laporan genetika molekuler
TRANSCRIPT
-
7/25/2019 Laporan Genetika Molekuler
1/3
Laporan Genetika Molekuler
Identifikasi Bakteri Berdasarkan Sekuen DNA Penyandi 16S rRNA
Oleh
!anni "saa#ifah
B"$% P&'11'&&(1
PROGRAM S")DI BIO"*$NOLOGI
S*$OLA! PAS+ASAR,ANA
INS"I")" P*R"ANIAN BOGOR
-&1'
Pendahuluan
-
7/25/2019 Laporan Genetika Molekuler
2/3
Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkuantifikasi serta menganalisis
kualitas DNA genom dari bakteri, tumbuhan, dan cendawan.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu collection tube tabung eppendorf!,
tabung P"#, mikropipet ukuran $P, $%P, $%%P dan &%%%P! dan tip, mortar dan pestle,
erlenmeyer, setrifuge, inkubator, pengering 'akum, 'orte(, alat spin, Thermal cycler,
timbangan, hot plate, comb, cetakan agar, dangel doc.
Bahan yang digunakan pada praktikum antara lain kulturEscherichia coliD) * +,
daun nanas, sampel cendawan, larutan "TAB, " $-&!, P", /mercapto etanol,
Na0Ac $12 p) *,$!, 3t0) absolut dan 4%5, dd)$0, #nase, nitrogen cair, agarose,
buffer TA3 & (,pcr mi(, .
1etodesolasi DNA, Pemurnian, dan Pengendapan DNA 6enom
7ebanyak &,* ml kultur bakteri Escherichia coliD) * + di masukkan ke dalam
tabung eppendorf. 8ultur bakteri disentrifugasi pada kecepatan &%.%%% rpm selama $/
* menit. 7upernatan yang terbentuk dibuang, sedangkan pelet yang berada pada
tabung ditambahi sebanyak 9%% l larutan "TAB dan diresuspensi. "ampuran
pelet dan "TAB selanjutnya di inkubasi pada suhu 9* selama :% menit tabung
di bolak balik setiap &% menit! kemudian didinginkan pada es selama * menit.
"ampuran ditambahi dengan larutan kloroform isoamil alkohol "2 $-&!. Tabung
dibolak balik kemudian disentrifugasi pada kecepatan &%.%%% rpm selama &% menit.
;ase supernatan yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke tabung eppendorf baru
dengan menggunakan mikropipet untuk mengetahui 'olume supernatan yangterambil. Tabung ditambahkan larutan fenol kloroform isoamil alkohol P"2
$*$-&! sebanyak & kali 'olume supernatan ke dalam tabung. Tabung dibolak balik
sampai homogen dan disentrifugasi dengan kecepatan &%.%%% rpm pada suhu -
selama &% menit. 7upernatan yang terbentuk dipindahkan ke tabung baru dan di
tambahi Na0Ac sebanyak %,& kali 'olume supernatan dan ditambah dengan 3t0)
&%%5 sebanyak $ kali 'olume. Tabung diinkubasi pada suhu /$% selama
semalam.
-
7/25/2019 Laporan Genetika Molekuler
3/3
selanjutnya, tabung disentrifugasi dengan kecepatan &%.%%% rpm selama $* menit
pada suhu - . 7upernatan yang terbentuk dibuang, selanjutnya pellet ditambah
dengan *%% l 3t0) 4%5. Tabung disentrifugasi pada kecepatan &%.%%% rpm
pada suhu - selama &% menit. 7upernatan dibuang dan tabung yang berisi pelet
dikeringkan dengan 'akum. Pellet dicuci dengan larutan dd)$0 sebanyak $% ldan #Nase sebanyak %,$ l . Tabung diinkubasi pada suhu :4 selama &%
menit.
"endawan
7ampel cendawan digerus sampai halus menggunakan pestle dan mortar dengan
ditambah larutan nitrogen cair. 7erbuk cendawan dimasukkan ke tabung eppendorf
yang telah diisi 9%% l larutan buffer "TAB $ ( $5 P=P!. Tabung di bolak balik
agar homogen dan diinkubasi pada suhu 9* selama :% menit. Pada saat
inkubasi, tabung dibolak balik setiap &% menit sekali. Tabung selanjutnya
didinginkan ke dalam es selama * menit. 7ampel pada tabung ditambah dengan 9%%l larutan kloroform isoamil alkohol "2 $-&!, kemudian disentrifugasi
kecepatan &%.%%% rpm selama &% menit pada suhu ruang. 7upernatan yang terbentukdiambil, dipindahkan ke tabung baru dan ditambahi larutan fenol kloroform isoamil
alkohol P"2 $*$-&! sebanyak & kali 'olume supernatan. Tabung disentrifugasi
pada &%.%%% rpm selama &% menit pada suhu ruang. 7upernatan yang terbentuk
dipindahkan ke tabung baru dan ditambahi Na0Ac $12 p) *,$! sebanyak & kali
'olume dan 3t0) absolut sebanyak $/: kali 'olume. "ampuran larutan di diinkubasi
selama semalam pada suhu /$% . Tahap selanjutnya, tabung disentrifugasi
dengan kecepatan &%.%%% rpm selama $* menit pada suhu - . 7upernatan yang
terbentuk dibuang, kemudian pellet ditambah dengan *%% l 3t0) 4%5. Tabung
disentrifugasi pada kecepatan &%.%%% rpm pada suhu - selama &% menit.
7upernatan dibuang dan tabung yang berisi pellet dikeringkan dengan 'akum. Pellet
ditambah dengan larutan dd)$0 sebanyak $% l dan #Nase sebanyak : l .Tabung diinkubasi pada suhu :4 selama &% menit.
Pembuatan 6el Agarose
7ebanyak %,: gram serbuk agarosa dilarutkan dengan :% ml buffer TA3 &( pada
erlenmeyer. 3rlenmeyer ditutup dengan seal dan dilubangi, kemudian dipanaskan
dengan microwa'e pada suhu sekitar &4* hingga agarosa larut. Agarosa yang
telah larut di diamkan hingga suhunya suam/suam kuku 9% / 4% ! dan
dituang ke cetakan gel yang sudah dipasangi dengan comb.
Deteksi dan >ji 8ualitas DNA dengan 3lektroforesis
>ji 8uantitas DNA dengan 7pektofotometer