DEGRADASI TERIPARATIDA OLEH ENZIM GASTROINTESTINAL PROTEOLITIK

RESUME JURNAL

ANGGIA M. PARDEDE 260110120085

RATNA MUTIA KHARISMA 260110120086

PUSPAGITA WARDHANI 260110120087

SHINTA DEWI LARASATI 260110120088

SEPTIANI RAHAYU 260110120089

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS PADJADJARAN

JATINANGOR2015

PENDAHULUAN

Osteoporosis adalah penyakit yang menurunkan densitas tulang dan akan

menyebabkan kerusakan tulang. Tujuan terapi osteoporosis adalah perbaikan densitas

dan kekuatan tulang. Estrogen Hormone Replacement Therapy (HRT), biofosfonat,

kasitonin dan selective estrogen receptor modulators (SERM) adalah obat-obat yang

dapat memperbaiki densitas tulang dengan menghambat bone turnover atau aktivitas

resorpsi osteoklasis.

Teriparatide yang dikenal dengan nama dagang FORTEO adalah agen

pertama yang digunakan untuk terapi osteoporosis yang menstimulasi pembentukan

tulang baru dengan cara menstimulasi aktivitas pembentukan osteoblas,

menggantikan kehilangan tulang pada kedua osteopenik, diovareoktemi tikus dan

osteoporotic manusia. Obat ini umunya diberikan setiap hari secara subkutan.

Bioavabilitasnya mencapai 17.6% diperoleh setelah pemberian larutan teriparatide

secara intranasal.

Rute oral masih menjadi rute yang paling disukai. Pemberian teriparatide

secara oral tidak mampu mencapai sistem sirkulasi. Ketidakmampuan teriparatide

mencapai sistem sirkulasi disebabkan oleh berbagai barier yang ditemukan dengan

pemberian oral. Barier ini mencakup barier difusi dari lapisan mucus yang menutupi

epitel gastrointestinal (GI), sama seperti absorpsi barier. Barier yang paling signifikan

untuk teriparatide adalah barier enzimatik yang disebabkan sekresi luminal dan enzim

proteolitik yang terikat pada membran.

Beberapa protein terapeutik seperti insulin atau faktor pertumbuhan epidermal

didegradasi setelah pemberian secara oral oleh pepsin di lambung. Lingkungan dalam

usus kecil menahan berbagai jenis protease mencakup tripsin, simotripsin, elastase

dan membran brush border yang mengikat enzim. Oleh karena itu tujuan dari

penelitian ini adalah mengevaluasi stabilitas teriparatide terhadap protease GI untuk

memberikan informasi penting dalam pengembangan sistem penghantaran secara

oral.

Stabilitas teriparatide terhadap beberapa isolasi sekret protease-seperti tripsin,

kimotripsin, elastase dan pepsin serta membran terikat peptidase dari mukosa usus

kecil dan aminopeptidase N terisolasi- untuk dievaluasi dalam konsentrasi fisiologis

dan pH fisiologis.

METODE DAN BAHAN

1. Analisis HPLC

Analisis HPLC dilakukan dengan kolom Nucleosil 5 C18 (250 x 4.6 mm). Laju

alirnya 1 ml/menit dijaga dengan baik menggunakan pelarut A (0,1% TFA dalam

aquadest) dan B (0,1% TFA dalam asetonitril). Gradient yang digunakan adalah

sebagai berikut; 0-10,5 menit (80-35% A), 10,5-12 menit (35-80% A) dan 12-17

menit (80% A). Teriparatida (R.t.: 6,6 menit) dianalisis pada panjang gelombang

220nm menggunakan detector diode array.

Perhitungan dilakukan dengan menggunakan kurva kalibrasi dengan 8

kalibrator (0,004-0,5 mg’mL), yang memberikan rentang 0,78-100% dari konsentrasi

teriparatida awal yang digunakan pada percobaan. Untuk studi degradasi, luas area di

bawah kurva (AUC) dari teriparatida awal ditentukan. Nilai-nilainya kemudian

dihitung menggunakan regresi linear; untuk kurva kalibrasi, digunakan buffer yang

sama seperti pada percobaan. Seluruh percobaan dilakukan minimal sebanyak 3 kali.

2. Stabilitas enzimatis dari teripida terhadap sekresi protease yang terisolasi

Degrasai enzimatis diuji dengan menggunakan tripsin (WORTHINGTON,

TPCK treated, E.C. nomor 3.4.21.4, 249 p-toluena-sulfonil-L-arginin metil ester

(TAME) units/mg solid, dari pankreas ternak), kemotripsin (WORTHINGTON,

TLCK treated, E.C. nomor 3.4.21.1, 55.4 benzoil-L-tirosin etil ester (BTEE) units/mg

solid, dari pankreas ternak), elastase (WORTHINGTON, E.C nomor 3.4.21.36, 4.5

N-suksinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (Suc Ala3NA) units/mg solid, dari

pankreas babi) dan pepsin (SIGMA, E.C. nomor 3.4.23.1, 4150 hemogrobin units/mg

solid, dari mukosa lambung babi).

Larutan enzim mengandung tripsin 13.6 unit TAME dan kemotripsin 6.6 unit

BTEE dilarutkan dalam 120µL TRIS Buffer (50 mM, pH 6.5) disiapkan berturut-

turut. Larutan Elastase disiapkan dengan melarutkan elastase dalam KCl 1%

kemudian ditambahkan buffer TRIS (50nM, pH 6,5) untuk memperoleh aktivitas dari

unit (Suc Ala3NA) elastase per mL. Berdasarkan penyediaan dalam instruksi USP

untuk cairan lambung buatan, 3,2 mg pepsin dilarutkan dalam 1 mL dari 0,08 M HCl.

pH berdasarkan USP sekitar 1,5. Untuk masing-masing cairan enzim mengandung

protease usus (120µL), 120µL dari cairan teriparatida (1mg teriparatida dalam 1 mL

50mM buffer TRIS, pH 6,5) ditambahkan. Kemudian dibandingkan dengan

konsentrasi protease yang terdapat di dalam usus halus manusia, seluruh konsentrasi

protease yang telah ditemukan berada di rentang fisiologis. Kedalam 120µL larutan

pepsin, 120µL larutan teriparatida (1 mg teriparatida dalam 1 ml 0,08 M HCl; pH 1,5)

ditambahkan. Larutan diikubasi di bawah 37oC di bawah pengocokan (pada 300 rpm)

selama periode sampling. Pada waktu pre penentuan (0, 5, 15, 30, 60,120, dan 180

menit) aliquots (30µL) diambil dan reaksi dihentikan seketika oleh penambahan

30µL dari 0,5% larutan trifluor-asam asetat ke dalam larutan protease usus dan 30µL

dari 0,1 M NaOH ke dalam larutan pepsin. Sampel didinginkan dalam suhu 4oC dan

dianalisis dengan menggunakan HPLC sebagaimana dijelaskan sebelumnya.

3. Stabilitas Enzimatik dari teriparatida terhadap mukosa pencernaan tikus

Studi degradasi dengan mukosa pencernaan tikus dilkukan hampir sama,

sebagaimana dijelaskan sebelumnya. Untuk mencegah permeasi, lapisan parafilm

dipasang ke dalam ruang akseptor dari sistem ruang penggunaan. Bagian dari 15 cm

usus halus segar pertama dari tikus dipasang ke dalam ruang pemasangan, bagian

basolateral dari mukosa menghadap pada lapisan parafilm. Kompartemen donor dan

akseptor dari ruang-ruang diisi dengan 0,75 mL medium segar yang telah disiapkan

mengandung 250mM NaCl. 2,6mM MgSO4, 10mM KCl, 40mM glukosan dan 50mM

NaHCO3. Larutan ini disangga dengan 40 mM asam 4-(2-hidroksietik)piperazin-1-

etanesulfat (HEPES) dan pH diatur menjadi 6,5. Percobaan dilakukan pada 37oC dan

dimulai dari 15 menit setelah pemasangan jaringan. Larutan-larutan dari ruang donor

diganti dengan 0,75 mL dari 0,375 mg/mL larutan teriparatida dalam medium

inkubasi. Sampel diambil setiap 30 menit selama 3 jam dan dianalisis menggunakan

HPLC sebagaimana dijelaskan sebelumnya.

4. Stabilitas enzimatis dari teriparatida terhadap aminopeptidase N terisolasi

Studi degradasi Aminopeptidase N dilakukan mirip dengan metode yang

digambarkan sebelumnya. Teriparatida dilarutkan di dalam 30mM TRISS buffer pH

7 mengandung konsentrasi 1 mg/ml. ke dalam 200µL dari larutan ini, 200µL dari

aminopeptidase N (SIGMA, E.C. nomor 3.4.11.2, 25 L-leucine-p-nitroanilida

units/mg, dari ginjal babi) larutan dalam buffer ditambahkan untuk memperoleh

konsentrasi aminopeptidase N final dari 12mU dalam medium inkubasi (400µL).

Percobaan dilakukan pada pH 7,0, 37oC dan dibawah pengocokan (300rpm). Sampel

diambil setelah 0,60, 120, 180, 240, 300 dan 360 menit setelah inkubasi. Degradasi

enzimatik dihentikan dengan penambahan larutan 0,5% TFA dan sampel dianalisis

dengan menggunakan HPLC sebagaimana digambarkan sebelumnya.

Sebagai tambahan, sampel dianalisis melalui uji asam 2,4,6-

trinitrobenzensulfat (TNBS). Reagen TNBS bereaksi dengan gugus amino primer di

dalam larytan dengan senyawa yang terdeteksi pada 405nm. Sehingga, uji TNBS

digunakan dalam rangka mengkuantifikasi jumlahh gugus amino bebas di dalam

larutan. Exopeptidase seperti aminopeptidase N memutuskan N-terminal asam amino

dari peptide sehingga meningkatkan gugus amino yang mengindikasikan pemutusan

teriparatida.Ke dalam 200 µL dari 1mg/mL larutan teriparatida, 200 µL larutan

aminopeptidase N (sebagaimana digambarkan diatas) ditambahkan. Pengujian

dilakukan pada pH 7, 37OC dan dibawah pengocokan (pada 300rpm). Sampel diambil

setelah 0, 60, 120, 280, 240,300, dan 360 mnit setelah inkubasi. Reaksi dihentikan

dengan penambahan 40 µL 1 M HCl ke dalam 50 µL dari masing-masing sampel.

Kemudian 300 µL dari 0,1% TNBS dalam 5% NaHCO3 dan 60 µL 1M NaOH

ditambahkan ke dalam masing-masing sampel dan dicampurkan setelah ditrasfer ke

dalam pelat mikrotiter. Reaksi yang terjadi dilakukan dalam waktu inkubasi selama 2

jam pada suhu ruangan. Absorpsi yang diukur pada 405nm dan konsenterasi dari

gugus amino primer dihitung deng menggunakan kurva baku yang diperoleh melalui

peningkatan konsentrasi sistein.

5. Kromatografi Lapis Tipis

Larrutan teriparatida, aminopeptidas N dan teriparatida/aminopeptidase N

dalam 50mM buffer TRIS pH 7,6 diikubasi selama 3 jam pada 37OC dan 500 rpm.

KLT dilakukan sebagaimana digambarkan dalam European Pharmacopeia

menggunakan silica gel 60 F254 dan campuran H2O, asam asetat, dan butanol

(20:20:60) sebagai fasa gerak. Setelah pengembangan, reagen ninhidrin (1g dari

ninhidrin dilarutakn dam etanol/asam asetat 5/1) disemprotkan pada pelat kering

untuk mewarnai asam amino tunggal. Pembanding asam amino adalah serin, valin.

Asam glutamate, isoleusin dan glutamine.

6. Data analisis statistik

Data analisis statistic dilakukan dengan menggunakan Student’s t-tes, dengan p<0,05

sebagai signifikansi minimal kecuali diindikasikan sebaliknya.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Untuk mencapai bioavaibilitas oral yg baik dari protein dan peptida, degradasi

pada saluran cerna harus dihindari. Dalam penelitian ini dilakukan evaluasi terhadap

degradasi enzimatis obat teriparatidedi saluran cerna. Penelitian ini cukup sulit untuk

dilakukan karena variasi sekresi enzim dari tiap individu berbeda. Konsentrasi enzim

yang disekresikan oleh pankreas disesuaikan dengan rata-rata konsentrasi enzim

pankreas yang disekresikan oleh manusia. Pada penelitian ini juga digunakan media

dengan PH 6,5 sehingga didapatkan kondisi yang hampir sama dengan kondisi di

duodenum.

Enzim proteolitik bekerja pada sisi aktif yang spesifik. Teripatide memiliki

banyak sisi aktif untuk enzim etalase namun degradasi oleh enzim etalase hanya

menyebabkan minor damage bagi teripatide. Dari penelitian ini didapatkan bukti

bahwa teripatide terdegradasi oleh pepsin karena setelah 5 menit inkubasi teripatide

dalam larutan asam pepsin, molekul teripatide tidak terdeteksi. Namun ketika

diinkubasi selama 5 menit dalam media yang mengandung etalase hanya 15%

terapatide yang terdegradasi. Diduga sisi aktif atau sisi pembelahan pepsin pada

teripatide berada di gugus amida antara dua asam amino aromatik yaitu fenilalanin

dan triptophan. Degradasi teripatide dapat diatasi dengan penyalutan oleh

polimetakrilat atau selusosa asetat phthalate.

Dari penelitian yang dilakukan juga didapat bahwa enzim tripsin dan kiemotripsin

merupakan agen pendegradasi utama teripetide karena selama 5 menit inkubasi pada

media yang mengandung enzim tersebut terepatide terdegradasi sempurna.

Teripatide memiliki 5L 2M 3N dan 1W yang dapat menjadi target kerja dr enzim

enzim proteoliitik. Sisi aktif bagi tripsin adalah R dan K.

Degradasi terapatide yang disebabkan oleh pembentukan ikatan peptida dengan

membran juga diamati pada mukasa usus tikus. Dari pengamatan tersebut didapat

hasil bahwa setelah 3 jam inkubasi, terapatide terdegradasi sebanyak 50% untuk

mengetahui lebih lanjut tentang degradasi obat yang disebabkan peptidase yang

terikat ke membrane, dilakukan juga penelitian dengan N aminopeptidase yang

diisolasi, yang merupakan peptidase yang paling banyak terikat ke membrane. Hasil

studi ini menunjukkan N aminopeptidase menyebabkan degradasi teriparatid dan

teramati 6 jam setelah inkubasi dengan N aminopeptidase terdeteksi teriparatide utuh

sebanyak 20%.

Dibandingkan dengan protease yang disekresikan oleh lumen yang merupakan

endopeptidase utama, N aminopeptidase merupakan exopeptidase. Sudah diketahui

dengan baik bahwa teriparatide yang berada di ujung helices penting untuk

bioaktivitas yang memediasi sebuah aktivasi cAMP/Protein kinase-A (PKA) atau

Protein kinase-C (PKC). Turunan potongan C seperti PH 1-31 mampu menstimulasi

akumulasi cAMP intraselular. Meskipun demikian telah ditunjukkan bahwa PTH 1-

31 kurang potensial untuk meningkatkan kadar kalsium dalam darah tikus

dibandingkan PTH 1-34. Ada juga penelitian yang menunjukkan bahwa aktivasi

cAMP/PKA memrlukan asam amino N-terminal 1 dan 2 karena fosfolipase-C/PKC

dipasangkan dengan hormone yang domain N-terminalnya lebih panjang. Juga

ditunjukkan residu N terminal persinyalan domain tersebut berperan penting dalam

aksi PTH. Lebih jauhnya lagi telah ditunjukkan juga bahwa potongan fragmen PTH

2-34 hanya 67% potensial seperti PTH 1-34 dan pengurangan dua asam amino

pertama di N-terminal menghilangkan kemampuan hormone untuk menstimulasi

produksi cAMP di sel UMR-106-01. Analog PTH 3-4, 7-34, dan 13-34 tidak

menstimulasi produksi cAMP. Sehingga ketertarikan khusus untuk memverifikasi

apakah degradasi yang disebabkan oleh N aminopeptidase berhenti setelah pemutusan

asam amino N terminal pertama atau apakah asam amino secara lebih jauh tetap

diputuskan dari teriparatide. Oleh sebab itu, sampel degradasi N-aminopeptidase

dianalisis juga melalui tes TNBS. Reagen ini bereaksi dengan gugus amina primer.

Setiap molekul teriparatide mengandung 3 residu K yang bereaksi dengan TNBS,

sebuah peningkatan gugus amin primer kurang lebih mengindikasikan pemutusan N

tidak berhenti setelah pemutusan asam amino N terminal teriparatide.

Hal ini juga dibuktikan lebih lanjut menggunakan kromatografi lapis tipis.

Setelah inkubasi teriparatide dengan N aminopeptidase, setidaknya ada tiga asam

amino berbeda yang terdeteksi dan tidak terdeteksi asam amino bebas setelah

inkubasi tersebut.

Dari gambar ditunjukkan 5 asam amino pertama dari N terminal digunakan

sebagai pembanding (D ¼ serine, E ¼ glutamic

acid, F ¼ valine, G ¼ isoleucine, H ¼ glutamine). Perbandingan waktu retensi asam

amino bebas disebabkan N aminopepttidase ( C ) dan watu retensi asam amino

pembanding (D-H) mengindikasikan setidaknya empat asam amino pertama

diputuskan dari N-terminal teriparatide. Walaupun telah ditunjukkan dalam beberapa

penelitian bahwa sedikit modifikasi kimia dari asam amino N terminal dapat

menstabilkan obat peptide terhadap degradasi yang disebabkan N aminopeptidase.

Namun efek modifikasi terhadap aktivitas farmakologi perlu diinvestigasi lebih jauh.

Tabel diatas merupakan rangkuman stabilitas teriparatide terhadap protease

saluran cerna. Walalupun teriparatide dapat didegradasi oleh pepsin, hal ini dapat

diatasi dengan melakukan enteric coating. Teripaaratide didegradasikan secara

ekstensif oleh tripsin, kimotripsin, dan elastase. Untuk dapat mencapai

bioavailabilitas oral yang memadai, degradasi intestinal ini perlu diminimalisir.

Usaha untuk mengurangi degradasi enzimatis termasuk pengunaan analog, prodrug,

dan formulasi seperti nanopartikel, mikropartike, dan liposom yang melindungi

peptide zat aktif dan protein dari serangan enzimatik. Desain sistem pengantaran

untuk mencapai usus besar dimana aktivitas proteolitik relative rendah juga

merupakan pendekatan penting untuk menghindari degradasi enzimatik. Selain itu,

co-administrasi berupa enzim inhibitor juga sedang diusahakan. Karena beberapa

eksipien, beragam penelitian in vivo menunjukkan bioavailabilitas obat yang

meningkat secara signifikan dalam bentuk sediaan oral. Untuk menghindari efek

toksik sistemik dari inhibitor enzim maka dilakukan imobilisasi untuk tidak menyerap

pembawa polimer seperti poliakrilat. Hal ini telah dibuktikan juga melalui penelitian

in vivo.

KESIMPULAN

Melalui penelitian ini stabilitas teriparatide terhadap enzim saluran cerna telah

dibuktikan. Tripsin, kimotripsin, pepsin mampu mendegradasi teriparatide secara

ekstensif. Elastase juga mendegradasi teriparatide tapi aktivitas degradasinya lebih

rendah dibandingkan ketiga enzim lainnya. Peptidase yang terikat oleh membrane

juga menunjukkan aktivitas degradasi teriparatide. Lebih jauh lagi N aminopeptidase

juga ditemukan terlibat dalam proses degradasi. Hal ini memberikan informasi

penting untuk pertimbangan dalam pembuatan sediaan oral teriparatide.