UJI STERILITAS

Achmad Fauzi Al’amrie, S.Farm

PENCEGAHAN TERHADAP KONTAMINASI MIKROBA

PENGUJIANSTERIL

kondisi aseptik

untuk menghindari kontaminasi

Media kultur dan suhu inkubasifluid thioglycollate medium terutama ditujukan untuk kultur bakteri anaerob. Namun, dapat juga mendeteksi bakteri aerob.

Fluid thioglycollate medium diinkubasi pada suhu 30-35oC.

Soybean-casein digest medium untuk pengkayaan jamur dan bakteri aerob.

soybean-casein digest medium diinkubasi pada suhu 22,5oC.

Fluid Thioglycollate MediumL-Cystine 0.5 g

Sodium chloride 2.5 g

Dextrose Monohydrate/anhydrous 5.5/5.0 g

agar 0.75 g

Yeast Extract (water-soluble) 5.0 g

Pancreatic Digest of casein 15.0 g

Sodium thioglycolic Acid 0.5 g

Or Thioglycolic Acid 0.3 mL

Resazurin Sodium Solution (1 in 1000),freshly prepared

1.0 mL

Purified Water 1000mL

Soybean-Casein digest Medium

Pancreatic Digest Of Casein 17.0 g

Papaic Digest of Soybean Meal 3.0 g

Sodium Chloride 5.0 g

Dibasic Potassium Phosphate 2.5 g

Dextrose Monohydrate/Anhydrous

2.5/2.3 g

Purified Water 1000 mL

Media untuk penisilin atau sefalosporin

Media pengujian untuk penisilin atau sefalosporin menggunakan fluid thioglycollate medium dan soybean-casein digest medium

Penambahan β-laktam secara aseptis untuk menonaktifkan penisilin atau sefalosporin

Metode uji kesesuian menggunakan staphylococcus aureus sebagai pembanding (konsentrasi β-laktam harus tepat)

Mikroorganisme yg digunakan dalam pengujian pertumbuhan dan metode uji kesesuaianAerobicbacteria

staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276

Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275

Anaerobic bacterium

Clostridium sporogenes ATCC 19, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437, NBRC 14293

Fungi

Candida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594

Aspergillus brasiliensis (aspergillus Niger)

ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455

Pengujian pertumbuhan aerob, anaerob, dan jamur

•Penyiapan media

•Mikroorganisme yang digunakan dalam pengujian : Clostridium sporogenes, pseudomonas aeruginosa, dan Staphylococcus aureus.

Preparasi

•media thioglycollate untuk sporogenes clostridium (tidak lebih dari 100 cfu)

•pemipetan soybean-casein digest medium untuk Aspergillus brasiliensis, Bacillus subtilis, dan Candida albicans.

Pengkayaan

•Untuk bakteri tidak lebih dari 3 hari

•Untuk jamur tidak lebih dari 5 hari

Inkubasi

CAIRAN PENGENCER DAN PENCUCI UNTUK FILTRASI MEMBRANE

fLUID A

1 gram jaringan hewan yang

telah diuraikan oleh enzim

pepsin

ad air sampai 1 liter

saring atau sentrifugasi, pH diatur 7.1 ± 0.2

Sediaan uji yang mengandung senyawa

gol. Penisilin/Sefalosporin

(beta laktma)

+ enzim penisilinase

Lanjutan...fLUID B

1 liter Fluid A

+ 1 ml tween 80

pH diatur 7.1 ± 0.2.

Digunakan bila

mengandung lesitin atau

sediaan minyak atau

untuk uji peralatan steril dengan menggunakan penyaring membran

fLUID K

1 gram jaringan hewan yang

telah diuraikan oleh enzim

pepsin

+ 3 gram beef extract

ad air sampai 1 liter

pH diatur 6.9 ± 0.2

setelah sterilisasi

Semua cairan pembilas harus

disterilkan dengan otoklaf

Lanjutan.....

Uji Kesesuaian Metode•Inoku

lasi mikroorganisme ke dalam pengencer steril untuk membilas filter

Filtrasi membran

•Inokulasi mikroorganisme ke dalam media

Inokulasi langsung

Ada pertumbuha

n mikroorgani

sme

Bandingkan dengan kontrol

media tanpa produk

Uji sterilitas tanpa

modifikasi

Tidak ada pertumbuha

n mikroorgani

sme

Bandingkan dengan kontrol

media tanpa produk

Lakukan modifikasi

kondisi dan ulang uji

kesesuaian metode

Uji kesesuaian

metode

Produk baru

Terdapat perubahan

kondisi pengujian

Jumlah Sediaan yang Akan Diuji

Jumlah jumlah sediaan yang diuji tercantum pada tabel 3 kecuali bila dinyatakan lain

Bila jumlah sampel mencukupi (lihat tabel 2), sampel dapat dibagi kedalam beberapa bagian untuk ditambahkan kedalam media spesifik pengujian dapat menggunakan dua atau lebih media spesifik).

Bila jJumlah sediaan yang diuji tercantum dalam tabel 3 kecuali dinyatakan lainumlah sampel tidak mencukupi untuk dilakukan pembagian, gunakan dua kali jumlah sampel yang tercantum pada tabel 3.

UJI STERILITAS UNTUK PRODUK YANG AKAN DIUJI

Pengujian Sampel

Filtrasi Membran

sediaan yang mudah disaring; sediaan

yang berkadar alkohol tinggi atau

sediaan mengandung minyak; sediaan yang larut dalam pelarut

air atau minyak, sediaan yang tidak

memiliki efek antimikrobial pada kondisi pengujian. Inokulasi Langsung

Media Kultur

Filtrasi Membran

Digunakan membran filter dengan ukuran pori tidak lebih besar dari 0,45 µm.

Mis

aln

ya

Filtrat Cellulose nitrate yang digunakan untuk sampel larutan, minyak, dan larutan kadar alkohol lemah

Filtrat Cellulose acetate yang digunakan untuk larutan dengan kadar alkohol tinggi

LARUTAN

Gunakan sejumlah sampel sesuai dengan tebel 2 dan

3 (jika perlu dilakukan pengenceran)

Dilakukan penyaringan

Pindahkan membran pada media pertumbuhan yang sesuai secara aseptik atau potong membran menjadi 2 bagian dan masukkan

membran ke dalam media masing-masing yang

sesuai

Inkubasi media tidak lebih dari 14 hari

PADATAN YANG TERLARUT

Larutkan sejumlah sampel (sesuai dengan tabel 2 dan 3) dengan pelarut yang sesuai misalnya aqua pro injeksi, salin steril, atau fluid A

Lakukan prosedur yang seperti tercantum untuk sampel larutan dengan menggunakan membran dan pelarut yang sesuai.

Gunakan sejumlah produk untuk masing-masing media tidak lebih

dari jumlah yang tercantum dalalm tabel 2 dan 3

Minyak dan cairan berminyak yang mempunyai viskositas yang

rendah masih mungkin dapat disaring tanpa pengenceran

melalui membran

Minyak dengan viskositas tinggi jika perlu diencerkan terlebih dahulu dengan menggunakan pengencer steril yang sesuai misalnya isopropyl myristate

yang menunjukkan tidak mempunyai aktivitas antimikroba

ketika dalam kondisi uji

Biarkan minyak berpenetrasi melewati membran

saring dengan menggunakan tekanan atau dihisap secara

perlahan

Cuci membran minimal tiga kali dengan cara melewatkan kurang lebih 100 ml larutan steril yang

sesuai misalnya Fluid A ke dalam membran dimana larutan

tersebut mengandung emulgator yang sesuai misalnya polisorbat 80 dengan konsentrasi 10 g per

L (Fluid K)

Pindahkan membran ke dalam media pertumbuhan, inkubasi seperti pada sampel larutan

MINYAK DAN CAIRAN BERMINYAK

SALEP DAN KRIM

Gunakan sejumlah produk untuk masing-masing media tidak lebih dari jumlah yang

tercantum dalalm tabel 2 dan 3

Salep dengan basis lemak dan emulsi air dalam minyak dapat diencerkan sampai 1 % ke dalam isopropyl myristate

dengan pemanasan jika diperlukan tetapi tidak lebih dari 40o, kecuali jika diperlukan

pemanasan lebih dari 44o

Saring secepat mungkin

Dilakukan prosedur seperti yang tercantum untuk sampel

minyak dan cairan berminyak.

SEDIAAN SOLID UNTUK INJEKSI SELAIN ANTIBIOTIK

Preparasi sampel sesuai dengan yang

tercantum dalam label, kemudian

dilakukan prosedur seperti yang tercantum

untuk sampel larutan atau minyak dan

cairan berminyak. (catatan: jika diperlukan,

dapat ditambahkan pengencer untuk

membantu ketika proses penyaringan).

ANTIBIOTIK SOLID UNTUK INJEKSI

Produk dengan isi < 5 g

Dari 20 wadah masing-masing masukkan sekitar 300 mg sediaan solid ke dalam 500 ml wadah steril

secara aseptik

Larutkan dengan 200 ml Fluid A dan dihomogenkan

Untuk liquid atau suspensi, masukkan sejumlah sampel ekuivalen

dengan 300 mg sediaan solid ke dalam 500 ml wadah steril, larutkan

dengan 200 ml Fluid A dan dihomogenkan

Kemudian lakukan prosedur sesuai dengan yang tercantum untuk sampel

larutan atau minyak dan cairan berminyak.

Produk dengan isi ≥ 5 g

Dari 6 wadah masing-masing masukkan sekitar 1 g sediaan solid

ke dalam 500 ml wadah steril secara aseptik

Larutkan dengan 200 ml Fluid A dan dihomogenkan

Untuk liquid, masukkan sejumlah sampel ekuivalen dengan 1 g sediaan solid ke dalam 500 ml wadah steril, larutkan dengan 200 ml Fluid A dan

dihomogenkan

Kemudian lakukan prosedur sesuai dengan yang tercantum untuk sampel

larutan

ANTIBIOTIK SOLID, BULK, DAN CAMPURAN

Secara aseptik ambil sejumlah sampel

sesuai dengan tabel 2, ekuivalen dengan 6 g

sediaan solid, masukkan dalam 500 ml

wadah steril. Larutkan dalam 200 ml Fluid A

dan dicampur. Kemudian lakukan prosedur

sesuai dengan yang tercantum untuk

sampel larutan.

PRODUK AEROSOL STERIL

Untuk produk aerosol steril, bekukan wadah

dengan menggunakan alcohol-dry ice

sampai -20o selama kurang lebih 1 jam.

Tambahkan 100 ml Fluid D ke dalam wadah

dan homogenkan secara perlahan.

Kemudian lakukan prosedur sesuai dengan

yang tercantum untuk sampel larutan atau

minyak dan cairan berminyak.

ALAT DENGAN LABEL STERIL

Secara aseptik lewatkan Fluid D melewati

alat yang akan diuji. Tampung fluid ke

dalam wadah steril, dan kemudian lakukan

prosedur sesuai dengan yang tercantum

untuk sampel larutan atau minyak dan

cairan berminyak.

Cara Inokulasi Langsung pada Media

med

ium

Pindahkan sejumlah sampel yang akan diuji sesuai dengan tabel 2 dan tabel 3 secara langsung pada media sampai volume produk tidak lebih dari 10% dari volume medium atau bila dinyatakan lain.

netralisasi

Senyawa penetralisir

Pengenceran dengan media

• Cairan berminyak• Salep dan Krim• Benang Bedah dan Benang Operasi Lainnya• Sediaan Solid• Kapas yang Dimurnikan, Kasa, Perban Bedah

dan Bahan Lain Sejenis• Alat Steril

Penelusuran dan interpretasi Hasil

Kesimpulan pemeriksaan media sebagai bukti makroskopik pertumbuhan mikroba dilihat selama interval masa inkubasi

Jika bahan yang diuji terdapat kekeruhan, sehingga adanya pertumbuhan mikroba tidak dapat segera ditentukan oleh pemeriksaan visual, maka 14 hari setelah awal pemindahan porsi inkubasi (masing-masing tidak kurang dari 1 ml) ke vessels dari media yang sama

inkubasi original dan transfer vessels tidak kurang dari 4 hari

Jika tidak ada bukti pertumbuhan mikroba ditemukan

Jika bukti pertumbuhan mikroba ditemukan, kecuali dapat dibuktikan dengan jelas bahwa tes itu tidak valid untuk penyebab yang tidak terkait dengan produk yang akan diperiksa

Jika tidak ada bukti pertumbuhan mikroba ditemukan dalam tes ulang, yang diperiksa produk sesuai dengan tes untuk sterilitas

produk diperiksa

sesuai dengan

tes untuk sterilitas

Jika ada bukti pertumbuhan mikroba ditemukan

Jika pertumbuhan mikroba ditemukan dalam tes ulang,

produk yang diperiksa tidak sesuai dengan tes untuk sterilitas.

Tes mungkin dianggap tidak valid hanya jika satu atau lebih kondisi berikut ini terpenuhi:

Jika data pemantauan mikrobiologi dari fasilitas pengujian sterilitas

menunjukkan kesalahan

Jika sebuah tinjauan prosedur pengujian

yang digunakan

selama pengujian tersebut

mengungkapkan

kesalahan

Jika Pertumbuhan

mikroba ditemukan

dalam kontrol negative

Jika setelah penentuan identitas

mikroorganisme terisolasi

dari tes, pertumbuhan

spesies ini dianggap

menegaskan kesalahan

sehubungan dengan

material dan atau teknik

yang digunakan

dalam melakukan

prosedur uji sterilitas.Jika tes ini dinyatakan tidak sah, hal ini diulang dengan

jumlah yang sama seperti pada unit pengujian awal

 PENERAPAN UJI UNTUK SEDIAAN

PARENTERAL, SEDIAAN MATA DAN

SEDIAAN LAIN UNTUK MEMENUHI UJI STERILITAS

•Bila menggunakan teknik filtrasi membran, gunakan, bila memungkinkan, seluruh isi kontainer, tetapi tidak kurang dari jumlah yang disyaratkan dalam Tabel 2, diencerkan bila perlu sekitar 100 mL dengan larutan steril yang cocok, seperti Fluid A.

•Bila menggunakan teknik inokulasi langsung media, gunakan jumlah sampel sesuai dengan tabel 2, kecuali dinyatakan lain. Tes sterilitas bakteri dan jamur dilakukan pada sampel yang sama dari produk yang akan diperiksa. Ketika volume atau jumlah dalam wadah tunggal tidak cukup untuk melaksanakan tes ini,maka isi dari dua atau lebih wadah yang digunakan untuk mengokulasi media yang berbeda