomCara Penggunaan Kolom

Senyawa biru lebih polar daripada senyawa kuning dan memungkinkan mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen.

Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal sebagai elusi, sedangkan pelarut disebut sebagai eluen.

Kromatografi Kolom Pada Sampel Berwarna

Alat Otomatis Pengumpulan Sampel pada Kromatografi Kolom

Fraction Collector C-660

Mengumpulkan bahan yang dipisahkan menurutwaktu, volume ataupun puncak. Selama beroperasi, sampaidengan 12 liter dapat dikumpulkan maksimal dalam240 tabung reaksi.

2. Flash KromatografiOtomatis-Pengendalian dengan komputer (SepacoreControl Software)Menyediakan otomatisasi penuh dengan fleksibilitas optimal untuk interaksi in-run, perangkat lunak ini memungkinkan pemurnian yang cepat dengan kinerja tinggi. Keuntungan dan Kelemahan Kromatografi Kolom KonvensionalKeuntungan :Digunakan untuk memisahkan atau memurnikan zat-zat yang terkandung dalam campuran.

Kerugian :Membutuhkan waktu dalam pengerjaannya dan membutuhkan keahlian yang baik.Selalu diperhatikan perubahan dalam pengerjaannya.Prosedurnya rumit terlebih untuk sampel dalam jumlah banyak.

Aplikasi Penggunaan Kromatografi KolomTujuan : untuk memperkirakan pigmen yang terdapat pada lima jenis rumput laut coklat

Persiapan sampel : Sampel bubuk rumput laut diekstraksi dengan melarutkan dalam 10ml dari 3 pelarut seperti aseton 90%, aseton 100% , dan etanol 90%. Kromatografi lapis tipisDigunakan untuk menghitung nilai Rf pada fotosintesis pigment klorofil, karoten, dan fucoxantin yang terdapat dalam sampelKromatografi kolomFase diam berupa Silika gel (230-400 mesh) dicampur dengan pelarut yaitu n-heksana sebagai adonan. Fase gerak berupa n-heksana dan aseton perbandngan 7:3. Ekstraksi, Pemurnian, dan Studi mengenai sifat antioksidan fucoxantin pada rumput laut coklat

Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode DPPH

Uji aktivitas antioksidan dilakukan setelah uji peredaman radikal bebas terdeteksi pada beberapa sampel.Column Chromatography Purified Phytochemicals Identified in Phragmytes vallatoria Leaf Ethanolic Extract

Tujuan : Ekstrak daun Phragmytes vallatoria diaplikasikan sebagai penyembuh luka. Cara analisis GC-MS dari ekstraksi daun Phragmytes vallatoria dengan menggunakan etanol menunjukkan adanya asam lemak dan senyawa plasticizer. Oleh karena itu,telah dilakukan penelitian pada ekstrak daun menggunakan metode fitokimia dan dapat dilakukan dengan sederhana menggunkan kromatografi kolom.Hasil dan Pembahasan :Berdasarkan penelitian didapatkan hasil bahwa ekstrak daun Phragmytes vallatoria mengandung antioksidan, asam lemak dan senyawa plasticizer melalui metode fitokimia. Teridentifikasinya asam linoleat diketahui memiliki fungsi dapat melindungi membran sel dari senyawa berbahaya.Isolasi dan Identifikasi senyawa Terpenoid yang Aktif Antibakteri Pada Herba Meniran (Phyllanthus niruri Linn)

Tujuan : Untuk mengetahui ada tidaknya herba meniran (Phyllanthus niruri Linn) mengandung senyawa terpenoid antibakteriProsedur: Ekstraksi: dilakukan dengan 2 cara, yaitu Soxletasi dan MaserasiUji aktivitas antibakteri : Ekstrak n-heksanaa diuji aktivitasnya terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphyloccocus aureus

Hasil dan Pembahasan:Hasil ekstraksi cara sokletasi dan maserasi menunjukkan ekstrak n-heksana positif mengandung senyawa terpenoid dengan terbentuknya warna ungu setelah direaksikan dengan Pereaksi Lieberman Burchard.Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap ekstrak n-heksana hasil sokletasi dipisahkan mengunakan kromatografi kolom menghasilkan tiga buah fraksi NoFraksiJumlah NodaRfWarna Ekstrak1A (1-27)10,725Kuning2B (28-33)20,690 dan 0,600Kuning Muda3C (34-)10,580Kuning MudaHasil uji fitokimia masing-masing fraksi hasil kromatografi kolom

Nama FraksiWarna larutan sebelum direaksikan dengan pereaksi Liberman-BurchardWarna larutan setelah direaksikan dengan pereaksi Liberman-BurchardKeteranganAKuning MudaMerah Muda+ terpenoid (diterpenoid)BKuning MudaHijau Kebiruan- (steroid)CKuningUngu Muda+ (triterpenoid)Isolation, Purification and Identification of Curcuminoids from Turmeric (Curcuma longa L.) by Column Chromatography

Tujuan : Penelitian ini berfokus pada penyaringan pelaruk untuk mengekstrak Kurkuminoid, mengisolasi dan memurnikan kurkuminoid menggunakan krmatografi kolom di sertai analisis permurnian dengan HPLC.

Prosedur :Preparasi SampelKondisi KromatografiPemisahan kukuminoid dengan KLT menggunakan system perbedaan pelarutKromamatografi Kolom

Hasil dan Pembahasan :Berdasarkan penelitian kromatografi kolom diketahui aseton sebagai pelarut yang cocok untuk mengektrak Kurkuminoid. Dengan menggunakan HPLC analisis selanjutnya diketahui kurkuminoid menunjukkan adanya kurkumin dan menunjukkan adanya Demethoxycurucmin (DMC) dan (Bisdemethoxycurcumin) BDMC dengan persentase 22,8%, 14,2%, 6,5%.

Karakterisasi Senyawa Flavonoid Hasil Isolat dari Fraksi Etil Asetat Daun Matoa (Pometia pinnata J.R. Forst & G. Forst)Tujuan : Mengidentifikasi karakteristik senyawa flavonoid hasil isolat dari fraksi Etil Asetat Daun Matoa.

Prosedur :1. maserasi sampel 2.melakukan pemurnian dengan fraksinasi dan kromatografi 3. Fraksi etil asetat dimurnikan dengan kromatografi kolom vakum cair dan kromatografi kolom tekan menggunakan fasa diam silika gel

4. Senyawa yang diperoleh kemudian dimurnikan dengan menggunakan KLT preparatif dua dimensi perbandingan eluen n-heksana : etil asetat (8:2)5. Ekstrak yang relatif murni dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis dan spektrofotometer Inframerah (IR).

HASIL1. Ekstraksi Senyawa Flavonoid

2. Pemisahan dan Pemurnian

3. Pemurnian

4. Uji KemurnianUji kemurnian terhadap isolat F3.5 dengan berbagai fase gerak menunjukkan adanya noda tunggal dengan demikian dapat dianggap bahwa isolat tersebut terdiri dari satu komponen senyawa yang relatif murni secara KLT. Hasil KLT 2 dimensi diperoleh nilai Rf I = 0,20 dan Rf II = 0,24.5. Karakterisasi Senyawa Hasil IsolatTetapan Fisika Isolat F3.5Pengukuran titik leleh dari senyawa hasil isolatsebesar 113-115oC, hal ini menunjukan bahwa hasil isolasi yang diperoleh relatif murni.Spektrofotometri UV-Vis

Keterangan :* =menunjukkan panjanggelombangmaksimum = menunjukkan pergeseran

Spektrofotometri Inframerah

Dari hasil penelitian yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa isolat F3.5 relative murni diduga termasuk senyawa flavonoid karena pada spektrum UV-Vis menunjukkan pada pita I 310 nm dan 270 nm pada pita II, dan pada spektrum IR mempunyai gugus fungsi O-H aromatik, C-H alifatik, C=O karbonil, C=C aromatik dan C-C aromatik.SESI DISKUSI KESIMPULANKromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorbsi.Prinsip dari permisahan komponen-komponen adalah adsorpsi diantara permukaan padatan - cairan (solid liquid interface). Supaya didapatkan permisahan yang baik. senyawa-senyawa didalam campuran harus mempunyai afinitas yang berbeda terhadap Zat penyerap dan harus ada saling interaksi di antara zat penyerap dan komponen. Pada saat zat penyerap yang ditambah dengan contoh dialiri pelarut. komponen-komponen didalam campuran akan bergerak turun dengan kecepatan tertentu.