laporan lengkap vakum kolom klmpok 8

8/10/2019 Laporan Lengkap Vakum Kolom Klmpok 8

1/29

LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN LENGKAP

ISOLASI SENYAWA BIOAKTIF

KROMATOGRAFI KOLOM DAN VAKUM

Spons Nipathes olemd a

OLEH :

KELOMPOK VIII

ARMANINGSIH ARDIN (N111 12 102)

ISNIATY RUSDY (N111 12 283)

EKA SELVINA (N111 12 315)

FESLY ANUGERAH A. (N111 12 292)

AYU ISTIQOMAH (N111 12 296)

DIAN MEGAWATI AMIN P. (N111 12 306)

GOLONGAN: KAMIS SIANG

ASISTEN: 1. HENDRA

2. MAGHFIRAH S.

MAKASSAR

2014


2/29


3/29

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Sejak tahun 1969 sampai 1999 lebih kurang 300 paten telah

dihasilkan dalam bidang natural products. Setiap tahun sekitar 100

senyawa yang berhasil diinvestigasi. Sebagian besar senyawa aktif dari

lingkungan diteliti khasiatnya sebagai bahan antikanker.

Spons dikenal sebagai organisme yang kaya dengan kandungan

senyawa bioaktif. Menurut Munro et,al (1999), spons merupakan biota laut

yang paling banyak diteliti kandungan senyawa bioaktifnya. Senyawa

bioaktif dari spons sangat beragam dan secar kimia memiliki struktur yang

unik dan menarik untuk dijadikan sebagai senyawa pemandu dalam

sintesis obatobat baru. Hewan ini hidup dengan baik pada ekosistem

terumbu karang dan tersebar dibeberapa pulau dalam wilayah perairan.

Niphates olemda merupakan salah satu genus spons yang banyak

diteliti kandungan dan aktivitas senyawa bioaktifnya. Spons ini banyak

mengandung senyawa flavonoid yang memiliki aktivitas antitumor,

antimikrokbial, antivirus dan lainlain. Minimnya informasi, pengetahuan

dan hasil penelitian tentang metabolit sekunder dari spons Niphates

olemda ini kurang dimanfaatkan sebagai objek penelitian. Oleh karena itu,

pada percobaan ini akan dilakukan penelitian terhadap Niphates olemda

mengenai kandungan kimia yang terdapat sampel spons ini. Dimulai dari

penyiapan sampel, ekstraksi, partisi, kromatografi kolom/vakum untuk


4/29

mendapatkan fraksinasi, kromatografi preparatif, identifikasi senyawa, KLT

2 dimensi, dan rekristalisasi

I.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

I.2.1 Maksud Percobaan

Mengetahui dan memahami prinsip dasar isolasi dengan metode

kromatografi cair vakum dan kromatografi kolom

I.2.2 Tujuan Percobaan

Melakukan pemisahan komponen kimia terhadap sampel Niphates

olemda dengan menggunakan metode kromatografi cair vakum

I.3 Prinsip Percobaan

1. Melakukan pemisahan komponen kimia terhadap sampel Niphates

olemda dengan kromatografi cair vakum, dimana pemisahan

komponen kimia berdasarkan prinsip adsorpsi dan partisi yang

dipercepat dengan adanya bantuan dari pompa vakum.

2. Melakukan pemisahan komponen kimia terhadap sampel Niphates

olemdadengan kromatografi kolom, dimana pemisahan komponen

kimia berdasarkan prinsip adsorpsi dan partisi dengan pengaliran

eluen karena adanya gaya tarik bumi (gravitasi)


5/29

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Teori Umum

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan yang berdasarkan

prinsip distribusi fase, yaitu suatu perpindahan komponen-komponen yang

dianalisa dari suatu fase yang bergerak menuju fase lain yang diam yang

dilaluinya (1).

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan

atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua

fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Fase diam

dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fase bergerak dapat

berupa zat cair atau gas (2).

Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi

komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing

komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya

diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke

kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan

pengemban yang cocok (fasa mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan

laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh

kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam

(stationer) (3).

Lapisan yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase

diam) ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan


6/29

yang cocok. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan, ditotolkan

berupa bercak atau pita. Setelah itu pelat atau lapisan diletakkan dalam

bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase

gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembang).

Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditempatkan (dideteksi).

Secara umum dapat dikatakan bahwa kromatografi adalah suatu

proses migrasi diferensial dinamis dalam system dalam mana komponen-

komponen cuplikan ditahan secara selektif oleh fase diam (1).

Prinsip dari pemisahan adalah adanya perbedaan sifat fisik dan

kimia dari senyawa yaitu kecendrungan dari molekul untuk melarut dalam

cairan (kelarutan), kecenderungan molekul untuk menguap (keatsirian),

kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk labus

(adsorpsi, penserapan) (4).

Walaupun agak tidak terlalu jelas, kontribusi kromatografi pada

perkembangan kimia modern tidak dapat dipandang rendah. Tanpa teknik

kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir murni) akan sangat

sukar , dan dalam banyak kasus, hampir tidak mungkin.

Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil

dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis

fasa mobil dan mekanisme pemisahannya, seperti ditunjukkan di Tabel.

(3).


7/29

Tabel. Klasifikasi kromatografi

Kriteria Nama

Fasa mobil Kromatografi cair, kromatografi gas

Kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi

Mekanisme Kromatografi pertukaran ion

kromatografi gel

Fasa stationer Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis,

kromatografi kertas

Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar

diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang

kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan

lagi. Kolom dihisap sampai kering dan sekarang siap dipakai. Cuplikan,

dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian

atas kolom atau pada lapisan prapenjerap dan dihisap perlahan-lahan ke

dalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom, dielusi dengan

campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya

rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan, kolom dihisap sampai

kering pada setiap pengumpulan fraksi. Berbeda dengan metode yang

menggunakan tekanan pada bagian atas kolom untuk meningkatkan laju

aliran, mengubah kolom (mengubah pelarut dan sebagainya) mudah

karena kepala kolom berada dalam tekanan (1).

Untuk kromatografi kolom dari larutan dibutuhkan tabung pemisah

tertentu yang diisi dengan bahan sorpsi dan juga pelarut pengembang


8/29

yang berbeda. Tabung pemisah yang diisi dengan bahan sorpsi disebut

kolom pemisah. Tergantung dari masalah bahan pemisahan dapat

digunakan tabung filter dengan gelas berpori yang pada ujung bawah

menyempit (tabung Allihn) atau tabung gelas, yang pada ujung bawah

menyempit dan dilengkapi dengan kran. Tabung bola jarang digunkan.

Perbandingan panjang tabung terhadap diameter pada umumnya adalah

40:1. Harga 20 berlaku sebagai batas bawah.

Pengisisan tabung pemisah dengan adsorben, yang juga disebut

kemasan kolom, harus dilakukan secara hati-hati, harus rata. Aluminium

oksida atau silika gel dapat diisikan kering ke dalam tabung pemisah. Agar

pengisian rata, tabung setelah diisi divibrasi, diketok-ketok atau dijatuhkan

lemah pada pelat kayu. Adsorben lainnya harus diisikan sebagai suspensi,

terutama jika zat ini menggelembung dengan pelarut pengembang. Yang

umum dilakukan adalah, adsorben dibuat seperti bubur dengan pelarut

elusi, kemudian dimasukkan ke dalam tabung pemisah. Sebagai bahan

sorpsi digunakan bahan yang sama dengan kromatografi lapis titpi yaitu

silika gel, aluminium oksida, poliamida, selulosa, selanjutnya juga arang

aktif dan gula tepung. Tergantung dari cara pengembangan dapat

dibedakan kromatografi elusi, kromatografi garis depan dan kromatografi

pendesakan (4).

Dalam kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan tipis jel

silika atau alumina pada sebuah lempengan gelas, logam atau plastik.

Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar


9/29

menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertical (3).

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang

masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk

memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan

adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah

silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua

macam :

- Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah

diberi kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.

- Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan

cairan pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke

dalam kolom Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu

disuspensikan dengan cairan pengelusi yang akan digunakan

kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom

Gambar 1. Kromatografi Kolom


10/29

secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil

kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah

silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben

kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih

dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang

spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom

melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua,

dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi

ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi

(5).

Salah satu cara pemisahan adalah kromatografi cair vakum,

kromatografi cair vakum adalah kromatografi kolom yang dipercepat dan

bekerja pada kondisi vakum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3,

sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta

wadah penampung fraksi. Corong G-3 diisi adsorben sampai setinggi 2,5

cm, kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk bersalut dilarutkan

dalam pelarut organik yang cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak

tersebut ditambahkan adsorben dengan bobot sama dengan bobot

ekstrak. Campuran ini digenis sampai homogen, dikeringkan dan

dimasukkan ke dalam corong G-3 kemudian diratakan. Permukaan lapisan

adsorben ditutup dengan kertas saring. Elusi diawali dengan pelarut non

polar dilarutkan dengan kombinasi pelarut dengan polaritas meningkat.

Jumlah pelarut yang digunakan setiap kali elusi adalah sebagai berikut:


11/29

untuk bobot ekstrak sampai lima gram diperlukan 25 ml pelarut, untuk 10-

30 g ekstrak diperlukan 50 ml pelarut. Dalam hal ini, diameter corong

dipilih sedemikian rupa sehingga lapisan ekstrak dipermukaan kolom

setipis mungkin dan rata. Masing-masing pelarut dituangkan ke

permukaan kolom kemudian dihisapkan pompa vakum. Masing-masing

ekstrak ditampung dalam wadah terpisah sehingga menghasilkan

sejumlah fraksi (6).

Kromatografi cair vakum dapat digunakan untuk fraksinasi dan

memurnikan fraksi. Metode KCV digunakan karena lebih efektif dan efisien

dalam pemisahan dibandingkan kromatografi kolom gravitasi.

Kromatografi cair vakum (KCV) pertama kali diperkenalkan oleh para

ilmuwan dari Australia untuk mengatasi lamanya waktu yang dibutuhkan

untuk separasi menggunakan kolom kromatografi klasik. Pada dasarnya

metode ini adalah kromatografi lapis tipis preparatif yang berbentuk kolom.

Aliran fase gerak dalam metode ini diaktifkan dengan bantuan kondisi

vakum. Kromatografi cair vakum pada awalnya digunakan untuk separasi

senyawaan steroid dan produk-produk natural dari laut. Kromatografi cair

vakum terdiri dari suatu corong Buchner yang memiliki kaca masir. Corong

Buchner ini diiisi dengan fase diam yang tingkat kehalusannya seperti

yang umumnya dipakai dalam kromatografi lapis tipis (70-230 mesh).

Corong Buchner yang berisi fase diam ini digunakan dalam kondisi

vakum/bertekanan, yang berakibat pada kemampuan yang dihasilkan oleh

kromatografi cair vakum akan sama dengan kromatografi gravitasi namun


12/29

diperlukan waktu yang lebih singkat. Cara asli yang diperkenalkan oleh

Coll menggunakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek,

sedangkan Targett menggunakan kolom yang lebih panjang untuk

meningkatkan daya pisah (1).

Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak, berdasarkan

absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan

dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen

kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi (7).

Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan

absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan

dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen

kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi.

Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerak

dengan cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren.

Udara yang ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat

menyebabkan peruraian produk dari ekstrak dan berubah saat pemisahan

kromatografi (5).

Keterbatasan kromatografi kolom-terbuka klasik ialah sebagai

berikut :

a. Pemisahan lambat

b. Penjerapan linarut yang tidak bolak-balik

c. Tidak dapat dipakai jika partikel terlalu kecil.

Kombinasi antara kromatografi kolom kering dan kromatografi cair


13/29

vakum memiliki kelebihan dimana laju pengelusian lebih tinggi dan

memperpendek waktu kontak linarut dengan penjerap (8).

Untuk kolom gaya tarik bumi yang memakai penjerap berukuran 60-

230 mesh (63-250 m), umumnya laju aliran sekitar 10-20 mL/cm2

penampang kolom/jam. Untuk partikel yang lebih kecil dari 200 mesh

diperlukan semacam pemompaan atau sistem bertekanan. Kemudian laju

dapat ditingkatkan sampai 2 mL atau lebih setiap menitnya, atau sampai

batas sistem tekanan (9).

Kromatografi Vakum Cair mempunyai keuntungan yang utama

dibandingkan dengan kolom konvensional yaitu :

- Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil dibanding

dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor

Gambar 2. Kromatografi Vakum


14/29

kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100l/menit)

- Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal jika digabung dengan spectrometer massa

- Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel

terbatas missal sampel klinis

Kerugian KCV (Kromatogravi Vakum Cair) :

- Membutuhkan waktu yang cukup lama

- Sampel yang dapat digunakan terbatas (1).

II.2 Uraian Sampel

II.2.1 Klasifikasi (10)

Regnum : Animalia

Divisi : Porivera

Kelas : Demospangia

Bangsa : Haplsclendae

Suku : Nephatidae

Marga : Niphates

Jenis : Niphates Olemda


15/29

BAB III

METODE KERJA

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakan antara lain gelas masir, mangkuk kaca,

alat kromatografi kolom (statif dan klem, tabung atau kolom), erlenmeyer,

botol coklat, batang pengaduk, spatel besi, sendok tanduk besi,

timbangan analitik, pipet tetes dan pipet skala, gelas ukur, dan vial

III.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan antara lain sampel spons Niphates

olemda, air suling, pelarut metanol, etil asetat, heksan, kertas saring, dan

silika halus, serta silika kasar

III.2 Cara Kerja

1. Persiapan kromatografi kolom

Pertama-tama, disiapkan alat dan bahan. Diambil secukupnya fase

diam (silika gel), dimasukkan ke dalam kolom sampai kira-kira 2/3 kolom

terisi dengan silika gel. Dimampatkan silika gel dengan cara diketuk-

ketukan. Kemudian, dikeluarkan fase diam tersebut dari kolom dan

timbang. Selanjutnya, disuspensikan fase diam dalam fase gerak. Fase

gerak yang digunakan dipilih dari kepolaran yang paling rendah, yaitu

heksan. Dihomogenkan fase diam dan fase gerak. Diletakkan kolom

dalam posisi tegak lurus dengan menggunakan statif dan klem. Dipastikan


16/29

kran pada dasar kolom telah tertutup rapat untuk mencegah aliran keluar.

Dituangkan suspensi silika gel secara perlahan-lahan. Diketuk-ketuk

dinding kolam agar silika lebih mampat dan untuk mendorong agar

gelembung udara yang ada naik ke bagian atas kolom. Setelah beberapa

lama, akan terbentuk endapan suspensi silika gel, dmana fase gerak akan

berada diatas fase diam. Dibuka kran pada dasar kolom dan dibiarkan

fase gerak mengalir sampai tinggi fase diam dan fase gerak sama atau

kurang dari 2 cm. Ditutup kran pada dasar kolom.

2. Pemisahan Komponen Kimia

Sampel Spons Niphates olemda ditimbang sesuai dengan

perbandingan fase diam yang digunakan (perbandingan silika : sampel =

100 : 1). Ditambahkan sedikit silica untuk menyerbukkan sampel. Dituang

sampel ke dalam kolom secara perlahan-lahan dengan menggunakan

pipet. Dibuka kran kolom yang terdapat pada dasar kolom dan dibiarkan

fase gerak mengalir hingga tepat berada selapis di atas fase diam.

Selanjutnya ditutup kran dan didiamkan selama beberapa menit.

Dimasukkan kertas saring diatas permukaan sampel. Kemudian,

ditambahkan sedikit demi sedikit fase gerak yang kepolarannya paling

rendah ke dalam kolom. Dibuka leran pada dasar kolom dan dibiarkan

fase gerak menetes. Ditampung fase gerak yang keluar dari kolom

sebanyak 5 mL pada tiap vial.


17/29

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil Pengamatan

No Eluen Perbandingan Volume (mL)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Heksan

Heksan : Etil asetat







Etil asetat

100%

5 : 1

3 : 1

2 : 1

2 : 1

1 : 1

1 : 3

1 : 5

100 %

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml

40 ml


18/29

BAB V

PEMBAHASAN

Kromatografi adalah pemisahan berdasarkan distribusi dua fase

yaitu fase diam dan fase gerak. Salah satu contoh kromatografi adalah

kromatografi vakum cair (KVC) dan kromatografi kolom. Perbedaan dari

kedua kromatografi ini yaitu pada proses kromatografi kolom itu

menggunakan gaya gravitasi untuk menarik sampel artinya sampel akan

keluar dengan sendirinya atau tanpa paksaan. Sedangkan kromatografi

vakum cair sampel itu dipaksa atau dihisap dengan menggunakan silang

dan tanpa tekanan dalam kondisi vakum.

Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan suatu campuran

senyawa. Kolom yang terbuat dari gelas diisi dengan fase diam berupa

serbuk penyerap (seperti selulosa, silika gel, poliamida). Fase diam dialiri

(dielusi) dengan fase gerak berupa pelarut.

Metode kolom konvensional ini dibantu dengan gaya gravitasi dan

oleh karena hanya bantuan ini sehingga prosesnya memakan waktu yang

lama. Langkah awal dari metode ini adalah semua alat dibersihkan dan

dicuci dengan metanol, termasuk vial dan kolom. Setelah itu disiapkan

bubur silikanya. Dimana proses penyiapan bubur silika itu, silika kasar

saja yang digunakan, meskipun sebenarnya silika haluspun juga bisa

digunakan. Namun, penggunaan silika halus harus dibarengi dengan

penambahan silika kasar dengan konsistensi atau bobot yang lebih besar

dibandingkan silika halus. Hal ini dikarenakan bila hanya menggunakan


19/29

silika halus akan menyebabkan silika tersebut terlalu mampat ketika

berada di dalam kolom karena rongga-rongga antar partikel terlalu kecil

sehingga menyulitkan eluen untuk mempartisi ekstrak sebab kromatografi

kolom ini hanya dibantu dengan gaya gravitasi. Silika kasar direndam

dengan heksan dalam suatu wadah sambil diaduk-aduk dengan maksud

membasahinya sehingga membuatnya bisa memadat.

Jumlah silika kasar yang digunakan untuk pembuatan bubur silika

kasar adalah 100 kali dari jumlah bobot ekstrak yang digunakan. Sisa

bobot silika dari yang telah dipersiapkan digunakan untuk mengeringkan

ekstrak pada saat penyiapan sampel dengan metode kering. Prosesnya

yaitu ekstrak dilarutkan dengan metanol atau heksan hingga larut, dan

ditambahkan sisa silika tadi, digerus hingga kering dan sisa silika yang

tidak dipakai disimpan sebagai pengganti kertas saring di atas sampel dan

dibawah eluen. Setelah penyiapan ekstrak selesai, rangkai alat kolom.

Setelah terangkai, dimasukkan sedikit kapas untuk menahan atau

menyumbat sedikit ujung kolom, dan biarkan memadat terlebih dahulu dan

dimampatkan dengan cara memukul-mukul buret kolom dengan karet

pipet tetes. Setelah itu ditambahkan sampel tadi yang sudah disiapkan

lalu dimasukkan sisa silika kasar tadi sebagai pengganti kertas saring

(sehingga proses partisi lebih maksimal), setelah itu dimasukkan

perbandingan eluen satu per satu, dimulai dari eluen yang paling non-

polar hingga ke yang polar. Maksud dari eluen yang digunakan harus dari

non-polar terlebih dahulu ke yang polar adalah agar senyawa-senyawa


20/29

yang ada didalam ekstrak tersebut terpartisi menurut tingkat kepolarannya

masing-masing karena apabila yang digunakan eluen polar terlebih dahulu

maka akan menyebabkan senyawa polar dan non-polar akan ikut tertarik

oleh eluen polar tersebut sehingga hasil partisinya pun menjadi kacau.

Jadi harus digunakan eluen non-polar terlebih dahulu agar senyawa yang

mula-mula tertarik lebih dulu adalah senyawa-senyawa non-polar dan saat

digunakan eluen polar, senyawa yang tertarikpun hanya senyawa-

senyawa polar saja, sebab tidak ada lagi senyawa non-polar yang tersisa,

sehingga hasil partisinya pun menjadi bagus.

Sampel yang mengandung campuran senyawa dituangkan ke

bagian atas dari kolom, kemudian dielusi dengan pelarut sebagai fase

gerak. Setiap senyawa/komponen dalam campuran akan didorong oleh

fase gerak dan sekaligus ditahan oleh fase diam. Kekuatan senyawa

ditahan oleh fase diam akan berbeda dengan senyawa lainnya.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografi

kolom adalah fase diam yang digunakan, kepolaran pelarut (fase diam),

ukuran kolom (diamter dan panjang kolom), kecepatan alir elusi.

Cara penggunaan kolom secara singkat adalah sebagai berikut :

Pertama-tama, kran penutup dibuka untuk membiarkan pelarut yang

sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata

pada bagian atas, dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari

bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga campuran berwarna

akan diserap pada bagian atas material terpadatkan.


21/29

Selanjutnya tambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom,

cegah sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan

dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui

kolom, kumpulkan dalam satu vial dibawah kolom. Karena pelarut

mengalir kontinyu, maka tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas

kolom sehingga kolom tidak pernah kering.

Pada kromatografi cair vakum, fase diamnya menggunakan silika

gel yang diletakkan di dalam kolom kromatografi. Ada dua cara melapisi

kolom dengan silika gel yaitu proses basah dan proses kering. Proses

basah yaitu silika gel ditambahkan dengan n-heksana hingga berbentuk

seperti bubur, lalu dituangkan kedalam kolom, dan dihisap pelarutnya

dengan mesin vakum, dan dihentikan sampai panjang kolom sesuai

dengan yang diinginkan, maka diperoleh silika gel yang padat pada kolom.

Yang kedua proses kering yaitu memasukkan silika gel yang dalam bentuk

padat langsung kekolom lalu dipadatkan.

Pada saat silika gel dicampurkan dengan n-heksana terlihat bahwa

kedua senyawa ini tidak bercampur, hal ini dikarenakan n- heksana dan

silika gel berbeda kepolarannya, yaitu n-heksana merupakan non polar

dan silika gel polar. Pada percobaan ini tidak menggunakan metanol

(CH3OH) karena senyawa ini polar, dan dapat mengakibatkan semua

senyawa akan turun. Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu

kolom kromatografi dikemas kering dengan penjerap silika gel dalam

keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum


22/29

dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah (n-heksana) dituangkan ke

permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering

dan sekarang siap dipakai. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok,

dimasukkan langsung pada bagian atas kolom dan dihisap perlahan-lahan

ke dalam kemasan dengan mengvakumkannya. Kolom, dielusi dengan

campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya

rendah (n-heksana) lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan dengan

cara elusi gradien antara n-heksana : etil asetat kolom dihisap sampai

kering pada setiap pengumpulan fraksi.

Adapun KVC ini merupakan pemisahan fraksi berdasarkan

pelarutnya. Agar fraksi tertentu turun, maka harus ditingkatkan

kepolarannya dari non polar, sedikit polar, semi polar, agak polar sampai

100% polar, hal ini dikarenakan didalam sampel itu terdapat senyawa

yang berbeda kepolarannya. Untuk meningkatkan kepolaran pelarut

dilakukan perbandingan campuran pelarut, pada mulanya pelarut non

polar dicampur dengan pelarut semi polar dengan perbandingan tertentu,

dan sampai nanti pelarut semipolar dicampur dengan pelarut polar dengan

perbandingan tertentu. Sampel atau fraksi yang turun itu sesuai dengan

kepolaran pelarut yang digunakan. Bila pelarut yang digunakan adalah n-

heksana (non polar) maka fraksi yang akan turun adalah senyawa non

polar, sedangkan senyawa polar tidak turun karena tidak larut dengan

pelarut n-heksana.


23/29

Pengaruh lebarnya kolom pada KVC mengakibatkan fraksi sampel

turun satu persatu, dan bila pelarutnya telah habis maka harus dibuat

pelarut dengan kosentrasi sama, dan diturunkan kembali fraksinya.

Sedangkan panjang kolom, mengakibatkan semakin panjang kolom maka

waktu atau cepat lambatnya turun fraksi senyawa.

Setelah fraksi senyawa didapatkan, selanjutnya dengan

menggunakan KLT kita menghitung Rf (retention fraksion), dimana bila

didapat senyawa yang Rfnya sama atau pola nodanya sama, maka

kemungkinan senyawa itu adalah sama. Adapun dari hasil vakum

diperoleh fraksi sebanyak 10 fraksi. Semua fraksi ini lalu dilakukan uji

identifikasi, yaitu KLT untuk dapat menggabung fraksi (fraksinasi) noda

yang memiliki warna atau nilai Rf yang sama.


24/29

BAB VI

PENUTUP

VI.1 Kesimpulan

Dari hasil percobaan, digunakan 9 perbandingan eluen, dimulai dari

eluen yang paling non polar : semi polar (heksan : etil asetat) ; semi polar

(etil asetat) ; semi polar : polar (etil asetat : heksan) ; hingga paling polar

(heksan).

Dari hasil percobaan diperoleh 6 fraksi yang akan dilanjutkan

dengan KLT untuk melihat noda yang memiliki nilai Rf atau warna yang

sama akan digabungkan menjadi 1 fraksi (fraksinasi).

VI.2 Saran

Sikap komunikatif antara asisten dan praktikan dipertahankan.


25/29

DAFTAR PUSTAKA

1. Adriana, Renalitha Devri. 2009. Skripsi : Aktivitas Antiplasmodium

Fraksi Non Polar Ekstrak Etanol Rimpang Temu Mangga.

Surakarta : Universitas Muhammadiah Fakultas Farmasi

2. Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Yogyakarta :

Penerbit Andi

3. http://www.chem-is-try.org Diakses tanggal 16 Oktober 2014

4. Roth, Hermann J. 1988.Analisis Farmasi. Yogyakarta : Gadjah Mada

University Press

5. Kisman .Dr. Sastro ,ddk .1994. Analisis Farmasi Cet. 2. Yogyakarta :

Gadjah Mada University Press

6. Soediro. I., dkk. 1986. Kromatografi Cepat Sebagai Cara Fraksinasi

Ekstrak Tanaman. Acta Pharmaceutica Indonesia.

7. Conners.A.K. Pharmaceutical Analysis Solvent Extraction.

Pharmaceutica Indonesia.

8. K. Hostettmann, M. Hostettmann, A. Marston. 1995. Cara

Kromatografi Preparatif. Bandung : Penerbit ITB.

9. Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar

Kromatografi. Bandung : Penerbit ITB.

10. http://www. Wikipedia//Lengkuas. Diakses tanggal 29 maret 2014.

11. Dalimartha., Setiawan. 2009. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid 6.

Jakarta: Pustaka Bunda
http://www.chem-is-try.org/http://www.chem-is-try.org/


26/29

Lampiran

SKEMA KERJA

I Kromatografi Kolom

I.I Pengemasan Kolom

Silika gel

Ditimbang &dimasukkan

Kolom

Dimampatkan& dikeluarkan

Suspensi Silika gel & fasegerak non polar (heksan)

Kolom

Dimasukkan

Dibuat

Dijepit dengan statif& klem

Kran

Dibuka

Dikeluarkan fase gerakhin a tin in a 2 cm

Ditutup

Kran


27/29

I.2 Pemisahan Komponen Kimia pada Kromatografi Kolom

Ekstrak Spons

ditimbang

Diserbukkan ekstrakdengan fase diam

dimasukkan

Kolom

dibuka

KranDibiarkan fase gerak

mengalir hingga selapisdi atas fase gerak

ditutup

Kran

Kertas saring

dimasukkan

dimasukkan

Eluen dari non polarhingga polar

Vial

ditampung


28/29

II Kromatografi Cair Vakum

II.1 Pengemasan Kromatografi Cair Vakum

Silika gel

Ditimbang &dimasukkan

Gelas Masir

Dimampatkan

Pompa Vakum

Fase gerak non

polar (heksan)

Dimasukkan

Dinyalakan

Dimampatkan silikagel dengan bantuan

pompa vakum


29/29

II.2 Pemisahan Komponen Kimia pada Kromatografi Cair Vakum

Diserbukkan

Ekstrak Spons

ditimbang

Ditambahkan dengansedikit silika gel

dimasukkan

Gelas Masir

dimasukkan

Kertas Saring

dimasukkan

Mangkuk Kaca

ditampung

Eluen dari non polarhingga polar

laporan lengkap vakum kolom klmpok 8

Documents