plagiat merupakan tindakan tidak terpuji · menyelesaikan laporan akhir yang berjudul uji...

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN

DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)

TERHADAP KULTUR SEL RAJI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Clara Sinta NIM : 058114024

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii




SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Clara Sinta

NIM : 058114024

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009


iii


iv

Pengesahan Skripsi Berjudul




Oleh :

Clara Sinta

NIM : 058114024

Dipertahankan di Hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal 23 April 2009

Mengetahui Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Dekan

Rita Suhadi, M.Si., Apt.

Pembimbing :

drh. Renny Kusumastuti, M. P.

Panitia Penguji : Tanda tangan

1. drh. Renny Kusumastuti, M. P. …………….

2. Yohanes Dwiatmaka, M. Si. …………….

3. C. M. Ratna Rini Nastiti, M. Si., Apt. …………….


v

Kita hidup dengan apa yang kita dapat,

kita membangun kehidupan dengan yang kita beri

(Sir Winston Churchill)

Skripsi ini kupersembahkan untuk :

Bapak & Ibuku tercinta

Kakak, Adik-adikku

Cinta, teman-teman & alamamaterku


vi


vii

PRAKATA

Puji syukur penulis haturkan pada Tuhan Yang Maha Pengasih dan

Penyayang atas segala rahmat dan penyertaan-Nya sehingga penulis dapat

menyelesaikan laporan akhir yang berjudul Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan

Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Raji

dengan baik. Laporan ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh

gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi.

Laporan akhir ini tidak akan dapat terselesaikan tanpa dukungan dan

bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dala kesempatan ini penulis ingin

mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

2. drh. Renny Kusumastuti, M. P. selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan ilmu, bimbingan dan pengetahuan baru kepada penulis dengan

penuh kesabaran dan ketulusan.

3. Yohanes Dwiatmaka, M. Si. dan C. M. Ratna Rini Nastiti, M. Si., Apt. selaku

dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan saran dan kritik

yang membangun bagi penulis.

4. Bu Haryati, Mas Anief dan Mba Yuli LPPT UGM atas pendampingan dan

pengarahannya selama penelitian.

5. Bapak, Ibu, Mas Pandu, Imel, Dewa dan Yoyo untuk segala dukungan baik

material maupun cinta yang diberikan.


viii

6. Erlin, Presti dan Rini buat kerjasama, suka duka, dan kebersamaannya selama

di laboratorium.

7. Teman-teman UKKA dan teman-teman Farmasi Sains dan Teknologi buat

persahabatan kita di farmasi.

8. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu

dalam penyusunan laporan akhir ini.

Penulis menyadari sepenuhnya bahwa penulisan laporan akhir ini masih

banyak kekurangan dan kesalahan yang tidak terlepas dari keterbatasan dan

kekurangan penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang

membangun dari semua pihak. Semoga laporan ini dapat memberikan manfaat

dalam perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis


ix

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak

memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali telah disebutkan dalam

kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 18 April 2009

Penulis,

Clara Sinta


x

INTISARI

Kanker limfoma merupakan salah satu penyakit penyebab kematian utama di dunia. Pengobatan kanker dengan obat tradisional telah banyak dikembangkan, salah satunya adalah daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel Raji (sel kanker limfoma).

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola satu arah. Metode ekstraksi yang dilakukan adalah perkolasi dan uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah yang diperoleh dilakukan dengan metode direct counting. Dari hasil penelitian ini dapat dihitung persen kematian sel yang kemudian dilakukan analisis probit untuk menentukan nilai LC50.

Berdasarkan hasil penelitian diperoleh nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel Raji sebesar 150,583µg/ml.

Kata kunci : sitotoksisitas, ekstrak heksan, daun sirih merah, sel Raji, LC50


xi

ABSTRACT

Lymphoma Cancer is one of the diseases which causes death. Piper crocatum leaves have been used for traditional cancer treatment. The aim of this research was to determine LC50 value of hexane extract of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves on Raji cell culture.

This research was pure experimental with one way completely randomized design. Extraction method was conducted with percolation and cytotoxicity assay was carried out by using direct counting method. Percentage of death cells was calculated and the LC50 value was analyzed with probit statistic.

From the result we revealed that the hexane extract of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves showed cytotoxicity effect on Raji cell culture with the LC50

value of 150,583 μg/ml.

Key words : cytotoxicity, hexane fraction, Piper crocatum Ruiz & Pav, Raji cell culture, LC50


xii

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL...........................................................................…. i

HALAMAN JUDUL.................................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING....................................... .. iii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................ ... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN.................................................................. v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI………………………… vi

PRAKATA.................................................................................................. vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..................................................... ix

INTISARI...............................................................................................…. x

ABSTRACT............................................................................................ ….. xi

DAFTAR ISI......................................................................................... ….. xii

DAFTAR TABEL................................................................................. ….. xv

DAFTAR GAMBAR................................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN............................................................................. .. xviii

BAB I PENGANTAR............................................................................... .. 1

A. Latar Belakang............................................................................... 1

1. Permasalahan............................................................................ 3

2. Keaslian penelitian.................................................................... 3

3. Manfaat penelitian..................................................................... 3

B. Tujuan Penelitian………………………………………………… 3

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA…………………………………….. 4


xiii

A. Tanaman Sirih Merah................................................................... . 4

1. Keterangan Botani.................................................................... 4

2. Deskripsi Tanaman................................................................... 4

3. Kandungan Kimia..................................................................... 5

4. Khasiat dan Penggunaan........................................................... 5

B. Ekstraksi..…………..…………..................................................... 5

C. Perkolasi......................................................................................... 6

D. Minyak Atsiri................................................................................. 7

E. Kanker............................................................................................ 8

F. Sel Raji........................................................................................... 9

G. Senyawa Antikanker …………………………………………… 9

H. Uji Sitotoksisitas....................…………………………………… 10

1. Metode MTT……………………………………………….… 10

2. Metode direct counting.......................................................... .. 10

I. Landasan Teori…………………………………………………… 11

J. Hipotesis………………………………………………………… 12

BAB III METODOLOGI PENELITIAN................................................… 13

A. Jenis dan Rancangan Penelitian...............................................….. 13

B. Variabel dan Definisi Operasional................................................ 13

1. Variabel.................................................................................. .. 13

2. Definisi operasional.................................................................. 13

C. Alat dan Bahan............................................................................... 14

1. Alat.......................................................................................... . 14


xiv

2. Bahan........................................................................................ 14

D. Tata Cara Penelitian....................................................................... 15

1. Pengumpulan dan Determinasi Daun Sirih Merah................... 15

2. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah....................... 15

3. Ekstraksi Simplisia Daun Sirih Merah….................................. 16

4. Propagasi dan Panen Sel Raji................................................... 16

a. Propagasi Sel Raji............................................................. 16

b. Panen Sel Raji ................................................................. 17

5. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah Pada Sel Raji.. 17

a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT..................…….. 17

b. Uji sitotoksisitas dengan metode Direct Counting........... 18

6. Analisis Hasil............................................................................ 18

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................... 20

A. Pengumpulan dan Determinasi Daun Sirih Merah........................ 20

B. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah........................... 20

C. Ekstraksi Simplisia Daun Sirih Merah........................................... 21

D. Propagasi dan Panen Sel Raji…………………………………… 24

D. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah Pada Sel Raji... 26

1. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT.................................. .. 26

2. Uji sitotoksisitas dengan metode Direct Counting.................. . 29

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan………………………………………….. ...……….. 39

B. Saran………………………………. ……………………………. 39


xv

DAFTAR PUSTAKA…………………………………………….………. 40

BIOGRAFI PENULIS………………………………………………….… 56


xv

DAFTAR TABEL

Tabel I Hasil pengamatan profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah …... 23

Tabel II Tabel nilai absorbansi ekstrak heksan daun sirih merah pada ber-

bagai konsentrasi dengan metode MTT.......................................... 27

Tabel III Hasil perhitungan sel Raji pada masing-masing konsentrasi ekstrak

heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting ............. 32

Tabel IV Hasil perhitungan sel Vero pada masing-masing konsentrasi ekstrak

heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting.............. 32

Tabel V Data % kematian sel Raji dan harga probitnya setelah inkubasi

24jam dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah.............. 34

Tabel VI Data % kematian sel Vero dan harga probitnya setelah inkubasi

24 jam dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih

merah ........................................................................................... 34


xvi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Reaksi reduksi MTT oleh enzim dehidrogenase mitokondria …… 26

Gambar 2. Kurva konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap

hasil perhitungan % kematian sel.................................................... 28

Gambar 3. Sel yang hidup dan sel yang mati setelah pemberian trypan

blue pada haemocytomoter di bawah pengamatan mikroskop

dengan perbesaran 100x ................................................................. 30

Gambar 4. Kontrol sel Raji dan kontrol sel Vero di bawah

pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x ........................... 31

Gambar 5. Kurva Konsentrasi Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah

terhadap % Kematian Sel Raji dan Sel Vero .................................. 33

Gambar 6. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap

harga probit pada sel Raji................................................................ 34

Gambar 7. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap

harga probit pada sel Vero .............................................................. 35

Gambar 8. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) …………… 42

Gambar 9. Laminar Air Flow…………………………………………………. 42

Gambar 10. Inverted Microscope…………………………………………….. 42

Gambar 11. 96well plate, tabung conical steril dan flask ……………………. 43

Gambar 12. Cell counter dan haemocytometer ………………………………. 43

Gambar 13. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 300 µg/ml ………………... 44



xvii







Gambar 21. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 800 µg/ml ………………... 45









xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Bahan dan Peralatan yang Digunakan dalam Penelitian ……….. 42

Lampiran 2. Hasil Pengamatan Sel Raji dan Sel Vero dengan Mikroskop

dengan Perbesaran 100x Setelah Pemberian Ekstrak Heksan

Daun Sirih Merah pada Inkubasi 24 jam ………………………. 44

Lampiran 3. Tabel Probit …………………………………………………… 47

Lampiran 4. Perhitungan LC50 Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah terhadap

Sel Raji Dan Sel Vero …………………………………………. 48

Lampiran 5. Hasil Uji Signifikansi Antara Perlakuan dengan Kontrol dengan

Z-test…………………………………………………….. …….. 52

Lampiran 6. Hasil Uji KLT Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah……………… 54


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar belakang

Kanker merupakan penyakit nomor satu yang mematikan di dunia dan

angka kematian yang disebabkan penyakit kanker juga terus bertambah. Kanker

adalah suatu penyakit yang berhubungan dengan pertumbuhan sel tubuh yang tak

terkendali, dimana sel yang tak terkendali ini juga menyebabkan kerusakan

jaringan tubuh yang sehat lainnya. Kanker dapat muncul di setiap jenis organ

tubuh, ada yang ganas dan ada yang jinak (Anita, 2008).

Efek merugikan dari pertumbuhan kanker adalah gangguan aktivitas sel

normal, jaringan, dan organ atau sampai pada kematian sel karena terjadinya

perubahan sel yang fungsional menjadi sel yang tidak fungsional. Tumor

menghancurkan jaringan normal dengan tekanan dan gangguan pada darah dan

saraf serta menembus barrier kulit, internal membran atau epitelia (Wolfe,1993).

Salah satu jenis kanker yang banyak menyerang adalah kanker limfoma

Limfoma adalah kanker sel darah putih yang disebut juga limfosit-B atau Non-

Hodgkin Limfoma (NHL). Tumor NHL dapat terjadi di tulang, perut, hati, otak,

atau bagian tubuh yang lain. Tanda pertama NHL adalah bengkak pada kelenjar

getah bening, demam, keringat malam dan hilang berat badan lebih dari sepuluh

persen. Resiko NHL ditingkatkan oleh infeksi virus Epstein-Barr dan oleh faktor

genetik (Anonim, 2009a). Kultur sel Raji merupakan kultur sel kanker yang

diturunkan dari penyakit Limfoma Burkitt (Anonim, 2009b).


2

Banyak bukti empiris orang sembuh dengan beragam penyakit setelah

mengkonsumsi daun sirih merah. Sirih merah dipakai untuk mengobati diabetes,

kanker, peradangan, hipertensi, hepatitis, leukimia dan ambeien. Senyawa

fitokimia yang terkandung dalam daun sirih merah telah diketahui meliputi

flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

Suatu penelitian menggunakan ekstrak etanolik daun sirih merah terbukti

bersifat sitotoksik terhadap kultur sel Raji dengan nilai LC50 sebesar 395,5µg/ml

(Kusumaningtyas, 2008). Mengacu pada penelitian tersebut, maka perlu dilakukan

penelitian untuk mengetahui nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah. Heksan

merupakan pelarut dengan kepolaran yang rendah (non polar). Dalam ekstrak

heksan tersebut diharapkan agar kandungan senyawa-senyawa non polar yang

tersari mempunyai konsentrasi lebih besar daripada dalam ekstrak etanol. Hal ini

dikarenakan dalam ekstrak etanol senyawa yang tersari lebih banyak, dengan

range kepolaran yang cukup jauh, sehingga tidak hanya senyawa non polar saja

yang akan tersari, namun senyawa polar dan semipolar pun akan ikut tersari,

sehingga konsentrasi senyawa non polar dalam ekstrak etanol ini akan lebih kecil.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah senyawa-senyawa nonpolar

yang berada dalam ekstrak heksan tersebut lebih berpotensi sebagai senyawa

sitotoksik terhadap kultur sel Raji yang ditunjukkan dengan nilai LC50. Dengan

adanya hasil tersebut diharapkan ekstrak heksan dari daun sirih merah ini akan

memberikan daya sitotoksik yang lebih besar dan lebih berpotensi sebagai

antikanker.


3

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan di atas, maka

dirumuskan permasalahan yaitu berapakah nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih

merah terhadap kultur sel Raji?

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian

mengenai uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel

Raji. Adapun penelitian yang sudah pernah dilakukan adalah Uji Sitotoksisitas

Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah terhadap Kultur Sel Raji (Kusumaningtyas,

2008).

3. Manfaat penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai khasiat

dan efek sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

Diharapkan dengan adanya informasi ini, penggunaan bahan alam sebagai obat

kanker semakin dikembangkan.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik ekstrak

heksan daun sirih merah dengan mencari nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih

merah terhadap sel Raji.


4

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Sirih Merah

1. Keterangan botani

Famili : Piperaceae

Genus : Piper

Spesies : Piper crocatum Ruiz & Pav

Sinonim : Piper ornatum N. E. Br.

Nama daerah : Sirih merah

Nama Inggris : Red betle vine (Anonim, 2007)

2. Deskripsi Tanaman

Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau.

Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya

bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan

permukaannya mengkilap dan tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-

20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak putih keabu-abuan bagian bawah

daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan

beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di

setiap buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).

Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak

terlalu banyak terkena sinar matahari. Jika terkena sinar matahari langsung pada

siang hari secara terus-menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram

dan kurang menarik (Sudewo, 2005).


5

3. Kandungan Kimia

Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa sirih

merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak

atsiri (Sudewo, 2005).

4. Khasiat dan penggunaan

Tumbuhan sirih merah digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain

sebagai anti diabetes, jantung koroner, radang prostat, TBC, asam urat dan

antikanker (Sudewo, 2005).

Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal

atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka

penyakit. Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat

merangsang saraf pusat dan daya pikir. Di samping itu, juga memiliki efek

pencegah ejakulasi dini, antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, pelindung

organ hati, antidiare, antikoagulan, mempertahankan kekebalan tubuh, dan

penghilang bengkak. Daun sirih merah juga mampu mengatasi penyakit seperti

peradangan akut pada organ tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara

dan kanker rahim, tifus, leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag

kronis, jantung koroner, dan darah tinggi (Sudewo, 2005).

B. Ekstraksi

Ekstraksi atau penyarian adalah kegiatan penarikan kandungan kimia

yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan

pelarut cair (Anonim, 2000). Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan


6

mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan

pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan

(Anonim, 1995).

Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi

zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan

yang mengandung zat tersebut. Proses penyarian dapat dipisahkan menjadi

pembuatan serbuk, pembasahan, penyarian dan pemekatan. Cara penyarian dapat

dibedakan menjadi infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian

berkesinambungan (Anonim, 1986).

C. Perkolasi

Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan

cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Kekuatan yang

berperan dalam perkolasi antara lain kekentalan, daya larut, tegangan permukaan,

difusi, osmosa, daya kapiler dan daya geseran (friksi). Cara perkolasi lebih baik

dibandingkan dengan cara maserasi karena aliran cairan penyari menyebabkan

adanya pergantian larutan yang terjadi dengan larutan yang konsentrasinya lebih

rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi (Anonim, 1986).

Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang

digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif

yang keluar dari perkolator disebut perkolat, sedangkan sisa setelah dilakukannya

penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).


7

D. Minyak Atsiri

Minyak atsiri terdiri dari molekul-molekul hidrokarbon yang terdiri dari

10-15 atom karbon. Kelarutan minyak atsiri ini adalah pada pelarut nonpolar

sehingga ekstraksinya pun juga dilakukan dengan pelarut nonpolar (Houghton &

Raman, 1998).

Berbagai alkohol, aldehida, keton dan ester yang mudah menguap atau

atsiri terdapat dalam tumbuhan walaupun biasanya terdapat hanya sedikit sekali.

Walaupun konsentrasinya rendah, senyawa ini penting dari segi estetika oleh

karena perannya pada citarasa, dan bau makanan, bunga, parfum dan sebagainya.

Minyak atsiri berperan pada daya tariknya untuk serangga penyerbuk serta hewan

penyebar biji. Selain itu, senyawa ini juga bertindak sebagai antibiotika, hormon

luka, dan perangsang perkecambahan biji (Robinson, 1995).

Minyak atsiri dalam tumbuhan terdapat dalam jumlah yang sangat kecil

sehingga diperlukan bahan awal yang sangat besar jumlahnya untuk mengisolasi

senyawa yang memadai untuk diteliti. Ada tiga cara umum untuk mengambil

komponen atsiri dalam tumbuhan yaitu destilasi, ekstraksi memakai pelarut, dan

pengaliran udara atau aerasi. Destilasi pada tekanan dan suhu rendah

memungkinkan terjadinya penguraian oleh enzim, sehingga menimbulkan

perubahan kandungan jaringan. Cara ekstraksi dengan pelarut dapat dilakukan

pada keadaan khusus terutama untuk senyawa yang tidak begitu polar. Pada

proses aerasi hanya senyawa senyawa yang dikeluarkan ke udara saja yang

terisolasi dengan mengalirkan udara melalui bahan tumbuhan untuk jangka waktu


8

yang lama dan mengembunkan senyawa yang terbawa udara dalam penampung

yang didinginkan (Robinson, 1995).

E. Kanker

Kanker adalah kelainan genetik yang merupakan akibat dari peristiwa-

peristiwa mutasional berganda. Mutasi-mutasi tersebut mengubah fungsi normal

suatu sel sehingga sel itu menjadi memiliki ciri-ciri sebagai berikut : (1) sel

menjadi immortal, yaitu mampu melakukan pembelahan sel secara tak terbatas,

(2) sel menjadi independen dari kontrol-kontrol selular normal yang membatasi

pertumbuhan dan pembelahan, dan (3) sel itu menjadi invasif dengan menyebar ke

jaringan-jaringan lain, dalam sebuah proses yang disebut metastatis. Satu sel

kanker mampu membelah menjadi massa klonal sel yang disebut tumor.

Onkogenesis adalah proses perubahan sel normal menjadi sel kanker. Sedangkan

neoplasma adalah populasi sel-sel berpotensi kanker yang yang tumbuh secara

lepas kendali. Jika neoplasma terbatas di tempat asalnya dan tak memiliki

kecenderungan untuk tumbuh lagi setelah disingkirkan, maka neoplasma itu

disebut jinak (benign). Jika neoplasma bermetastatis dari tempat asalnya, maka

neoplasma itu menjadi ganas (malignant) dan membahayakan jiwa (Elfrod and

William, 2007).

Untuk mempelajari kanker secara in vitro, sel-sel dapat ditumbuhkan

menggunakan teknik-teknik kultur yang disebut kultur sel atau kultur jaringan.

Sejumlah sel ditempatkan dalam vial berdasar datar yang terbuat dari gelas atau

plastik. Vial tersebut sudah diberi perlakuan dan berisikan medium kaya nutrien.


9

Sel-sel kemudian turun dan melekat ke dasar wadah, sel-sel itupun mulai tumbuh

dan disebut sebagai kultur primer (Elfrod and William, 2007).

F. Sel Raji

Sel Raji merupakan kultur sel kanker yang diturunkan dari penyakit

Limfoma Burkitt ( Anonim, 2009b). Limfoma adalah kanker sel darah putih yang

disebut limfosit-B atau disebut juga dengan NHL. Sel tersebut cepat

menggandakan diri dan membentuk tumor. NHL disebabkan oleh rangsangan

jangka panjang sistem kekebalan tubuh. Jika sel-B menggandakan diri dengan

cepat selama bertahun-tahun, makin banyak mutasi atau perubahan terjadi pada

sel ini. Beberapa mutasi ini dapat menyebabkan kanker (Anonim, 2009a).

Resiko NHL ditingkatkan oleh infeksi virus Epstein-Barr dan oleh faktor

genetis. Tumor NHL dapat terjadi pada tulang, perut, hati, otak, atau bagian tubuh

lain. Tanda pertama NHL adalah bengkak pada kelenjar getah bening, demam,

keringat malam, dan hilang berat badan lebih dari sepuluh persen. Gejala ini

terjadi dengan beberapa penyakit lain yang berhubungan dengan AIDS (Anonim,

2009a).

G. Senyawa Antikanker

Menurut National Institute of Health (NIH), senyawa antikanker

dikategorikan dalam lima klasifikasi berdasarkan nilai LC50. Klasifikasi tersebut

meliputi Kategori 1, senyawa antikanker dengan strongest LC50 = 0,19-0,528

mg/ml; Kategori 2, senyawa antikanker dengan moderate to strong LC50 = 0,528-


10

1,197 mg/ml; Kategori 3, senyawa antikanker dengan moderate LC50 = 1,259-

2,515 mg/ml; Kategori 4, senyawa antikanker dengan weak to moderate LC50 =

2,528-4,939 mg/ml; dan Kategori 5, senyawa antikanker dengan weak LC50 > 5,0

mg/ml (Mazzio,2009).

H. Uji Sitotoksisitas

1. Metode MTT

Metode MTT merupakan uji sitotoksik yang cepat, sensitif, akurat dan

sejumlah besar sampel dapat diukur secara otomatis dengan spektrofotometer.

Metode ini didasarkan pada aktivitas enzim dehidrogenase mitokondria untuk

mengubah substrat MTT yang larut air (berwarna kuning), menjadi formazan

berwarna biru tua yang tidak larut air (Doyle and Griffiths, 2000).

Pada metode MTT dilakukan pengukuran absorbansi sampel dengan

menggunakan ELISA plate reader pada panjang gelombang 570 nm. Hasil

pengukuran bersifat kuantitatif, dimana terdapat hubungan yang linier antara

aktivitas sel dengan absorbansi, dan pertumbuhan atau kematian sel dapat diukur

(Anonim, 2009c).

2. Metode Direct counting

Metode yang paling umum digunakan dalam perhitungan sel yang

efisien dan akurat adalah menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini

digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan berbentuk persegi

untuk mempermudah penghitungan. Suspensi sel yang diisikan ke dalam chamber

dapat diamati di bawah mikroskop dan sel yang terhitung terdapat pada angka


11

skala. Dari hasil perhitungan ini, jumlah sel per ml suspensi dapat dihitung.

Menggunakan zat warna seperti trypan blue, penghitungan sel yang hidup dan sel

yang tidak hidup dapat dilakukan. Trypan blue ini hanya bisa menembus

membran pada sel yang mati. Ketika suspensi sel dilemahkan dengan trypan blue,

sel yang sehat akan tetap kecil dan bergerak, sedangkan sel yang rusak atau mati

akan membengkak, lebih luas dan berwarna biru tua (Doyle and Griffiths, 2000).

Perhitungan sel menggunakan haemocytometer cukup murah dan dapat

melihat langsung sel yang kita hitung. Namun prosedur ini cukup lama dan mudah

terjadi kesalahan pada sampling dan jumlah sel yang dihitung pada saat transfer

sel ke dalam chamber, sehingga harus dipastikan sel tercampur dengan baik dalam

suspensi dan sel dalam suspensi tidak membentuk agregat yang dapat membuat

perhitungan tidak akurat (Freshney, 1986).

I. Landasan Teori

Kanker terjadi karena perubahan sel yang mengalami pertumbuhan tidak

normal dan tidak terkontrol. Kanker limfoma termasuk penyakit kanker yang

paling banyak diperbincangkan karena keganasannya. Limfoma berhubungan

dengan AIDS dan sering juga disebut Limfoma Non-Hodgkin (NHL). NHL

disebabkan oleh rangsangan jangka panjang sistem kekebalan tubuh. Jika sel-B

menggandakan diri dengan cepat selama bertahun-tahun, makin banyak mutasi

atau perubahan terjadi pada sel ini. Beberapa mutasi ini dapat menyebabkan

kanker. Resiko NHL ditingkatkan oleh infeksi virus Epstein-Barr dan oleh faktor


12

genetis. Tumor NHL dapat terjadi pada tulang, perut, hati, otak, atau bagian tubuh

lain.

Pengobatan kanker dengan obat tradisional telah banyak dikembangkan,

salah satunya adalah daun sirih merah (Piper crocatum). Sekilas bila dilihat dari

bentuk dan namanya, sirih merah dan sirih terlihat sama. Banyak fungsi daun sirih

merah ini yang tidak dimiliki daun sirih biasa. Banyak bukti empiris orang

sembuh dengan beragam penyakit setelah mengkonsumsi sirih merah. Senyawa

fitokimia yang terkandung dalam daun sirih merah meliputi alkaloid, saponin,

tannin, flavonoid dan minyak atsiri. Selain bersifat antiseptik seperti sirih hijau,

sirih merah juga bisa dipakai mengobati diabetes, kanker, peradangan, hipertensi,

hepatitis, leukimia dan ambeien.

Mengacu pada hasil penelitian sebelumnya bahwa ekstrak etanolik daun

sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel Raji , maka perlu dilakukan penelitian

untuk mengetahui potensi ekstrak heksan daun sirih merah sebagai senyawa yang

sitotoksik terhadap kultur sel Raji. Ekstrak heksan daun sirih merah diharapkan

mengandung senyawa-senyawa nonpolar yang lebih berpotensi sitotoksik

terhadap kultur sel Raji. Dengan adanya hasil tersebut diharapkan ekstrak heksan

dari daun sirih merah ini akan memberikan daya sitotoksik yang lebih besar dan

lebih berpotensi sebagai antikanker.

J. Hipotesis

Ekstrak heksan daun sirih merah (Piper crocatum) bersifat sitotoksik

terhadap kultur sel Raji.


13

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian daya sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap

kultur sel Raji ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan

acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel

a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak heksan

daun sirih merah yang disajikan dalam bentuk log konsentrasi.

b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah % kematian sel Raji

yang disajikan dalam bentuk probit.

c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah suhu, pH,

media, kualitas pereaksi, umur sel Raji dan pelaku penelitian.

d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kematian

alami sel Raji.

2. Definisi operasional

a. Ekstrak heksan daun sirih merah ialah hasil ekstraksi daun sirih merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav) dengan pelarut heksan yang dibuat sesuai

prosedur dalam penelitian ini.


14

b. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak heksan daun sirih

merah terhadap sel Raji.

c. Sel Raji adalah kultur sel kanker yang diturunkan dari penyakit Limfoma

Burkitt.

d. Kematian sel Raji ditunjukkan dengan terjadinya pembengkakan sel yang

dilanjutkan perubahan warna sel yang transparan menjadi biru tua oleh

penambahan trypan blue.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas

(Pyrex), timbangan analitik (Denver Instrument XL-610), mesin penyerbuk

(Modifikasi LPPT UGM), perkolator, seperangkat alat KLT, vacuum rotary

evaporator, Mikropipet 0,5 – 10 µl dan 100 – 1000 µl, vortex (Max Mix II

Therolyne), inkubator (Memmer), tabung conical (Nunc), tissue culture flask

(Nunc), lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well plate (Nunc),

spektrofotometer UV, laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2),

haemocytometer (Neubauer).

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah daun sirih merah

segar ( diambil di pekarangan warga Dusun Ngangkrik, Sleman), kultur sel Raji

(diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta),


15

kultur sel Vero (diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah

Mada, Yogyakarta).

Pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi ekstraksi dan uji KLT

kandungan senyawa daun sirih merah antara lain heksan, toluen, etil asetat,

metanol, air, amonia, asam asetat, asam formiat, dan semprot vanilin. Sedangkan

untuk uji sitotoksisitas antara lain RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat,

Hepes, FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan

Fungison 0,5% (Gibco); Reagen Stopper : SDS (sodium dodeksil sulfat) dalam

HCl 0,01 N (Merck); MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

bromide) (Sigma).

D. Tata Cara Penelitian

1. Pengumpulan dan determinasi daun sirih merah

Daun sirih merah yang digunakan diambil dari pekarangan warga Dusun

Ngangkrik, Sleman. Determinasi daun sirih merah dilakukan di laboratorium

Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

2. Pembuatan serbuk simplisia daun sirih merah

Simplisia dibuat dengan memilih daun sirih merah yang masih segar,

dibersihkan dari pengotor dan bagian lain yang tidak diinginkan seperti tanah,

akar, atau batang. Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci

dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat,

kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air menghilang. Daun kemudian dikeringkan


16

dalam lemari pengering dengan suhu 65-70˚C. Setelah kering, dibersihkan lagi

dari partikel asing lalu diserbuk dengan mesin penyerbuk sampai halus.

3. Ekstraksi simplisia daun sirih merah (Piper crocatum)

Serbuk simplisia sebanyak 100 gram diekstraksi secara perkolasi dengan

pelarut heksan. Perkolasi dilakukan dengan mengalirkan pelarut heksan melalui

serbuk simplisia dalam perkolator. Proses ini dilakukan berulang dengan pelarut

yang baru sampai tetesan terakhir pada perkolasi tidak berwarna lagi. Ekstrak

heksan yang didapat kemudian dipekatkan menggunakan vacum rotary

evaporator kemudian kandungan senyawa diidentifikasi secara KLT.

4. Propagasi dan panen sel Raji

a. Propagasi sel Raji

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam

penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul

dibuka dan sel Raji dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium

RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang,

diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.

Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang

sekali lagi. Supernatan dibuang, lalu endapan sel ditambahkan 1 ml medium

penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai

homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan

diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC dengan aliran 5% CO2. Setelah


17

24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan

jumlahnya cukup untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979;

Sambrook et al, 1989).

b. Panen sel Raji

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), sel

dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai

volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang

dan sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung

menggunakan haemocytometer dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986;

Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

5. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah pada sel Raji

a. Uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT

Pada uji sitotoksisitas ini sebanyak 100 μl ekstrak heksan daun sirih

merah pada tiap konsentrasi dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate yang

telah berisi 100 μl suspensi sel Raji. Untuk kontrol digunakan 100 μl suspensi sel

Raji dalam media penumbuh. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24

jam pada suhu 37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney, 1986;

Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10

μl MTT 5 μg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu

37oC dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan

MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100


18

μl reagen stopper SDS pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu

kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang

gelombang 570 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang

hidup.

b. Uji Sitotoksisitas dengan Metode Direct Counting

Seratus μl suspensi sel Raji dimasukkan ke dalam sumuran berisi media

RPMI 1640 pada 96-well plate, kemudian ditambah dengan ekstrak heksan daun

sirih merah pada masing-masing konsentrasi. Untuk kontrol digunakan 100 μl

suspensi sel Raji dalam media penumbuh. Selanjutnya plate diinkubasi dalam

inkubator dengan aliran 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37oC. Pada akhir masa

inkubasi, media tiap sumuran diganti dengan 200 μl Trypan blue kemudian

diresuspensi untuk homogenisasi dan diambil 10 μl untuk pengamatan.

Ditempatkan dalam haemocytometer, sel siap dihitung dengan counter dibawah

mikroskop. Pada uji sitotoksisitas terhadap sel Vero, perlakuan dilakukan sama

dengan langkah di atas, namun sebelum penambahan Trypan blue perlu dilakukan

penambahan tripsin terlebih dahulu untuk melepas sel dari dinding well.

6. Analisis hasil

Harga persentase kematian sel pada metode MTT dapat ditentukan

dengan modifikasi rumus Abbot :

% kematian sel = %100×−A

BA ,

Ket : A = Rata-rata absorbansi kontrol

B = Rata-rata absorbansi perlakuan


19

Sedangkan untuk menghitung persentase kematian sel pada metode direct

counting, dapat ditentukan dengan :

% kematian sel= %100×+

−+

∑∑ ∑

selmatihidupselhidupselselmatihidupsel

Analisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan pengolahan data

dengan statistik Z-test


20

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengumpulan dan Determinasi Daun Sirih Merah

Daun sirih merah yang digunakan untuk penelitian ini adalah daun sirih

merah segar yang dipetik dari pekarangan rumah warga di Dusun Ngangkrik,

Sleman. Kualitas dan kesamaan kandungan kimia dalam daun sirih merah

dipastikan dengan memanen daun sirih merah dalam satu kali panen di tempat

tumbuh yang sama. Kriteria pemilihan daun sirih merah yang digunakan dalam

penelitian ini adalah daun yang umurnya cukup, dipetik setelah daun ketiga dari

ujung sulur daun agar kandungan senyawa kimianya optimal.

Sebelum digunakan untuk penelitian, daun sirih merah yang sudah

dipanen harus dipastikan terlebih dahulu kebenarannya. Determinasi tanaman

dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah

Mada, Yogyakarta. Berdasarkan determinasi, tanaman ini merupakan daun sirih

merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).

B. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah

Daun sirih merah yang telah dipanen dan dideterminasi lalu dilakukan

sortasi basah yaitu daun sirih merah dibersihkan dari batang, kotoran-kotoran,

debu, tanah, dan partikel asing lainnya. Kemudian daun sirih merah dicuci dengan

air mengalir kemudian dikeringkan dibantu dengan kipas angin. Setelah itu,


21

proses pengeringan dilanjutkan ke dalam lemari pengering bersuhu 70°C serta

dipastikan bersih dari cemaran partikel asing.

Daun sirih merah yang sudah kering kemudian diserbuk dengan

menggunakan mesin penyerbuk. Dalam bentuk serbuk, luas permukaan partikel

yang kontak dengan cairan penyari semakin besar sehingga kandungan kimia

dalam sirih merah yang dapat tersari akan lebih maksimal.

C. Ekstraksi Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah

Ekstraksi serbuk simplisia daun sirih merah dalam penelitian ini

dilakukan secara perkolasi dengan menggunakan alat yang disebut perkolator.

Pada metode perkolasi, material atau serbuk simplisia yang akan disari dikemas

dalam sebuah kolom yang mempunyai kran pada bagian dasarnya dengan suatu

filter yaitu kertas saring untuk menahan material dalam kolom tersebut. Pada

proses ekstraksi, kran dibuka kemudian cairan penyari dituangkan dari atas

melewati serbuk simplisia yang akan disari.

Dalam penelitian ini, 100 gram serbuk simplisia diekstraksi dengan

cairan penyari heksan. Heksan merupakan pelarut dengan kepolaran yang sangat

rendah (non polar), sehingga dengan pelarut heksan diharapkan kandungan

senyawa dalam daun sirih merah yang akan tersari nantinya adalah senyawa-

senyawa non polar, dimana senyawa-senyawa non polar tersebut akan dibuktikan

efek sitotoksiknya. Serbuk simplisia daun sirih merah yang sudah dikemas dalam

kolom perkolator tidak langsung dialiri dengan cairan penyari heksan, namun

serbuk simplisia daun sirih merah ini terlebih dahulu direndam dengan penyari


22

heksan selama 24 jam. Hal ini bertujuan untuk memaksimalkan kontak heksan

terhadap pori-pori serbuk simplisia, sehingga diharapkan kandungan senyawa non

polar dalam daun sirih merah dapat tersari secara maksimal dalam pelarut heksan.

Setelah perendaman selama 24 jam, cairan penyari dalam kolom kemudian

dikeluarkan dan ditampung dalam labu Erlenmeyer. Kemudian dilanjutkan dengan

perkolasi, dimana cairan penyari langsung dialirkan melalui serbuk simplisia dan

langsung diteteskan untuk ditampung dalam labu erlenmeyer dengan kecepatan 2-

3 tetes per detik. Proses perkolasi ini dihentikan sampai tetes terakhir yang keluar

dari perkolator sudah bening. Hal ini diasumsikan bahwa kandungan senyawa non

polar telah tersari seluruhnya.

Keuntungan dari metode perkolasi adalah metode ini menggunakan

cairan penyari yang selalu baru. Sedangkan kelemahan metode yang dilakukan

pada penelitian ini adalah cairan penyari yang digunakan selama proses

dibutuhkan dalam jumlah yang banyak.

Kandungan senyawa-senyawa non polar yang ada dalam daun sirih

merah dimungkinkan adalah senyawa-senyawa yang tergolong minyak atsiri.

Minyak atsiri sebagian besar terdiri dari monoterpen, sesquiterpen dan senyawa

fenolik. Sedangkan senyawa-senyawa lain yang bersifat polar seperti alkaloid dan

flavonoid tidak tersari dalam heksan karena hanya larut dalam pelarut yang polar.

Untuk memastikan bahwa senyawa-senyawa yang tersari dalam pelarut

heksan adalah senyawa non polar yaitu minyak atsiri, maka perlu dibuat profil

KLT dari ekstrak heksan daun sirih merah.


23

Tabel I. Hasil pengamatan profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah Uji Baku

pembanding Hasil

Cineol + Caryophylen - Cavicol -

Minyak Atsiri

Carvacrol - Kinin - Alkaloid Tanin -

Flavonoid Rutin -

Profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah menunjukkan hasil positif

mengandung minyak atsiri dengan pembanding baku cineol, sedangkan untuk uji

adanya alkaloid dengan pembanding kinin dan tanin serta uji adanya flavonoid

dengan pembanding rutin hasil ketiganya negatif.

Identifikasi minyak atsiri juga dilakukan dengan menggunakan baku

pembanding yang lain yaitu caryophilen, cavicol dan carvacrol. Namun dari hasil

KLT ternyata hasil ketiganya negatif. Hal ini mungkin disebabkan kadar senyawa-

senyawa tersebut dalam daun sirih merah cukup kecil sehingga senyawa tersebut

tidak dapat terdeteksi dengan uji KLT.

KLT memiliki sensitivitas yang cukup kecil, sehingga senyawa-senyawa

dalam ekstrak heksan yang dimungkinkan memiliki konsentrasi yang kecil tidak

dapat terdeteksi. Untuk penelitian selanjutnya, maka disarankan menggunakan

kromatografi gas. Kromatografi gas mempunyai sensitivitas yang lebih baik

dibandingkan dengan KLT. Batas deteksi senyawa menggunakan KLT hanya

sebesar 0,1-0,01 μg sedangkan pada kromatografi gas memiliki batas deteksi 0,1-

0,01 ng (Wijesekera, 1991). Dengan tingkat sensitivitas yang lebih tinggi ini,

maka diharapkan agar senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun sirih merah


24

dapat terdeteksi baik kualitatif maupun kuantitatif. Selain dari segi sensitivitas,

kromatografi gas ini sesuai untuk identifikasi minyak atsiri karena minyak atsiri

mempunyai sifat mudah menguap yang merupakan syarat utama dalam

kromatografi ini.

D. Propagasi dan Panen Sel Raji

Sel Raji diambil dari tangki nitrogen cair dalam keadaan beku sehingga

tidak merubah kondisi sel dari bentuk aslinya. Sesaat setelah pencairan, ampul

disemprot dengan etanol sehingga kontaminasi dari luar dapat dicegah.

Sel Raji dipanen setelah pertumbuhannya cukup kira-kira setelah

berumur 7 hari. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan sel antara lain

media pertumbuhan, parameter-parameter fisiologi, bebas dari efek toksik, dan

pemilihan serum.

Media yang digunakan untuk kultur sel harus mengandung ketersediaan

nutrien yang cukup, meliputi raw materials yang dibutuhkan untuk sintesis sel

baru, ketersediaan substrat sebagai energi metabolisme, vitamin dan mineral, serta

ion-ion inorganik yang berperan penting dalam proses katalitik maupun fisiologik.

Kultur sel Raji ditumbuhkan dalam media RPMI 1640, dimana media ini

mengandung FBS (Foetal Bovine Serum) dengan berbagai macam asam amino

assential antara lain arginin, glutamin, histidin, isoleusin, leusin, lysin, metionin,

fenilalanin, treonin, triptopan, tirosin dan valin; asam amino nonessential seperti

asparagin, aspartat, glutamat, glisin, prolin, dan serin serta asam amino derivatif

seperti glutation dan hidroksiprolin. Selain itu, RPMI juga mengandung vitamin


25

dan koenzim seperti biotin, asam folat, asam p-amino benzoat, nikotinamid,

piridoksin, riboflavin, tiamin, dan vitamin B12 serta mengandung lemak yaitu

kolin dan inositol, ion-ion inorganik seperti kalsium, magnesium, potasium,

natrium, klorit, nitrat, fosfat dan sulfat, glukosa, buffer bikarbonat dan CO2 5%.

Parameter-parameter fisiologi juga penting diperhatikan dalam media

kultur sel. Parameter-parameter tersebut diantaranya temperatur, pH, tekanan

karbondioksida, buffer, dan kelembaban inkubator (humidification of incubators).

Pada temperatur yang sesuai, sel dapat tumbuh dengan baik. Sel Raji yang

digunakan dalam penelitian ini dapat tumbuh dengan baik pada suhu 37°C, serta

pada kondisi pH antara 7,2-7,4. Selain itu, kultur sel membutuhkan

karbondioksida dan/atau ion bikarbonat sebagai substrat biosintesis. Asam

karbonat maupun asam bikarbonat dapat terbentuk dari air dan karbondioksida,

oleh karena itu tekanan CO2 yang cukup dalam media sangat penting dibutuhkan

oleh sel. Pada kultur sel Raji tekanan CO2 yang dibutuhkan sebesar 5%, dimana

pada konsentrasi tersebut sesuai dengan konsentrasi CO2 pada cairan tubuh.

Kebutuhan akan penggunaan CO2 dalam chamber inkubasi seperti

dijelaskan di atas, dapat menimbulkan masalah terhadap pH. Buffer bikarbonat

dapat berfungsi sebagai kontrol pH selama kultur sel berada dalam inkubator.

Namun, media yang mengandung bikarbonat tersebut akan mengalami perubahan

pH menjadi alkali bila dipindahkan dari inkubator karena kehilangan CO2. Oleh

karena itu, digunakan pula suatu buffer organik yaitu HEPES yang dapat

memperkecil kemungkinan perubahan pH saat kultur dipindahkan dari inkubator.


26

E. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah pada Sel Raji

Ekstrak heksan daun sirih merah diujikan efek sitotoksiknya dengan dua

metode yaitu metode MTT dan metode Direct Counting. Parameter uji

sitotoksisitas yang digunakan adalah LC50 (Lethal Concentration 50 %) yang

menunjukkan potensi ketoksikan suatu senyawa, dimana konsentrasi tersebut

dapat membunuh 50% populasi sel Raji.

1. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT

Metode MTT didasarkan pada aktivitas enzim yang dapat diukur secara

kolorimetri, dimana enzim dehidrogenase mitokondria mereduksi substrat MTT

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) yang larut air

(berwarna kuning), menjadi kristal formazan berwarna biru tua. Reaksi reduksi

MTT oleh enzim dehidrogenase mitokondria ditunjukkan dalam gambar di bawah

ini :

NN

NN

S

N

CH3

CH3

NHN

NN

S

N

CH3

CH3

NADH

NAD+

MTT

Br

Formazan

Gambar 1. Reaksi reduksi MTT oleh enzim dehidrogenase mitokondria

Metode ini merupakan uji sitotoksik yang cepat, sensitif, akurat dan

sejumlah besar sampel dapat diukur secara otomatis dengan spektrofotometer.

Jumlah sel yang hidup dapat diketahui dari absorbansi hasil pembacaan ELISA

reader berdasarkan intensitas warna kristal formazan yang terbentuk, dimana


27

korelasi antara absorbansi dan jumlah sel hidup berbanding lurus. Semakin besar

absorbansi maka semakin banyak sel hidup, begitu pula sebaliknya, semakin kecil

absorbansi maka jumlah sel yang hidup semakin sedikit. Hal ini dikarenakan pada

sel yang hidup, berarti enzim dalam sel tersebut masih beraktivitas mereduksi

MTT menjadi kristal formazan berwarna biru tua. Semakin besar aktivitas enzim

tersebut, maka semakin besar kristal formazan yang direduksi dan warna biru tua

yang dihasilkan semakin pekat sehingga absorbansinya pun semakin besar. Hal ini

juga berlaku sebaliknya pada sel yang mati.

Dalam penelitian ini, dilakukan pengukuran absorbansi pada kelompok

perlakuan maupun pada kontrol. Kelompok perlakuan adalah sel Raji dengan

perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah sebanyak 10 konsentrasi. Sedangkan

pada kelompok kontrol adalah sel Raji tanpa perlakuan ekstrak heksan daun sirih

merah. Masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dilakukan replikasi

sebanyak tiga kali. Hasil pembacaan absorbansi ELISA reader dapat dilihat dalam

tabel dan gambar di bawah ini :

Tabel II. Tabel nilai absorbansi ekstrak heksan daun sirih merah pada berbagai konsentrasi dengan metode MTT

Replikasi I II III

Konsentrasi (µg/ml)

Absorbansi Absorbansi Absorbansi

Rata-rata absorbansi

% kematian sel Raji

Kontrol 1,563 1,825 1,792 1,727 62,50 1,457 1,462 1,406 1,442 16,50 31,25 1,537 1,569 1,474 1,527 11,58 15,63 1,529 1,477 1,398 1,468 14,99 7,81 1,500 1,547 1,595 1,547 10,42 3,91 1,502 1,555 1,528 1,528 11,52 1,95 1,450 1,476 1,441 1,456 15,69 0,98 1,517 1,542 1,489 1,516 12,22 0,49 1,618 1,596 1,600 1,605 7,06 0,24 1,552 1,549 1,428 1,510 12,57 0,12 1,453 1,556 1,522 1,510 12,57


28

uji MTT ekstrak heksan daun sirih merah pada sel raji

-5

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 30 40 50 60 70

konsentrasi (ug/ml)

% k

emat

ian

Gambar 2. Kurva konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap hasil

perhitungan % kematian sel

Berdasarkan pembacaan absorbansi dengan ELISA reader di atas, dapat

dilihat bahwa perbedaan absorbansi pada tingkat konsentrasi ekstrak heksan daun

sirih merah yang berbeda tidak menunjukkan hasil yang benar. Intensitas warna

ungu dari kristal formazan tidak terbaca, dimana seharusnya semakin besar

konsentrasi senyawa uji (ekstrak heksan daun sirih merah) maka absorbansi yang

terbaca semakin kecil karena semakin sedikit sel yang hidup. Namun, absorbansi

yang terbaca justru fluktuatif tidak menentu.

Kesalahan pembacaan absorbansi pada ELISA tersebut mungkin

dikarenakan oleh adanya interferensi terhadap MTT, dimana terjadi interaksi

senyawa alami pada ekstrak heksan daun sirih merah dengan MTT sehingga

mengganggu terbentuknya kristal formazan sehingga membuat intensitas warna

formazan tidak terbaca dengan benar pada ELISA reader. Kemungkinan tersebut

didukung oleh penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya (Regina, B., 2002

dan Ulukaya, E., 2004) yang mengemukakan bahwa pada beberapa senyawa


29

antikanker seperti kaempferol dan resveratrol dapat berinteraksi dengan MTT

sehingga menyebabkan pembacaan absorbansi kristal formazan menjadi tidak

benar. Berdasarkan hasil tersebut, maka sebelum metode MTT digunakan untuk

uji sitotoksisitas selanjutnya maka perlu dilakukan cek terlebih dahulu untuk

mengetahui adanya kemungkinan senyawa dalam ekstrak uji yang berinteraksi

dengan MTT.

Kesalahan pembacaan absorbansi pada metode MTT juga dapat

dikarenakan oleh media sel yang digunakan. Kontaminasi mikroba dalam media

dapat mengganggu terbentuknya formazan dan kandungan protein yang tinggi

dalam media dapat mengendap bila reagen MTT ditambahkan, sehingga hal

tersebut dapat mengganggu pembacaan absorbansi. Selain itu, penyimpanan

reagen MTT yang tidak benar dapat menyebabkan terjadinya dekomposisi reagen

MTT sehingga menghasilkan pembacaan absorbansi yang salah (Anonim, 2009d).

Namun cukup kecil kemungkinan bahwa kesalahan pembacaan absorbansi pada

metode MTT di penelitian ini dikarenakan oleh kandungan protein yang terlalu

tinggi ataupun kesalahan penyimpanan. Dalam penelitian ini, protein yang

terkandung dalam media sudah disesuaikan kebutuhannya. Protein ini terdapat

dalam FBS (Fetal Bovine Serum) dimana jumlah optimum yang diberikan ke

dalam media adalah 10%. Sedangkan penyimpanan reagen MTT ini sudah

dilakukan sesuai prosedur yaitu pada suhu 4°C.

2. Uji sitotoksisitas dengan metode direct counting

Metode yang selanjutnya dipakai untuk uji sitotoksisitas adalah metode

direct counting. Perhitungan sel dilakukan dengan haemocytometer yaitu suatu


30

chamber dengan kedalaman 0,1 mm, dan terbagi dalam persegi-persegi untuk

mempermudah pengamatan dan perhitungan di bawah mikroskop. Pada metode

ini, sel diperlakukan dengan penambahan Trypan blue untuk dapat menghitung sel

baik sel yang hidup maupun sel yang mati. Trypan blue ini hanya bisa menembus

membran pada sel yang mati. Ketika suspensi sel dilemahkan dengan Trypan

blue, sel yang hidup akan tetap kecil dan bergerak, sedangkan sel yang rusak atau

mati akan membengkak, lebih luas dan berwarna biru tua. Metode perhitungan sel

secara direct counting cukup menguntungkan karena metode ini cukup murah dan

dapat dilakukan pengamatan dan perhitungan langsung terhadap sel yang diamati.

(i)

(ii)

Gambar 3. Sel yang hidup (i) dan sel yang mati (ii) setelah pemberian trypan blue pada haemocytomoter di bawah pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x

Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah selain dilakukan pada

sel Raji, juga dilakukan pada sel Vero. Sel Raji adalah sel kanker yang diturunkan

dari penyakit limfoma Burkitt. Sedangkan sel Vero merupakan sel normal yang

diambil dari sel ginjal kera. Perbedaan perlakuan pada kedua sel ini adalah adanya

penambahan tripsin yang dilakukan pada sel Vero. Fungsi tripsin ini adalah untuk

melepaskan sel yang melekat di dinding well. Sel Raji tidak diberi penambahan


31

tripsin karena sel ini tidak melekat pada dinding well, namun mengambang dalam

medium.

Pada uji sitotoksisitas ini, diperlukan kontrol baik pada sel Raji maupun

pada sel Vero. Kontrol berisi medium dan sel yang sama dengan sampel namun

tanpa diberi perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah. Kontrol ini berfungsi

untuk membandingkan kondisi sel yang diberi perlakuan dengan sel tanpa

perlakuan. Setelah inkubasi, tidak terjadi kematian baik pada kontrol sel Raji

maupun pada kontrol sel Vero.

(i) (ii)

Gambar 4. Kontrol sel Raji (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x

Pada uji sitotoksisitas ekstrak heksan terhadap sel Raji, digunakan

delapan konsentrasi ekstrak heksan sebesar 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, dan

125 µg/ml. Sedangkan pada sel Vero, uji sitotoksisitas juga dilakukan dengan

delapan konsentrasi ekstrak heksan yaitu 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, dan

100 µg/ml. Pada perlakuan masing-masing konsentrasi ekstrak heksan tersebut,

dilakukan perhitungan jumlah sel mati dan jumlah sel hidup dengan perhitungan


32

langsung (direct counting). Metode ini subyektivitasnya cukup tinggi, sehingga

perhitungan dilakukan sebanyak tiga kali.

Tabel III. Hasil perhitungan sel Raji pada masing-masing konsentrasi ekstrak

heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting Replikasi

I II III Konsentrasi

ekstrak heksan daun sirih merah

(µg/ml) Sel

Hidup Sel Mati Sel

Hidup Sel Mati Sel

Hidup Sel

Mati 300 0 41 0 41 0 41 275 0 41 0 42 0 41 250 5 38 5 39 5 38 225 10 34 10 35 10 35 200 17 30 16 31 16 32 175 18 28 20 28 19 29 150 25 25 25 25 25 25 125 31 21 32 20 32 20

kontrol 76 0 75 0 76 0

Tabel IV. Hasil perhitungan sel Vero pada masing-masing konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting

Replikasi I II III

Konsentrasi ekstrak heksan

daun sirih merah (µg/ml)

Sel Hidup

Sel Mati Sel Hidup

Sel Mati Sel Hidup

Sel Mati

800 0 42 0 42 0 43 700 5 37 6 37 6 37 600 13 34 13 33 13 33 500 19 30 18 30 18 30 400 26 26 26 26 26 26 300 31 23 32 23 33 23 200 37 20 38 20 38 20 100 44 18 45 18 46 17

kontrol 75 0 75 0 75 0 Data hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa semakin besar

konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah maka jumlah sel mati semakin

meningkat, dimana pada konsentrasi tertinggi ekstrak heksan mampu membunuh

seluruh polulasi sel. Pada kedua kontrol baik pada kontrol sel Raji maupun


33

kontrol sel Vero yang tidak diberi perlakuan dengan ekstrak heksan daun sirih

merah, tidak terjadi kematian pada populasi sel. Hal ini menunjukkan bahwa

kematian sel pada kelompok perlakuan memang disebabkan oleh ekstrak heksan

daun sirih merah. Dari data jumlah sel yang hidup dan mati tersebut, dapat

diketahui % kematian sel yang disebabkan ekstrak heksan daun sirih merah.

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah (mikrogram/ml)

Rat

a-ra

ta %

kem

atia

n

sel Raji sel Vero

Gambar 5. Kurva Konsentrasi Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah terhadap %

Kematian Sel Raji dan Sel Vero

Persen kematian sel yang disebabkan oleh masing-masing konsentrasi

ekstrak heksan daun sirih merah dapat digunakan untuk mencari harga probit

masing-masing konsentrasi sehingga nantinya dapat diperoleh LC50 ekstrak

heksan daun sirih merah baik terhadap sel Raji maupun sel Vero.


34

Tabel V. Data % kematian sel Raji dan harga probitnya setelah inkubasi 24 jam dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah

% kematian Konsentrasi ekstrak heksan


Rep I Rep II Rep III Rata-rata Probit

300 100 100 100 100 - 275 100 100 100 100 - 250 88,37 88,64 88,37 88,46 6.18 225 77,27 77,78 77,78 77,61 5.77 200 63,83 65,96 66,67 65,48 5.39 175 60,87 58,33 60,42 59,87 5.25 150 50 50 50 50 5 125 40,38 38,46 38,46 39,10 4.72

Tabel VI. Data % kematian sel Vero dan harga probitnya setelah inkubasi 24 jam

dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah % kematian Konsentrasi

ekstrak heksan daun sirih

merah (µg/ml)


800 100 100 100 100 - 700 88,10 86,05 86,05 86,73 6,13 600 72,34 71,74 71,74 71,94 5,58 500 61,22 62,5 62,5 62,07 5,31 400 50 50 50 50 5 300 42,59 41,82 41,07 41,83 4,80 200 35,09 34,48 34,48 34,68 4,61 100 29,03 28,57 26,98 28,19 4,42

y = 4,5687x - 4,9458

0

1

2

3

4

5

6

7

1,5 2 2,5 3log konsentrasi

harg

a pr

obit

Gambar 6. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap harga

probit pada sel Raji


35

y = 1,8099x + 0,5443

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

log konsentrasi

harg

a pr

obit

Gambar 7. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap harga

probit pada sel Vero

Berdasarkan data nilai probit yang diperoleh dari persen kematian pada

tiap-tiap konsentrasi ketiga replikasi, diperoleh persamaan regresi linier antara log

konsentrasi terhadap nilai probit. Dari persamaan ini dapat dihitung nilai LC50

ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel Raji dan sel Vero. Hasil perhitungan

didapatkan nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel Raji sebesar

150,583 µg/ml sedangkan nilai LC50 terhadap sel Vero adalah sebesar 289,514

µg/ml. Menurut NIH (National Institute of Health) suatu bahan dapat dikatakan

berpotensi sitotoksik kuat apabila memiliki nilai LC50 = 0,19-0,528 mg/ml

(Mazzio,2009), dengan demikian dapat dikatakan bahwa ekstrak heksan daun sirih

merah bersifat sitotoksik kuat terhadap sel Raji.

Untuk memastikan efek sitotoksisitas dari ekstrak heksan daun sirih

merah, maka dilakukan analisis statistik Z-test. Analisis ini bertujuan untuk

mengetahui apakah pemberian ekstrak heksan daun sirih merah dalam berbagai

konsentrasi pada sel raji, memiliki perbedaan bermakna terhadap kontrol.

Berdasarkan hasil perhitungan statistik tersebut diketahui bahwa Z hitung pada

semua konsentrasi ekstrak heksan lebih besar daripada Z tabel dengan taraf


36

kepercayaan 95%. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak heksan daun

sirih merah dalam berbagai konsentrasi pada sel raji memiliki perbedaan

bermakna terhadap kontrol.

Pada konsentrasi 150,583 µg/ml ekstrak heksan daun sirih merah

dimungkinkan masih cukup aman terhadap sel normal. Keamanan terhadap sel

normal ini belum bisa dipastikan walaupun berdasarkan hasil penelitian diketahui

bahwa nilai LC50 ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel normal (sel Vero)

hampir dua kali lipat dibandingkan LC50 terhadap sel kanker (sel Raji) yang

berarti bahwa sifat sitotoksik terhadap sel normal hampir setengah kali lipat lebih

kecil daripada sel kanker. Hal ini disebabkan karena sel Raji dan sel Vero tidak

diambil dari organ yang sama. Sel Raji merupakan sel kanker yang diambil dari

kanker limfoma yang sering terdapat di tulang, perut atau hati, sedangkan sel Vero

merupakan sel normal yang diambil dari organ ginjal. Tiap-tiap sel dalam tubuh

mempunyai karakteristik yang berbeda. Sel Raji maupun sel Vero terletak di

lokasi yang berbeda, maka karakteristiknya pun akan berbeda. Perbedaan

karakteristik sel mempengaruhi aktivitas ekstrak heksan daun sirih merah sebagai

agen sitotoksik, sehingga interaksi antara sel dengan ekstrak uji pun berbeda.

Untuk perkembangan penelitian selanjutnya, maka disarankan untuk

menggunakan sel Raji dan sel limfosit normal.

Keterbatasan lain dari penelitian ini adalah tidak dilakukannya uji

sitotoksisitas dengan kontrol pelarut. Pelarut heksan diketahui bersifat toksik,

sehingga dikhawatirkan bahwa efek sitotoksik ekstrak heksan ini dipengaruhi oleh

pelarut heksan. Pada penelitian selanjutnya disarankan agar menggunakan kontrol


37

pelarut agar efek toksik daun sirih merah yang diteliti dalam uji sitotoksisitas

menjadi lebih akurat.

Pada penelitian sebelumnya, diketahui bahwa ekstrak etanolik daun sirih

merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mempunyai nilai LC50 sebesar 395,5 µg/ml.

Hal ini membuktikan bahwa daun sirih merah dalam bentuk ekstrak heksan

mempunyai efek sitotoksik yang lebih besar daripada dalam bentuk ekstrak

etanolik. Efek sitotoksik yang lebih besar ini dapat dipengaruhi oleh metode

penyarian yang dilakukan maupun besarnya kandungan senyawa sitotoksik dalam

daun sirih merah yang dapat tersari. Metode penyarian yang dilakukan

sebelumnya dilakukan secara maserasi, sedangkan pada penelitian ini dilakukan

secara perkolasi. Cara perkolasi lebih baik dibandingkan dengan cara maserasi

karena aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang selalu

baru, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi. Dengan demikian,

dapat dipastikan bahwa senyawa sitotoksik yang tersari akan lebih optimal dengan

perkolasi.

Selain metode penyarian, besarnya kandungan senyawa sitotoksik juga

berpengaruh. Pelarut etanol yang digunakan pada ekstrak etanolik daun sirih

merah mempunyai range kepolaran yang jauh, sehingga banyak senyawa-senyawa

yang akan tersari dalam pelarut tersebut, seperti alkaloid, flavonoid, maupun

minyak atsiri. Sedangkan pada pelarut heksan yang mempunyai kepolaran rendah

(non polar) hanya dapat menyari senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah

pula yakni minyak atsiri, sehingga konsentrasi senyawa tersebut akan lebih besar

bila dibandingkan dengan konsentrasi senyawa tersebut dalam ekstrak etanol yang


38

mengandung bermacam-macam senyawa. Semakin besar konsentrasi senyawa

sitotoksik yang tersari maka sifat sitotoksik yang dihasilkanpun akan lebih besar.


39

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Ekstrak heksan daun sirih merah memiliki efek sitotoksik dengan harga LC50

sebesar 150,583 µg/ml.

B. Saran

1. Identifikasi kandungan senyawa atsiri dalam ekstrak heksan daun sirih merah

penting dilakukan untuk mengetahui senyawa apa yang beraktivitas sitotoksik

terhadap sel kanker. Disarankan pada penelitian selanjutnya untuk melakukan

identifikasi kandungan senyawa menggunakan kromatografi gas yang

sensitivitasnya lebih tinggi.

2. Penelitian sitotoksisitas pada sel Raji dilanjutkan dengan menggunakan metode

selain MTT dan direct counting, seperti neutral red, methylene blue, XTT, Acid

Phosphatase, Lactate dehydrogenase (LDH) atau Resazurin.

3. Dilakukan optimasi jumlah sel dalam 96-well plate pada metode MTT, sehingga

intensitas warna Kristal formazan dapat terbaca dengan baik oleh ELISA reader.

4. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah perlu dilakukan dengan

menggunakan kontrol pelarut heksan.

5. Untuk pengembangan uji sitotoksisitas, disarankan untuk meneliti efek

sitotoksisitas dari isolat daun sirih merah baik terhadap kultur sel Raji maupun sel

limfosit normal.


40

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2009a, Limfoma, Lembaran Informasi 509 Yayasan Spirita, http://www.i-

base.info/itpc/Indonesian/spirita/docs/Lembaran-Informasi/LI509.pdf, diakses pada tanggal 12 Maret 2009

Anonim, 2009b, Raji Cell, http://www.mondofacto.com/facts/dictionary?Raji+cell,

diakses pada tanggal 8 Maret 2009 Anonim, 2009c, MTT Cell Proliferation Assay,

http://www.atcc.org/common/products/MttCell.cfm, diakses pada tanggal 12 Maret 2009

Anonim, 2009d, In Vitro Toxicology Assay Kit MTT Based, Product Information,

Sigma-Aldrich, Inc. Anita, 2008, Kanker, http://bima.ipb.ac.id/anitakanker.htm, diakses pada tanggal 4

Oktober 2008

Anonim, 2007, Piper crocatum taxonomy, http://zipcodezoo.com/plants/p/piper_crocatum.asp, diakses pada tanggal 31 Agustus 2008

Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan pertama,

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-2, 10, Departemen Republik Indonesia, Jakarta Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I

dan II, N. V. Noordhoff, Graningen. Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research,

John Willey and Sons Ltd, New York Elfrod, S. and William, S., 2007, Genetika, edisi keempat, 261-263, Penerbit

Erlangga. Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-73,

IRL Press, Washington DC. Houghton & Raman, 1998, Laboratory Handbook for The Fractionatio of Natural

Extracts, Coldspring Harbor Laboratory Press. Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume

VIII, Academia Press Inc, New York.


41

Kusumaningtyas, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper crocatum) terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi,Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Mazzio, E. A., 2009, In Vitro Screening for The Tumoridical Properties of

International Medicinal Herbs, Phytother Res. , NIH Public Access. Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi Dan Biologi, 157, Ghalia Indonesia, Jakarta Regina, B., Katrin, V. D., Gernot, J., Willi, S., Tullberg-Reinert, 2002, Interference

Of Plant Extracts, Phytoestrogens And Antioxidants With The MTT Tetrazolium Assay, Planta Medica Journal, University Clinics, Bassel.

Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, terjemahan oleh Kosasih

Padmawinata, edisi keenam, 132-134, Penerbit ITB, Bandung. Sambrook, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory

Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press. Sudewo, B., 2005, Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, Agromedia Pustaka, Jakarta Tjindarbumi, D., 2005, Deteksi Dini Kanker, Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia Ulakaya, E., 2004, Interference by Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents in the

MTT-Tumor Chemosensitivity Assay, Experimental Chemotherapy Journal,

Uludag University, Turki.

Wijeksera, 1991, The Medicinal Plant Industry, 101, CRC Press, New York. Wolfe S.L.,1993, Molecular and Cellular Biology, 939, A division of Wadsworth,

Inc., California.


42

Lampiran 1. Bahan dan Peralatan yang Digunakan dalam Penelitian

Gambar 8. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

Gambar 9. Laminar Air Flow

Gambar 10. Inverted Microscope


43

Gambar 11. 96well plate, tabung conical steril dan flask

Gambar 12. Cell counter dan haemocytometer


44

Lampiran 2. Hasil Pengamatan Sel Raji dan Sel Vero dengan Mikroskop dengan Perbesaran 100x Setelah Pemberian Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah pada Inkubasi 24 jam

Pengamatan Sel Raji

Gambar 13. Perlakuan ekstrak uji 300µg/ml Gambar 14. Perlakuan ekstrak uji275µg/ml




45


Pengamatan Sel Vero





46



47

Lampiran 3. Tabel Probit

Probit Persen

tase 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66

10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12

20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45

30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72

40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97

50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23

60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50

70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81

80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23

90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99

7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09

(Mursyidi, 1985)


48

Lampiran 4. Perhitungan LC50 Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah terhadap Sel Raji Dan Sel Vero

SEL RAJI • Data jumlah sel dari perhitungan di haemocytometer

Replikasi I II III



Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

300 0 41 0 41 0 41 275 0 41 0 42 0 41 250 5 38 5 39 5 38 225 10 34 10 35 10 35 200 17 30 16 31 16 32 175 18 28 20 28 19 29 150 25 25 25 25 25 25 125 31 21 32 20 32 20

kontrol 76 0 75 0 76 0 • Data jumlah sel mati dan hidup sebenarnya

Jumlah sel sebenarnya = 200104

××x

x = jumlah sel dari perhitungan sel di haemocytometer 4 = jumlah bilik pada haemocytometer 10 = volume yang diambil untuk pengamatan di haemocytometer 200 = volume total dari well

Replikasi I II III

Konsentrasi ekstrak

heksan daun sirih merah

(µg/ml)

Sel Hidup

Sel Mati Sel Hidup

Sel Mati Sel Hidup

Sel Mati

300 0 20500 0 20500 0 20500 275 0 20500 0 21000 0 20500 250 2500 19000 2500 19500 2500 19000 225 5000 17000 5000 17500 5000 17500 200 8500 15000 8000 15500 8000 16000 175 9000 14000 10000 14000 9500 14500 150 12500 12500 12500 12500 12500 12500 125 15500 10500 16000 10000 16000 10000

kontrol 38000 0 37500 0 38000 0


49

• Perhitungan % kematian

% kematian = ( ) %100×⊕∑

∑−⊕∑selhidupselmati

selhidupselhidupselmati

% kematian Rep I Rep II Rep III Rata-rata

kontrol 0 0 0 0

% kematian Konsentrasi ekstrak heksan



300 100 100 100 100 - 275 100 100 100 100 - 250 88,37 88,64 88,37 88,46 6.18 225 77,27 77,78 77,78 77,61 5.77 200 63,83 65,96 66,67 65,48 5.39 175 60,87 58,33 60,42 59,87 5.25 150 50 50 50 50 5 125 40,38 38,46 38,46 39,10 4.72

Persamaan regresi linier log konsentrasi vs probit

A = - 4,9458

B = 4,5687

r = 0,9740

Y = Bx + A

Y = 4,5687 x – 4,9458

Y = LC50 , LC50 = 50% mempunyai harga probit 5, maka

Y = 4,5687 x – 4,9458

5 = 4,5687 x – 4,9458

X = 2,1769

LC50 = antilog 2,1769

= 150,2796

LC50 terhadap sel Raji = 150,2796 µg/ml


50

SEL VERO

• Data jumlah sel dari perhitungan di haemocytometer

Replikasi I II III



Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

800 0 42 0 42 0 43 700 5 37 6 37 6 37 600 13 34 13 33 13 33 500 19 30 18 30 18 30 400 26 26 26 26 26 26 300 31 23 32 23 33 23 200 37 20 38 20 38 20 100 44 18 45 18 46 17

kontrol 75 0 75 0 75 0 • Data jumlah sel mati dan hidup sebenarnya

Jumlah sel sebenarnya = 200104

××x

x = jumlah sel dari perhitungan sel di haemocytometer 4 = jumlah bilik pada haemocytometer 10 = volume yang diambil untuk pengamatan di haemocytometer 200 = volume total dari well

Replikasi I II III

Konsentrasi ekstrak

heksan daun sirih merah

(µg/ml)

Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

800 0 21000 0 21000 0 21500 700 2500 18500 300 18500 3000 18500 600 6500 17000 6500 16500 6500 16500 500 9500 15000 9000 15000 9000 15000 400 13000 13000 13000 13000 13000 13000 300 15500 11500 16000 11500 16500 11500 200 1850 10000 19000 10000 19000 10000 100 22000 9000 22500 9000 23000 8500

kontrol 37500 0 37500 0 37500 0


51

• Perhitungan % kematian

% kematian = ( ) %100×⊕∑

∑−⊕∑selhidupselmati

selhidupselhidupselmati

% kematian Rep I Rep II Rep III Rata-rata

kontrol 0 0 0 0

% kematian Konsentrasi

ekstrak heksan daun sirih

merah (µg/ml)


800 100 100 100 100 - 700 88,10 86,05 86,05 86,73 6,13 600 72,34 71,74 71,74 71,94 5,58 500 61,22 62,5 62,5 62,07 5,31 400 50 50 50 50 5 300 42,59 41,82 41,07 41,83 4,80 200 35,09 34,48 34,48 34,68 4,61 100 29,03 28,57 26,98 28,19 4,42

Persamaan regresi linier log konsentrasi vs probit

A = 0,5443

B = 1,8099

r = 0,9025

Y = Bx + A

Y = 1,8099x +0,5443

Y = LC50 , LC50 = 50% mempunyai harga probit 5, maka

Y = 1,8099x +0,5443

5 = 1,8099x +0,5443

X = 2,4618

LC50 = antilog 2,4618

= 289,6010

LC50 terhadap sel Vero = 289, 6010 µg/ml


52

Lampiran 5. Uji Signifikansi Antara Perlakuan dan Kontrol dengan analisis Z-Test

Po = 21

2211nn

pnpn++

Z =

2)1(

1)1(

21

nPoPo

nPoPo

PP−

+−

−

Hi = perlakuan dan kontrol berbeda secara signifikan Ho = perlakuan dan kontrol tidak berbeda secara signifikan Ho diterima jika Z Hitung < Z tabel (1,96) SEL RAJI

Replikasi I II III



Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

300 0 41 0 41 0 41 275 0 41 0 42 0 41 250 5 38 5 39 5 38 225 10 34 10 35 10 35 200 17 30 16 31 16 32 175 18 28 20 28 19 29 150 25 25 25 25 25 25 125 31 21 32 20 32 20

kontrol 76 0 75 0 76 0

Rata-rata Konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah (µg/ml)

Sel Hidup

Sel Mati

Proporsi (P)

Po

Z

Keterangan

300 0 41 1 0,35 10,847 Berbeda signifikan 275 0 41 1 0,35 10,847 Berbeda signifikan 250 5 38 0,884 0,32 9,945 Berbeda signifikan 225 10 35 0,778 0,29 9,106 Berbeda signifikan 200 16 31 0,660 0,25 8,186 Berbeda signifikan 175 19 28 0,596 0,23 7,631 Berbeda signifikan 150 25 25 0,5 0,20 6,868 Berbeda signifikan 125 32 20 0,385 0,16 5,804 Berbeda signifikan

kontrol 76 0 0


53

SEL VERO

Replikasi I II III



Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

Sel Hidup

Sel Mati

800 0 42 0 42 0 43 700 5 37 6 37 6 37 600 13 34 13 33 13 33 500 19 30 18 30 18 30 400 26 26 26 26 26 26 300 31 23 32 23 33 23 200 37 20 38 20 38 20 100 44 18 45 18 46 17

kontrol 75 0 75 0 75 0

Rata-rata Konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah (µg/ml)

Sel Hidup

Sel Mati

Proporsi (P)

Po

Z

Keterangan

800 0 42 1 0,36 10,783 Berbeda signifikan 700 6 37 0,860 0,31 9,676 Berbeda signifikan 600 13 33 0,717 0,27 8,632 Berbeda signifikan 500 18 30 0,625 0,24 8,207 Berbeda signifikan 400 26 26 0,5 0,20 6,934 Berbeda signifikan 300 32 23 0,418 0,18 6,097 Berbeda signifikan 200 38 20 0,345 0,15 5,524 Berbeda signifikan 100 45 18 0,286 0,13 4,979 Berbeda signifikan

kontrol 75 0 0


54

Lampiran 6. Hasil Uji KLT Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah

Keterangan gambar : Cp = standar aryophyllen Ca = standar cavicol H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7) Deteksi = semprot vanilin

Keterangan gambar : Cr = standar carvacrol H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7) Deteksi = semprot vanilin

Cp Ca H Cr H


55

Keterangan gambar : Ci = standar cineol H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7) Deteksi = semprot vanilin

Keterangan gambar : T = standar tanin H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = BAW (4:1:5)

Ci H T H


56

Keterangan gambar : R = standar rutin H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = selulosa Fase gerak = etil asetat:asan asetat: asam formiat:air (100:11:11:27) Deteksi = uap amonia

Keterangan gambar : K = standar kinin H = ekstrak heksan daun sirih merah Fase diam = silika GF 254 Fase gerak = metanol:amonia (100:1,5) Deteksi = semprot vanilin

H R HK


56

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK

HEKSAN DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum

Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI,

dengan nama lengkap Clara Sinta, dilahirkan di

Gunungkidul pada tanggal 11 Desember 1987. Penulis

merupakan anak kedua dari pasangan Bapak Heronimus

Yuana Sutanta, S.Pd., dan Ibu Yulia Titik Dwi Suatmini.

Penulis menyelesaikan pendidikan di Taman Kanak-

Kanak Pertiwi IV Karangmojo pada tahun 1993, kemudian pendidikan di Sekolah

Dasar Candibaru I Karangmojo pada tahun 1993-1999. Penulis melanjutkan

pendidikan di SMP Kanisius Wonosari pada tahun 1999-2002 dan di SMA Negeri

6 Yogyakarta pada tahun 2002-2005, dilanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2005-2009. Semasa kuliah,

penulis pernah menjadi pengurus Badan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi

periode 2005-2006 dan 2006-2007, UKF Basket, serta menjadi panitia pada

beberapa kepanitiaan lepas di Fakultas. Penulis juga pernah menjadi asisten dosen

Praktikum Biofarmasetika dan Praktikum Formulasi dan Teknologi Sediaan Steril

pada tahun 2009.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji · menyelesaikan laporan akhir yang berjudul uji...

Documents