ISOLASI, PEMURNIAN, DAN IDENTIFIKASI KURKUMINOID DARI KUNYIT (Curcuma longa L.) DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM ABSTRAK

Kunyit, Curcuma longa L. berasal dari keluarga Zingiberaceae merupakan rempah rempah yang banyak dibudidayaka di india dan negara negara Asia lainnya. Kunyit kaya akan kurkuminoid dan diakui sebagai spektrum aktivitas biologi. Penelitian ini difokuskan pada pelarut untuk ekstraksi kurkuminoid, isolasi dan pemurnian kurkuminoid dengan kolom kromatografi yang diikuti dengan analisis kemurnian oleh HPLC. Pelarut yang digunakan berbeda pada setiap metode yang dilakukan, diantaranya aseton pada proses ekstraksi untuk menunjukkan hasil maksimum masing masing kurkminoid. Sedangkan pada pra-uji TLC untuk pemisahan kurkuminoid digunakan kloroform : methanol pada 95 : 5 menunjukkan resolusi yang lebih baik dengan nilai Rf sebesar 0,75; 0,55; 0,27 yaitu Kurkumin(C), Demethoxycurcumin (DMC), Bisdementhoxycurcumin (BDMC). Ekstrak aseton dipisahkan dengan kromatografi kolom silika gel dengan kloroform: methanol yang meningkatkan polaritas. Jumlah kurkuminoid dari masing masing fraksi kurkuminoid ditentukan dengan UV spektrofotometri. Kristalisasi masing masing senyawa dilakukan dengan menggunakan kloroform : methanol (5 : 2) pada suhu 5o C. Kurkuminoid yang terisolasi (C, DMC, dan BDMC) menampakkan puncak tunggal masing masing pada retensi 10.81, 12.79, 13.03 pada HPLC.PENDAHULUAN

Curcuma longa L. khas dari tumbuhan dengan rimpang tebal berdaging dan daun yang mebentuk kelopak yang merupakan ciri keluarga Zingiberaceae. Kunyit merupakan tanaman asli Asia tropis Selatan yang membutuhkan suhu antara 20oC dan 30oC, dan sejumlah curah hujan tahunan. Kunyit dikenal sebagai obat tradisional di India. Kurkumin (C), merupakan zat pewarna utama di Curcuma longa dan mengandung dua senyawa yang terkait yaitu demethoxycurcumin (DMC) dan bisdemethoxycurcumin (BDMC), yang dikenal sebagai kurkuminoid. Struktur kimia dari tiga kurkuminoid ditunjukkan pada Gambar 1. Total kurkuminoid berjarak sekitar 4-6%, kunyit juga mengandung minyak esensial 2-4% dan 2-3% dari minyak dan berbagai minyak atsiri, termasuk tumeron, atlantone, dan zingiberene. Konstituen lainnya termasuk gula, protein dan resin. Nilai produk kunyit berdasarkan senyawa kurkuminoid dan diperkirakan berdasarkan absorbansinya pada 420 nms.Kurkuminoid yang polifenol memiliki warna kuning. Mereka memiliki kelarutan rendah dalam air pada asam dan pH fisiologis, dan juga menghidrolisis cepat dalam basa. Kurkuminoid yang larut dalam dimetil sulfoksida (DMSO), aseton dan etanol. Mereka mudah terurai saat terkena cahaya terang, suhu tinggi atau pada kondisi oksidatif. Kurkuminoid pada kunyit digunakan untuk beberapa obat tradisional atau alam oleh masyarakat, dan beberapa diantaranya termasuk antioksidan, anti-inflamasi, efek anti kanker dan efek hipoglikemik pada manusia. Meskipun struktur kimia kurkumin ditentukan dalam abad ke-19, nilai yang sangat besar pada molekul ini sedang diwujudkan dengan beberapa penelitian yang luas pada perusahaan farmasi dan potensi nutraceutica. Kandungan total kurkuminoid dalam bubuk kunyit memiliki peran penting dalam aktivitas antioksidan dan produk efektivitas. Kandungan dari kurkuminoid dapat bervariasi dalam rimpang kunyit yang tumbuh dizona agroklimat yang berbeda. Kurkuminoid yang diamati untuk spektrum secara luas pada kegiatan biologis, potensi penggunaan kurkumin dalam pencegahan kanker adalah subjek laboratorium intensif dan penelitian klinis. Baru baru ini dilaporkan bahwa efek kurkuminoid adalah diperiksa pada poliferasi MCF-7 tumor payudara manusia. Sel-sel yang demethoxycurcumin adalah penghambatan terbaik MCF-7, sel diikuti oleh kurkumin danbisdemethoxycurcumin. Sifat ini dapat ditingkatkan melalui peningkatan biovailabilitas kurkuminoid dengan pendekatan berbeda dan subjek laboratorium yang intensif dan penelitian klinis. Meskipun, kurkumin memiliki lebih sifat farmakologi, jumlah total kurkuminoid diserap oleh sistem hewan jauh lebih sedikit. Pencampuran kurkumin dengan minyak esensial standar kunyit meningkatkan penyerapan dan biovalailabilitas dalam sistem hewan.Pilihan pelarut untuk ekstraksi terbatas pada beberapa kemurnian pelarut. Dari sudut pengolahan, pilihan ditentukan oleh efisiensi ekstraksi karakteristik komponen individu renpah-renpah, optimasi dalam hal hasil oleoresin dengan sifat penanganan yang diinginkan. Heksana, alcohol, dan etilena diklorida umumnya telah digunakan dalam ekstraksi oleoresin rempah-rempah. Dari pertimbangan kelarutan konstituen aktif, kurkuminoid yang sukar larut dalam pelarutt hidrokarbon. Alcohol dan aseton yang ekstraktan yang baik dan hasil dapat juga diharapkan akan tinggi karena ekstraksi non-polar. Ekstraksi soxhlet bubuk kunyit dengan aseton memberikan hasil sekitar 5,0% yang mengandung 42% kurkuminoid dalam 4 sampai 5 jam. Aseton sebagai pelarut sedikit unggul alcohol dan etilena diklorida, senyawa kurkuminoid juga pada sisi yang tinggi, menunjukkan ekstraksi selektif. Hasil ekstraksi dimiliki oleh aseton. Namun dilaporkan memberikan hasil yang tinggi dari kurkuminoiddari ekstraksi alkohol.Sejumlah penelitian yang dilakukan untuk memisahkan pigmen kurkuminoid dengan kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi lapis tipis kinerja tinggi (HPTLC), dan kromatografi kolom (CC). Fase diam yang paling umum digunakan adalah silika gel dengan sistem pelarut yang berbeda termasuk benzene, etil asetat, etanol, kloroform, asam asetat, hehksana dan methanol untuk pemisahan pada kromatografi [6,12]. Metode HPLC adalah sensitive, tepat, dan akurat untuk deteksi dan kuantifikasi kurkuminoid dalam ekstrak rimpang Curcuma longa. Pemisahan dengan kinerja tinggi kromatografi cair (HPLC) dilakukan sebagian besar pada fase terbalik menggunakan campuran air, asetonitril, etanol, dan methanol. Karena pigmen kurkuminoid bervariasi dalam struktur kimia, mungkin karakteristik serta sifat funngsional akan bervariasi. Sebagai senyawa DMC dan BDMC tidak tersedia secara komersial,itu mungkin penting untuk mendapatkan pigmen kemurnian tinggi untuk studi rinci pada kimianya dan atribut fisiologis. Oleh karena itu penting untuk mendapatkan pigmen murni dan ciri mereka secara individu untuk mempelajari sifat biologis mereka.BAHAN DAN METODE

Bahan:

Bahan yang digunakan adalah akar kunyit Curcuma longa (Turmeric) dan kurkumin standar.

Metode:

Ekstraksi Kurkuminoid

Rimpang kunyit segar dibersihkan (dicuci) dengan aquadest, kemudian diiris tipis tipis lalu dikeringkan selama 1 minggu dan dikeringkan kembali dengan oven pada suhu 50C selama 6 jam. Akar kunyit yang telah kering disiapkan + 20 gram di dalam timbel dan diletakkan pada peralatan soxhlet yang diatur variasi pelarutnya dari non polar polar. 150 mL pelarut ditambahkan dan diekstrak berdasarkan pada titik didih masing masing pelarut selam 6 jam. Pelarut yang digunakan adalah heksana (BP=69C), kloroform (61 C), etil asetat (77), metanol (65), dan aseton (56,53). Satu sampel diekstrak dengan heksana selama 2 jam dan ekstrak heksana dibuang dan bubuknya diekstrak kembali dengan methanol selam 6 jam. Setelah selesai ekstraksi, ekstrak coklat tua kemudian didinginkan, disaring, dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator, dan divakumkan untuk mendapatkan ekstrak kering mentah (kasar) yang berwarna orange kehitaman. Setiap sampel kunyit mentah diekstrak dengan metode yang sama dan hasilnya dihitung

Penentuan Kurkuminoid : dengan analisis HPLC

Prosedur:

i) Preparasi Sampel : sampel ditimbang secara teliti sebesar 25 mg dan dilarutkan dalam aseton. Kemudian dipipet 1 mL dan dilarutkan menggunakan aseton hingga 5 mL. Selanjutnya disaring dengan saringan membran 0,2m.ii) Pengondisisan kromatografi : sampel dianalisis dengan HPLC. Sampel sebanyak 20 l diinjeksikan dan elusi dilakukan dengan sistem pelarut gradien dengan laju alir dari 1.0ml / min pada suhu kamar. Kolom yang digunakan adalah C18 (250X4.6mm), fase gerak 40% THF dan 60% air mengandung asam sitrat 1%, pH disesuaikan dengan 3,0 menggunakan larutan kalium hidroksida pekat dan diukur dalam gelombang panjang 420nm.

Pemisahan Kurkuminoid dengan KLT menggunakan sistem pelarut yang berbeda

Ekstrak aseton diuji dengan KLT untuk mengetahui adanya 3 komponen kurkuminoid. Plat KLT yang dilapisi gel silika (Merk-60 F254, 0.25mm tebal) dikembangkan menggunakan tangki kaca Camag twintrough yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak selama 1 jam dan setiap lempeng dikembangkan untuk ketinggian sekitar 10cm. Komposisi fase gerak dioptimalkandengan menggunakan pelarut yang berbeda dari berbagai polaritas. Setelah plat dipindahkan dan dikeringkan, spot yang terbentuk yang dilihat dalam sinar UV.

Kromatografi kolom

Persiapan Sampel

100 gram bubuk rimpang kunyit dimasukkan ke dalam ekstraksi soxhlet menggunakan pelarut aseton selama 6 jam. Ekstrak kemudian disaring dan dipekatkan dengan rotary evaporator, oleorosin yang dihasilkan diendapkan dengan petroleum eter dan dikeringkan dengan vakum, campuran kurkuminoid ini mengandung kurkumin, dimetoksi kurkumin, bisdimetoksi kurkumin.

Silica gel kromatografi kolom

Aseton dimasukkan ke dalam kromatografi kolom yang mempunyai gelas kolom berisi silica gel (60-120 mesh). Sekitar 5 gram kurkuminoid dicampur dengan 8 gram silica gel dan dimuat dalam kolom dengan ukuran 46x2 cm kemudian dielusi dengan kloroform yang diikuti oleh kloroform:methanol dengan bertambahnya kepolaran. Semua fraksi yang dikumpulkan dipisahkan dengan KLT plat silica gel menggunakan kloroform:methanol (95:5) sebagai pelarut dan didapatkan spot berwarna kuning. Fraksi yang sama dengan nilai Rf dikumpulkan dan pelarut organik telah dihilangkan dengan rotary evaporator. Total kandungan kurkuminoid setiap kurkuminoid yang dikumpulkan dianalisis dengan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 420 nm.

Pemurnian setiap kurkuminoidKurkuminoid yang didapatkan dari kromatografi kolom dilarutkan dalam metanol dan dipanaskan. Setelah pelarutan selesai ditambahkan kloroform untuk mendapatkan rasio metanol: kloroform 5: 2 dan disimpan pada suhu 5 C selama semalam. Kristal yang diperoleh dipisahkan dengan penyaringan. Kristal diendapkan dengan petroleum eter. Kemurnian kristal dianalisis dengan HPLC.HASIL DAN DISKUSIKurkuminoid memiliki sifat biologis yang sangat besar, kurkumin (C) bermanfaat untuk banyak sifat obat. Baru-baru ini analog kurkumin dilaporkan untuk aktivitas biologis. Demethoxycurucmin (DMC) adalah penghambatan terbaik MCF-7 sel. Bisdemethoxycurcumin (BDMC) aktif untuk modulasi MDR-1 ekspresi gen. Senyawa II dan III tidak tersedia secara komersial. Oleh karena itu untuk mempelajari sifat biologis kurkuminoid perlu mengisolasi senyawa pada kemurnian tinggi. Dalam penelitian ini aseton adalah pelarut yang cocok untuk ekstraksi kurkuminoid. Profil HPLC dari ekstrak kurkuminoid mentah menunjukkan kurkumin (C), dan analog DMC dan BDMC muncul pada 22,8%, 14,2%, 6,5% masing-masing spiking dengan standar.Skrining pelarut untuk ekstraksiPelarut yang berbeda dengan berbagai polaritas digunakan untuk ekstraksi kurkuminoid dari rimpang kunyit. Variasi yang digunakan adalah Hexane, Kloroform, Etil asetat, Metanol, Aseton. Setelah berkonsentrasi untuk setiap ekstrak hasil total ditentukan dan komposisi persentase kurkuminoid individu didapatkan dalam ekstrak dianalisis dengan HPLC yang ditampilkan dalam tabel 1. Identitas masing-masing puncak dikonfirmasi oleh penentuan waktu retensi dan spiking dengan standar. Kurkumin ditemukan sebagai senyawa utama dalam semua ekstrak yang diuji diikuti oleh demethoxycurcumin dan bisdemethoxycurcumin. Dalam ekstrak menggunakan aseton menghasilkan kurkuminoid individu dengan jumlah optimal dibandingkan dengan kurkuminoid individu dalam semua ekstrak pelarut lainnya. Persentase C, DMC, BDMC dalam ekstrak aseton adalah 22,8%, 14,2%, 6,5%. Oleh karena itu ekstraksi dengan aseton bisa menjadi pelarut yang paling baik untuk ekstreaksi kurkuminoid.

Pemisahan kurkuminoid dengan KLT menggunakan pelarut yang berbeda sistem.

Komposisi yang berbeda dari fase gerak diuji di TLC untuk pemisahan kurkuminoid individu dan nilai-nilai Rf yang telah ditentukan ditunjukkan dalam tabel 2. resolusi yang diinginkan pemisahan dicapai dengan menggunakan kloroform: metanol 95: 5 sebagai fase gerak. Rf nilai kurkuminoid 0,75, 0,55, dan 0,27, untuk C, DMC, BDMC masing-masing. Resolusi yang lebih baik dari nilai Rf menunjukkan bahwa kloroform dan metanol dapat pelarut yang sesuai untuk pemisahan senyawa dalam kromatografi kolom.Kromatografi kolomDalam penelitian ini ekstrak aseton diendapkan dengan petroleum eter dan menghasilkan kurkuminoid mentah, dan digunakan untuk uji dengan kromatografi kolom, elusi yang dilakukan dengan menggunakan kloroform dan diikuti oleh kloroform: metanol dengan meningkatnya polaritas dan fraksi yang diperoleh diuji dengan TLC. Fraksi menunjukkan pola yang sama di TLC dikumpulkan dan terkonsentrasi. Komposisi fraksi dikumpulkan selama pemisahan kromatografi kolom kurkuminoid mentah dan fraksi terkonsentrasi diuji untuk penentuan total kurkuminoid dengan spektroskopi UV dapat dilihat pada Tabel 3. Analisis spektroskopi UV dari fraksi dikumpulkan menunjukkan persentase total kurkuminoid yang ada dalam fraksi . Dalam persentase penelitian ini, total kurkuminoid yang ada dalam fraksi adalah masing masing sebesar 84%, 86%, 80,6% dari C, DMC, dan BDMC.Oleh karena itu pemurnian lebih lanjut dilakukan dengan kristalisasi dengan kloroform dan metanol, yang diendapkan dengan petroleum eter. Profil kemurnian kurkuminoid individu yang terisolasi dianalisis dengan HPLC yang ditampilkan di gambar 2, yaitu C, DMC, BDMC menunjukkan puncak tunggal pada waktu retensi 10,81, 12,79, 13,03 menit masing-masing. Identitas masing-masing puncak dikonfirmasi oleh penentuan waktu retensi dan dengan spiking dengan standar. Kurkumin terbentuk kristal jarum kuning berbentuk cerah, Demethoxycurcumin sebagai kristal kuning muda, Bisdemethoxycurcumin kristal warna oranye kemerahan. Senyawa dimurnikan tersebut kemudian dipelajari untuk kegiatan biologis dan sifat farmasi.