ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh:

Nama : Ariani Sukma DewiNIM : B1J010224Kelompok : 6Rombongan : IIIAsisten : Nur Cahyati

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2012

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk

hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk

dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Elektroforesis

gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar

teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan

listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju

perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan

tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel

biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai

teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-

metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau

immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada

suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik

tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis

dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).

Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau

autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan elektroforesis gel.

Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel

dengan aliran listrik. DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran

listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif. Molekul yang berukuran

besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat

melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis

selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti Ethidium

yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum elektroforesis agarosa ini adalah dapat melakukan

elektroforesis gel agarosa.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Alat yang digunakan dalam praktikum yaitu gelas ukur, labu erlenmeyer,

tabung mikrosentifuge, sarung tangan, seperangkat mikropipet beserta tipnya,

kertas parafilm, seperangkat alat elektrifororesis, UV trasiluminator, dan kamera

digital .

Bahan yang digunakan yaitu sampel DNA kromosom buah dan bakteri,

agarosa, larutan buffer TAE 50x, akuades, loading dye 6x, dan larutan Etidium

Bromid (EtBr).

B. Metode

1. Dibuat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara dicampurkan 5 ml TAE

50x ke dalam 245 ml akuades.

2. Dibuat gel agarosa 1% dengan cara ditimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan

ke dalam buffer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan

hingga larut sempurna.

3. Disiapkan baki gel agarosa, dilekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa.

4. Dipasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosadengan

posisi hamper menyentuh dasar baki.

5. Diperiksa suhu larutan agarosa sampai hangat-hangat kuku, ditambahkan 1µl

etidium bromid.

6. Dihomogenkan larutan agarosa, kemudian dituangkan ke dalam baki gel

agarosa. Dibiarkan hingga padat.

7. Diambil sisir dengan hati-hati dan dilepaskan selotip dari ujung baki.

8. Dimasukkan baki yang berisi agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang

telah diisi larutan buffer TAE 1x.

9. Dimasukkan 12 µl sampel DNA buah dan bakteri ditambahkan loading dye

6x dengan perbandingan 2: 8 untuk bakteri dan 4 : 8 untuk buah ke dalam

sumuran gel agarosa yang sebelumnya telah dihomogenkan antara loading

dye dan smapel DNA.

10. Dihubungkan tangki elektroforesis dengan power supply sesuai kutub yang

ada dalam tangki dan diatur waktu running untuk V=100V, mA= 400 mA,

dan waktu 30 menit.

11. Setelah waktu running selesai, gel diambil dan direndam dalam larutan EtBr

selama 30 menit.

12. Diamati dalam UV transiluminator.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Gambar hasil pengamatan gel agarosa

Gambar gel agarosa setelah divisualisasi

B. Pembahasan

Praktikum kali ini digunakan agarosa karena agarosa memiliki beberapa

kelebihan seperti mudah didapat, harganya relatif murah, tidak bersifat toksik,

serta memiliki pori yang kecil. Agarosa merupakan polisakarida yang diekstrak

dari rumput laut. Hasil dari elektroforesis gel agarosa akan menunjukkan warna

biru dari loading dye pada posisi paling depan kemudian plasmid DNA berwarna

orange terang. Berdasarkan hasil praktikum diperoleh bahwa laju migrasi

elektroforesis gel agarosa menunjukkan pergerakan ke arah positif. Hal ini sesuai

dengan pustaka yang menyebutkan bahwa teknik elektroforesis pada dasarnya

berdasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negatif pada pH netral

dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan elektroforesis

dengan memberikan daya listrik di kedua kutub maka DNA akan bergerak ke

kutub positif, inilah prinsip kerja elektroforesis gel agarosa. Agarosa merupakan

gel yang memiliki resolusi lebih rendah dalam pemisahan tetapi dapat

memisahkan sampel yang berukuran sampai puluhan kilo basa. Agarosa terbuat

dari polisakarida, dilarutkan dengan buffer dan dipanaskan, setelah dingin akan

membentuk gelatin yang padat (Ripani, 2010).

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan

dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada

pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang

bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik

dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut

akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul

tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula

pada bentuk molekulnya. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk

memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan

molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda

dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada

kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga

pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai

(Sumitro et al., 1996).

Macam elektroforesis antara lain yaitu elektroforesis kertas dan

elektroforesis gel. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari

kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,

terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi

konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas

tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang

digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas

zat terlarut. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai

fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel

dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan

biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel

berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media

(Fatchiyah, 2006).

Metoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul

bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan

listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid.

Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang

berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan

elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara

vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan

urutan DNA (sekuensing) (Sumitro, 1996).

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur

yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus

listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak

ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik

dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan

bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat

dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan

fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka

ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen

pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV.

Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita

DNA standar (Sambbrook, 1989).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA

dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi

fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui

ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar

ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan

etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di

dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet

(Fatchiyah, 2006).

Elektroforesis gel agarosa dapat dipakai secara efektif untuk mendeteksi

dan mempersiapkan karakterisasi plasmid DNA yang muncul pada isolasi klinis

dan pewarnaan laboratoris dari mikroorganisme gram negatif. Metode ini sangat

sensitif dan tidak memerlukan radioisotop atau ultrasentrifugasi. Selanjutnya,

untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarosa

digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah,

seperti intercalating agent etidium bromide (EtBr). Setelah elektroforesis, gel

diwarnai dengan EtBr selama kurang lebih 30 menit (Gautom, 1997). Hanya

sedikit DNA dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada

media UV-transilluminator (Sambrook et al, 1989).

Menurut Ripani (2010) fungsi alat dan bahan yang digunakan dalam

praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :

Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam

larutan sebagai penghantar listrik.

Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran.

Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela

basa nukleotida.

UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel

agarosa.

Aquades sebagai pelarut

Baki gel agarosa sebagai cetakan gel agarosa

TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH

Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram

EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA

Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa

Tangki elektroforesis untuk running DNA

Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan

loading dye

Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading

dye

Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat

merusak DNA

Menurut Atang (2007) hubungan antara berat molekul DNA dengan

kerapatan agarosa terhadap laju migrasi adalah agarosa gel akan membentuk

kerangka-kerangka atau lubang-lubang yang kompleks untuk di lewati molekul

DNA menuju elektroda positif. Makin kecil molekul DNA semakin cepat laju

migrasinya, sebaliknya makin besar molekul DNA maka semakin lambat laju

migrasinya. Komposisi gel juga menentukan ukuran molekul DNA yang dapat

dipisahkan. Jika sumuran gel agarosa menyentuh dasar baki tempat pembuatan gel

agarosa maka DNA tidak dapat melakukan migrasi.

DNA gel elektroforesis adalah teknik biologis eksperimental penting dan

sekuensing DNA dapat didefinisikan olehnya. Gel elektroforesis terdiri dari

pemecahan molekul menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu. Fragmen

ini tersebar di media poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan listrik

diterapkan. Masing-masing fragmen memiliki muatan listrik yang berbeda dan

berat molekul, menyebabkan mereka harus bermigrasi pada tingkat yang berbeda

melalui gel (Der Lee, 2011).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan bahwa :

1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

2. Prinsip kerja dari elektroforesis gel agarosa adalah memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.

3. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa DNA tidak terfragmentasi secara

sempurna. Hal ini disebabkan oleh berbagai faktor diantaranya kemungkinan

DNA mengalami kerusakan, penyimpanan DNA hasil PCR yang terlampau

lama, maupun pemotongan yang kurang sempurna pada saat melakukan PCR,

hingga kesalahan pada saat memasukkan DNA ke dalam sumuran.

B. Saran

Saran yang dapat diberikan pada praktikum ini adalah pada saat

memasukkan sampel DNA kedalam sumuran harus secara hati-hati agar tidak

menyebar keluar sumuran.

DAFTAR REFERENSI

Atang. 2007. Pengenalan Agarose Gel Electrophoresis. Universitas Negeri Lampung, Bandar Lampung.

Der Lee et al., 2011. Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using Image Processing Algorithms. J. Biomedical Science and Engineering, 2011, 4, 523-528

Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Laboratorium Sentral Biologi Molekuler dan Seluler Departemen Biologi Universitas Brawijaya. Malang

Gautom, Romesh K. 1997. Rapid Pulsed-Field Gel Electrophoresis Protocol for Typing of Escherichia coli O157:H7 and Other Gram-Negative Organisms in 1 Day. Journal Of Clinical Microbiology. Vol. 35, No. 11: 2977–2980

Ripani, M.. 2010. Diagnostik Molekuler. Teknologi Laboratorium Kesehatan (TLK) di Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin, Makassar.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama Liberty. Yogyakarta.

Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. KursusTeknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPAUniversitas Brawijaya. Malang