DASAR BIOPROSESKINETIKA KEMATIAN MIKROBA DAN TEKNIK STERILISASI MEDIA SECARA BATCH DAN KONTINULAPORANOlehKelompok 6Rizky Sukmariyansyah111411026Teguh Taufiqurohim111411027Ugi Muhammad Apriyanto111411028Wina Puspita Asih111411029Wina Septianawati111411030Kelas 2ADosen Pembimbing: Rintis Manfaati, ST, MT.Tanggal Praktikum: 15 Oktober dan 5 November 2012Tanggal Penyerahan: 12 November 2012

PROGRAM STUDI D3 TEKNIK KIMIAJURUSAN TEKNIK KIMIAPOLITEKNIK NEGERI BANDUNG2012A. TUJUANSetelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan mampu:a. Menguasai teknik sterilisasi media dengan menggunakan panas pada proses batch dan kontinu.b. Memahami pengaruh variasi laju alir dan temperature pada proses sterilisasi batch dan kontinu.c. Menentukan nilai konstanta laju kematian mikroba (Kd), Decimal reduction time atau destruction value (D), dan konstanta Arhenius (Ed) pada proses sterilisasi batch dan kontinu.

B. DASAR TEORILatar BelakangSterilisasi merupakan proses penting yang harus dilalui sebelum bekerja dengan mikroorganisme. Sterilisasi dilakukan pada semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam percobaan, baik peralatan laboratorium maupun medium pertumbuhan mikroba. Melalui sterilisasi, seluruh mikroba pathogen dapat mati, sehingga tidak sempat berkembang biak.Sterilisasi didefinisikan sebagai suatu usaha mengeliminasi semua kehidupan mikroba yang ada pada bahan/produk yang dikehendaki. Proses sterilisasi yang kurang steril hanya akan menghasilkan steril sebagian (partial sterility) yang berarti masih terdapat mikroba yang dapat tumbuh dan berkembang setelah proses sterilisasi dilakukan.Proses sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakab proses fisik atau dengan menggunakan bahan kimia (Suriawiria, 1986). Bahan kimia yang dapat digunakan untuk mematikan mikroba antara lain larutan NaCL 9%, KNO3 10%, HgCl2 0,1%, HCl 1,1%.Proses fisik untuk sterilisasi dilakukan dengan metode pemanasan dan tanpa pemanasan. Metode dengan menggunakan pemanasan meliputi pemanasan kering (dry heat) dan pemanasan basah dengan menggunakan uap air (moist heat). Metode sterilisasi tanpa menggunakan panas meliputi radiasi (UV, X-Ray), Sonicasi, dan Filtrasi.

Landasan Teori1. SterilisasiSterilisasi merupakan salah satu faktor utama dalam fermentasi. Kita tentu mengharapkan tidak terjadi kontaminasi di mana mikroorganisme yang tidak diinginkan tumbuh dan mengganggu proses fermentasi. Teknik sterilisasi berbeda-beda tergantung pada jenis material. Bagian pertama akan menjelaskan secara singkat dan sederhana bagaiman sterilisasi cairan dan padatan.a. Sterilisasi cairanCairan yang disterilisasi umumnya adalah media fermentasi yang mengandung gula, garam fosfat, ammonium, trace metals, vitamin, dan lain-lain. Secara umum ada dua cara sterilisasi cairan yaitu dengan panas dan disaring (filtrasi). Sterilasi dengan panas dilakukan di dalam autoclave, di mana steam tekanan tinggi diinjeksikan ke dalam chamber untuk mencapai temperatur 121 oC dan tekanan tinggi (sekitar 15 psig).Durasinya bervariasi, namun umumnya diinginkan cairan dipertahankan pada 121 oC selama minimal 15 menit. Jika termasuk waktu untuk heating dan cooling steps, total waktu berkisar 1-2 jam tergantung volume cairan yang disterilisasi. Terkadang temperatur bisadiset pada 134 oC (untuk medis).

Laboratory autoclaveUntuk skala industri, cairan disterilisasi dengan panas menggunakan beberapa pilihan teknik. Gambar di bawah menjelaskan salah satu bagan proses sterilisasi cairan media di industri. Banyak jenis proses baik secara batch atau continuous yang diterapkan di industri, misalnya direct steam, indirect heating, indirect steam, dan lainnya.

Sterilisasi medium di industri bioproses. Sumber: Doran, M.P (1995), Bioprocess Engineering Principles, chapter 13, Academic PressCairan dapat disterilisasi juga dengan disaring menggunakan membrane filter berpori 0.22 atau 0.45 micro meter. Metode ini cocok untuk volume cairan yang kecil (1-2 liter) dan bahan kimia yang bisa rusak karena panas misalnya gula dan protein.

b. Sterilisasi padatanPadatan yang umum disterilkan adalah glassware, biosafety cabinet, danbeberapa jenistabung dan kontainer. Pada glassware dan plastik tahan panas umumnya dilakukan denganautoclave mirip seperti sterilisasi cairan namun ditambahproses pengeringan.Biosafetycabinet disterilkan dengan bantuan radiasi UV dan disemprot ethanol 70 %. Udara dalam cabinet disaring dengan filter (detilnya akan dibahas di bagian ke-2 tentang sterilisasi gas).

2. Jenis-Jenis SterilisasiMeski saat ini mikroba telah banyak dimanfaatkan untuk memenuhi kebutuhan manusia, namun seringkali keberadaan mikroba masih dianggap mengganggu, terutama mikroba pathogen. Oleh karenanya, diperlukan upaya untuk mengurangi jumlah mikroba hingga menghilangkannya sama sekali. Untuk tujuan tersebut, dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain: DesinfeksiDesinfeksi merupakan tindakan pengurangan sebagian besar mikroorganisme dari benda mati. Pada proses desinfeksi ini, tidak semua mikroba dapat dihilangkan. PasteurisasiPasteurisasi merupakan upaya untuk menghindari gangguan mikroba tanpa mematikan sporanya. Pasteurisasi dapat dilakukan dengan cara: Pemanasan pada suhu 62oC selama 30 menit, pemanasan 7174oC selama 20 detik, atau pemanasan 8587oC selama 5 detik. SterilisasiSterilisasi merupakan upaya untuk meminimalisasi gangguan mikroorganisme dengan cara menghilangkan seluruhnya (bakteri, jamur, parasit, virus, termasuk bakteri endospora). Sterilisasi menjadi hal yang sangat penting dalam berbagai proses bioteknologi, salah stunya dalam proses fermentasi. Meskipun proses fermentasi melibatkan mikroorganisme, namun seringkali kehadiran mikroorganisme lain (kontaminan) tetap mengganggu. Hal ini karena:1. Medium akan menumbuhkan semua mikroba yang ada (mikroba target dan kontaminan) sehingga produk yang dihasilkan menjadi sangat beragam. Tentu saja hal ini sangat merugikan karena selain mengurangi produktivitas juga menyulitkan dalam proses isolasi.2. Jika proses fermentasi dilanjutkan dalam keadaan banyak kontaminan, maka kemungkinan produk yang dihasilkan oleh kontaminan menjadi lebih dominan dan mendesak produk mikroba target hingga dapat menghilangkannya.3. Kontaminasi pada produk akhir dapat menurunkan kualitas produk, bahkan mungkin dapat membahayakan manusia.4. Kontaminan dapat merusak produk yang diinginkan.5. Kontaminasi dari suatu fermentasi bakteri dengan phage dapat me-lisis kultur.Untuk menghindari halhal tersebut di atas, langkah antisipasi yang dapat dilakukan antara lain dengan:a. Penggunaan inokulum murni dalam fermentasi.b. Sterilisasi medium: merupakan proses yang bertujuan untuk menghilangkan semua jenis makhluq hidup yang ada dalam media, dilakukan sebelum inokulasi kultur.c. Sterilisasi ruang fermenter: Penghilangan semua bentuk makhluq hidup dari ruang fermentor, termasuk udara secara kontinyu.d. Sterilisasi semua bahan yang digunakan dalam keseluruhan proses fermentasie. Penjagaan kondisi aseptis selama fermentasiFermentasi dapat dilakukan baik secara fisika, kimia, maupun radiasi.Sterilisasi secara fisika dapat dilakukan dengan membunuh mikroba atau sekadar mencegah mikroba masuk kesistem kita.Sterilisasi fisik dengan membunuh mikroba dapat dilakukan dengan penggunaan panas, freezing (pembekuan), penggunaan garam berkonsentrasi tinggi, dll.Sementara sterilisasi fisik tanpa membunuh mikroba dapat dilakukan dengan filtrasi. Filtrasi merupakan upaya untuk meminimalisasi kontaminasi mikroorganisme dengan cara menyaring sesuatu dengan filter berukuran tertentu sehingga sebagian mikroba tidak dapat melewatinya. Cara ini tidak membunuh mikroba yang ada, hanya meminimalisasi agar mikroba tidak terbawa.Namun, dalam proses fermentasi, cara sterilisasi fisik yang paling mungkin dilakukan adalah dengan filtrasi dan penggunaan panas, baik panas basah maupun panas kering. Sterilisasi panas basah seringkali digunakan untuk sterilisasi media dan bahanbahan lainnya sementara panas kering untuk sterilisasi alatalat.Faktorfaktor yang mempengaruhi sterilisasi panas antara lain: Jenis dan jumlah kontaminan yang hendak dihilangkan Morfologi mikroorganisme Komposisi media fermentasi pH Ukuran partikel tersuspensi Temperatur yang digunakan Durasi proses sterilisasi Keberadaan air

Sterilisasi panas dapat dilakukan secara batch maupun continue. a. Sterilisasi BatchSterilisasi sistem batch dapat dilakukan dengan cara menginjeksikan uap panas ke dalam mantel fermentor ayau coil yang terdapat pada bagian dalam fermentor. Cara ini disebut metode tidak langsung. Atau dengan cara menghilangkan uap panas langsung ke dalam larutan medium (metode langsung). Metode langsung membutuhkan uap panas murni, yaitu bebas dari bahan kimia tambahan seperti senyawa antikarat yang panyak digunakan dalam proses produksi uap. Di samping itu, metode langsung akan mengakibatkan bertambahnya volume cairan media dalam fermentor karena adanya kondensasi uap yang digunakan.b. Sterilisasi ContinueSite mini memberikan keuntungan berupa minimalnya kemungkinan kerusakan medium tetapi mengkinsumsi banyak energi.Temperature yang dibutuhkan untuk sterilisasi sistem ini adalah 140 oC dengan waktu hanya 30 hingga 120 detik. Alat yang digunakan dapat berupa Continues plate heat exchange dan Continues injection flash cooler. Kelebihan Continues injection flash cooler antara lain: Dapat digunakan untuk media yang mengandung bahan padat tersuspensi Biaya lebih murah Mudah dibersihkan Pemanasan dan pendinginan lebih cepat Penggunaan uap lebih efisienAdapun Kekurangannya antara lain: Dapat terbentuk buih saat pemanasan dan pendinginan Adanya kontak langsung antara media dan uap panas yang murni, yaitu bebas dari bahan anti karat.

3. Kinetika Kematian MikrobaProses panas secara komersial umumnya didesain untuk menginaktifkan mikroorganisme yang ada pada makanan yang dapat mengancam kesehatan manusia dan mengurangi jumlah mikroorganisme pembusuk ke tingkat yang rendah, sehingga peluang terjadinya kebusukan sangat rendah. Dalam desain proses termal, ada dua hal yang harus diketahui, yaitu karakteristirk ketahanan panas mikroba dan profil pindah panas dari medium pemanas ke dalam bahan pada titik terdinginnya. Karakteristik ketahanan panas dinyatakan dengan nilai D dan nilai Z. Untuk mencapai level pengurangan jumlah mikroba yang diinginkan, amaka ditentukan siklus logaritma pengurangan mikroba. Kemudian dihitung nilai sterilitasnya pada suhu tertentu (Fo). Nilai Fo ini ditentukan sebelum proses termal berlangsung. Nilai Fo dapat dihitung pada suhu standar atau pada suhu tertentu, dimana untuk menghitungnya perlu diketahui nilai D dan nilai Z (Kusnandar, 2008).Nilai D menyatakan ketahahanan panas mikroba atau sensitifitas mikroba oleh suhu pemanasan. Nilai D didefinisikan sebagai waktu dalam menit pada suhu tertentu yang diperlukan untuk menurunkan jumlah spora atau sel vegetatif tertentu sebesar 90% atau satu logaritmik. Setiap mikroba memiliki nilai D pada suhu tertentu. Semakin besar nilai D suatu mikroba pada suatu suhu tertentu, maka semakin tinggi ketahahan panas mikroba tersebut pada suhu yang tertentu. Nilai D umumnya dinyatakan pada suhu standar. Untuk bakteri mesofilik atau termofilik umumnya menggunakan suhu standar 121oC, sedangkan untuk sel vegetatif, khamir, atau kapang umumnya menggunakan suhu yang lebih rendah (80-100C). Nilai D pada suhu standar ini sering dituliskan dengan nilai Do (Anonim, 2009).Faktor-faktor yang mempengaruhi efektifitas proses thermal pencapaian kecukupan proses panas sangat dipengaruhi oleh banyak faktor. Oleh karena itu, faktor-faktor yang mempengaruhi proses termal harus dikontrol dengan baik dan dikendalikan. Berdasarkan persyaratan pendaftaran ke FDA, terdapat faktor-faktor kritis yang dapat mempengaruhi proses pemanasan dan sterilisasi, yang dapat berbeda antara satu produk dengan produk lainnya. Di antara faktor-faktor kritis yang perlu diidentifikasi pengaruhnya adalah: (a) karakteristik bahan yang dikalengkan (pH keseimbangan, metode pengasaman, konsistensi/viskositas dari bahan, bentu/ukuran bahan, aktivitas air, persen padatan, rasio padatan/ cairan, perubahan formula, ukuran partikel, jenis pengental, jenis pengawet yang ditambahkan, dan sebagainya), kemasan (jenis dan dimensi, metode pengisian bahan ke dalam kemasan), (b) proses dalam retort (jenis retort, jenis media pemanas, posisi wadah dalam retort, tumpukan wadah, pengaturan kaleng, kemungkinan terjadinya nesting (Anonim c, 2008).Bacillus cereus merupakan bakteri gram-positif, aerobik, batang pembentuk spora, kadang-kadang memperlihatkan reaksi gram-negatif. Bacillus cereus merupakan bakteri fakultatif anaerob dengan ukuran sel-sel vegetatif dalam bentuk rantai. Beberapa galur bersifat psikotropik, dan galur lainnya bersifat mesofilik dan termofilik. Beberapa tidak dapat tumbuh pada makanan dingin yang disimpan panas pada suhu di atas 60C (Anonim, 2009).Escherichia coli atau biasa disingkat E. coli adalah salah satu jenis spesies utama bakterigram negatif.Bakteri ini umumnya hidup pada rentang 20-40C, optimum pada 37C. Pada umumnya, bakteri ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah kesehatan pada manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika.Biasa digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan.E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya (Anonim, 2009).Pseudomonas aeruginosa merupakan patogen utama bagi manusia. Bakteri ini terogolong baketri mesofilik. Bakteri ini kadang-kadang mengkoloni pada manusia dan menimbulkan infeksi apabila fungsi pertahanan inang abnormal. Oleh karena itu, Pseudomonas aeruginosa disebut patogen oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi. Bakteri ini dapat juga tinggal pada manusia yang normal dan berlaku sebagai saprofit pada usus normal dan pada pasien rumah sakit yang menderita kanker, fibrosis kistik dan luka bakar. Bakteri ini adalah jenis bakteri gram negatif aerob obligat, berkapsul, mempunya flagella polar sehingga bakteri ini bersifat motil, berukuran sekitar 0,5-1,0 m. Bakteri ini tidak menghasilkan spora dan tidak dapat memfermentasikan karbohidrat (Anonim, 2010).Jenis dan spesies mikroba berpengaruh terhadap perlakuan panas pada proses sterilisasi. Tabel 2.1 menunjukan ketahanan relative beberapa jenis mikroba terhadap panas yang tinggi. Mikroba yang membentuk spora lebih tahan terhadap pemanasan basah yang paling tinggi jika dibandingkan dengan beberapa jenis mikroba yang lain. Siklus sterilisasi dapat dirancang berdasarkan pemusnahan spora bakteri, sehingga mikroba jenis lain aka mati secar bersamaan. Suhu yang semakin tinggi pada proses sterilisasi maka waktu yang dibutuhkan untuk mematikan spora akan semakin berkurang.Table 2.1 Ketahanan Relative Berbagai Mikroba Terhadap Panas BatchJenis MikrobaKetahanan Relatif Terhadap Panas

Bakteri vegetative dan khamir1

Virus dan bakteriofage1-5

Spora kapang2-10

Spora bakteri3 x 106

Sumber : J.H (ed), 1988, Chemical Engineers Hand Book

Table 2.2 Pengaruh Suhu Dan Waktu Sterilisasi Terhadap Kematian SporaSuhu Sterilisasi (oC)Waktu yang Diperlukan untuk Mematikan Spora (menit)

11630

11818

12112

1258

1322

1380,8

Sumber : J.H (ed), 1988, Chemical Engineers Hand Book

Pengaruh waktu sterilisasi terhadap jumlah spora yang bertahan menunjukan karakteristik yang berbeda-beda. Karakteristik mikroba atau termofilik pada awal proses sterilisasi mengalami peningkatan populasi spora kemudian dengan bertambahnya waktu sterilisasi spora yang hidup semakin berkurang. Panas yang diberikan pada awal proses justru akan meningkatkan populasi mikroba termofil dan setelah temperature pemanasan mencapai temperature yang mengakibbatkan kematian mikroba (lethal temperature), maka secara perlahan jumlah mikroba yang hidup berkurang.Bailey & Ollis, (1986) menyatakan bahwa kematian jumlah mikroba oleh pemanasan dapat mengikuti persamaan linear orde -1.Persamaannya :.(2.1)N= jumlah mikrobaT= waktu pemanasanKd= konstanta laju kematian mikrobaIntegrasi persamaan 2.1 menjadi :.(2.2)N0= jumlah mikroba sebelum pemanasan pada t = 0Nt= jumlah mikroba setelah pemanasan periode tLogaritma normal persamaan 2.2 memberikan korelasi linear terhadap waktu,.(2.3)N0 sering disebut level kontaminasi (jumlah mikroba sebelum pemanasan kontaminasi mikroba sebelum disterilisasi ) dan Nt adalah level sterilisasi.

Dalam proses sterilisasi dikenal istilah decimal reduction time atau destruction value (D) yang didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan dalam menit pada suhu tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10, sehingga persamaan 2.2 dapat dituliskan :.(2.4).(2.5)Nilai konstanta laju kematian mikroba (kd) bergantung pada temperatur, mengikuti persamaan Arhenius: .(2.6).(2.7)Apabila nilai ln kd dialurkan terhadap 1/T maka akan diperoleh sebuah garis lurus gradient Ed/R.

C. ALAT DAN BAHAN1. Sterilisasi BatchAlatBahan

Beker glass 1000 mL 2 buah Water bath Hot plate Tabung reaksi steril 15 buah Thermometer Mikroskop Kaca preparat + cover glass 5 buah Pembakar spiritus Pipet tetes 5 buah Biakan Saccharomyces cerevisiae dalam media cair sukrosa 15% sebanyak 500 ml Methyl Blue Alkohol Es untuk pendingin Aquades

2. Sterilisasi KontinuAlatBahan

Beker glass 1000 mL 2 buah Water bath Hot plate Tabung reaksi steril 12 buah Thermometer Mikroskop Kaca preparat + cover glass 5 buah Coil tembaga Pembakar spiritus Pompa peristaltic Selang Biakan Saccharomyces cerevisiae dalam media cair sukrosa 15% sebanyak 500 ml Methyl Blue Alkohol Es untuk pendingin Aquades

D. PROSEDUR KERJA1. Sterilisasi Batch

2. Sterilisasi KontinuKalibrasi Laju Alir

Penentuan Volume pipa coil

Proses Sterilisasi Kontinyu

E. DATA PENGAMATAN1. Sterilisasi BatchNot(detik)Jumlah sel hidup (XH)Jumlah sel mati (XM)Jumlah sel total (Xtot)

T=52oCT=60oCT=70oCT=52oCT=60oCT=70oCT=52oCT=60oCT=70oC

1t1=20152125697062849187

2t2=402219207785719910491

3t3=6022181885827810710096

4t4=801715158876761059191

5t5=10014141392948310610896

2. Sterilisasi Kontinu

Penentuan volume coil (Vcoil)Diameter Coil= 2,3 mm = 0,023 dmPanjang coil= 650,18 mm = 6,5018 dmVolume Coil = = 1,35 mL Kalibrasi laju alir

No.skala pompa (rpm)Volume (ml)Waktu (s)Laju Alir Q (mL/s)

1.4019300,63

2.5023300,77

3.6029300,90

4.7031301,03

Waktu Tinggal

No.Laju Alir Q (mL/s)Volume Coil (mL)Waktu Tinggal (s)

1.0,631,352,14

2.0,771,351,75

3.0,901,351,50

4.1,031,351,31

Sterilisasi kontinuTemperatur penangas (T) = 47oCNo.skala pompa (rpm)Jumlah sel hidup xHJumlah sel mati xMJumlah sel total xtotal

1.402975104

2.505850108

3.606448112

4.707336109

Temperatur penangas (T) : 59oCNo.skala pompa (rpm)Jumlah sel hidup xHJumlah sel mati xMJumlah sel total xtotal

1.401985104

2.503268100

3.604263105

4.706741108

Temperatur penangas (T) : 70oCNo.% skala pompaJumlah sel hidup xHJumlah sel mati xMJumlah sel total xtotal

1.4076572

2.50145872

3.60215778

4.70345488

F. PENGOLAHAN DATA1. Sterilisasi BatchPerhitungan ln dalam variasi suhu yang berbedaKeterangan :Nt = jumlah sel hidupNo= jumlah sel totalPada Temperatur = 52oCNot(detik)Jumlah Sel Hidup XH (Nt)Jumlah Sel Mati XM (Nt)Jumlah Sel Total Xtot (No)Nt/Noln (Nt/No)

1201569840,18-1,7

2402277990,22-1,5

36022851070,20-1,59

48017881050,16-1,82

510014921060,13-2,02

Dari Kurva ln (Nt/No) terhadap Waktu diperoleh nilai kd (konstanta kematian mikroba) adalah slope dari kurva tersebut.-kd = -0,004 kd = 0,004

Pada Temepratur = 60oCNot(detik)Jumlah Sel Hidup XH (Nt)Jumlah Sel Mati XM (Nt)Jumlah Sel Total Xtot (No)Nt/Noln (Nt/No)

1202170910,23-1,47

24019851040,18-1,7

36018821000,18-1,7

4801576910,16-1,8

510014941080,13-2,04

Dari Kurva ln (Nt/No) terhadap Waktu diperoleh nilai kd (konstanta kematian mikroba) adalah slope dari kurva tersebut.-kd = -0,006kd = 0,006

PadaTemperatur = 70oCNot(detik)Jumlah Sel Hidup XH (Nt)Jumlah Sel Mati XM (Nt)Jumlah Sel Total Xtot (No)Nt/Noln (Nt/No)

1202562870,28-1,25

2402071910,22-1,5

3601878960,19-1,7

4801576910,16-1,8

51001383960,13-1,9

Dari Kurva ln (Nt/No) terhadap Waktu diperoleh nilai kd (konstanta kematian mikroba) adalah slope dari kurva tersebut.-kd = -0,009kd = 0,009

Menghitung nilai Desimal Reduction Time (D)D = [ln 10]/ kdNoSuhu (K)Konstanta Laju Kematian (kd)D1/Tln kd

13250,004575,640,003076-5,521

23330,006383,760,003003-5,116

33430,009255,840,002915-4,710

Dari Kurva ln kd terhadap 1/T diperoleh nilai Ed/R adalah slope dari kurva tersebut.Ed/R = -5022Ed/R = 5022R =8,314 kJ/kg mol K.Ed = 5022 x 8,314Ed = 41752,908 kJ/Kgmol K

2. Sterilisasi KontinuPerhitungan ln dalam variasi suhu yang berbedaKeterangan :Nt = jumlah sel hidupNo= jumlah sel totalTemperatur (T) = 47 oCNo.Waktu Tinggal (s)Jumlah sel hidup xH (Nt)Jumlah sel mati xMJumlah sel total xtotal (No)Nt/Noln (Nt/No)

1.2,1429751040,28-1,27

2.1,7558501080,54-0,62

3.1,5064481120,57-0,56

4.1,3173361090,67-0,40

Dari Kurva ln (Nt/No) terhadap Waktu diperoleh nilai kd (konstanta kematian mikroba) adalah slope dari kurva tersebut.-kd = -1,019kd = 1,019

Temperatur (T) = 59 oCNo.Waktu Tinggal (s)Jumlah sel hidup xH (Nt)Jumlah sel mati xMJumlah sel total xtotal (No)Nt/Noln (Nt/No)

1.2,1419851040,18-1,71

2.1,7532681000,32-1,14

3.1,5042631050,40-0,92

4.1,3167411080,62-0,48

Dari Kurva ln (Nt/No) terhadap Waktu diperoleh nilai kd (konstanta kematian mikroba) adalah slope dari kurva tersebut.-kd = -1,411kd = 1,411Temperatur (T) = 70 oCNo.Waktu Tinggal (s)Jumlah sel hidup xH (Nt)Jumlah sel mati xMJumlah sel total xtotal (No)Nt/Noln (Nt/No)

1.2,14765720,097-2,33

2.1,751458720,19-1,66

3.1,502157780,27-1,31

4.1,313454880,39-0,94

Dari Kurva ln (Nt/No) terhadap Waktu diperoleh nilai kd (konstanta kematian mikroba) adalah slope dari kurva tersebut.-kd = -1,647kd = 1,647

Menghitung nilai Desimal Reduction Time (D)D = [ln 10]/ kdNoSuhu (K)Konstanta Laju Kematian (kd)D1/Tln kd

13201,0192,260,0031250,0188

23321,4111,630,0030120,3443

33431,6471,390,0029150,4989

Dari Kurva ln kd terhadap 1/T diperoleh nilai Ed/R adalah slope dari kurva tersebut.Ed/R = -2302Ed/R = 2302R =8,314 kJ/kgmol K.Ed = 2302 x 8,314Ed = 19138,828 kJ/Kgmol K

G. PEMBAHASAN1. Pembahasan Oleh Rizky SukmariyansyahPada praktikum ini dilakukan teknik sterilisasi secara batch dan kontinyu. Pada praktikum ini pula akan didapatkan kinetika kematian dari masing-masing teknik sterilisasi. Sterilisasi sendiri merupakan proses pengeliminasian semua kehidupan mikroba yang ada pada bahan/produk yang dikehendaki. Proses sterilisasi kali ini menggunakan proses fisik, yaitu dengan cara pemanasan.

1. Teknik sterilisasi secara kontinyuPada proses sterilisasi ini dilakukan variasi suhu operasi dan variasi skala pompa. Pada sterilisasi ini, mikroba yang ada dalam media akan dialirkan melalui coil yang dipanaskan oleh water bath, dan proses sterilisasi akan berlangsung di dalam coil tersebut. Setelah itu media akan masuk ke proses pendinginan. Dalam percobaan didapatkan bahwa semakin tinggi suhu sterilisasinya, maka semakin banyak pula mikroba yang mati. Hal ini dibuktikan dengan meningkatkya konstanta laju kematian mikroba seiring dengan penambahan suhu sterilisasi. NoSuhu (K)Konstanta Laju Kematian (kd)D

13250,004575,64

23330,006383,76

33430,009255,84

2. Teknik sterilisasi secara batchPada proses sterilisasi batch dilakukan variasi waktu dan suhu sterilisasi. Media yang berisi mikroba akan dipanaskan dengan water bath setelah itu dimasukkan ke dalam pendingin secara berkala sesuai dengan variasi waktu yang ditentukan. Pengaruh panas lembap di dalam proses sterilisasi akan mengkoagulasikan protein-protein mikroba (termasuk enzim-enzimnya) dan menginaktifkannya secara searahDari percobaan didapatkan bahwa semakin lama waktu sterilisasi maka semakin banyak mikroba yang mati. Dan semakin tinggi suhu sterilisasi makan akan semakin banyak pula mikroba yang mati. Hal ini dibuktikan dengan meningkatkya konstanta laju kematian mikroba seiring dengan penambahan suhu sterilisasi.

NoSuhu (K)Konstanta Laju Kematian (kd)D

13201,0192,26

23321,4111,63

33431,6471,39

Dalam pengamatan menggunakan mikroskop pada mikroba untuk kedua teknik sterilisasi diatas, dilakukan penambahan methylen blue. Hal ini akan membantu dalam membedakan mikroba yang mati dan mikroba yang hidup. Mikroba yang hidup, tidak akan membiarkan metilen blue masuk kedalam sel nya, sehingga di mikroskop akan terlihat bening. Sedangkan mikroba yang mati, akan terlihat berwarna biru. Hal ini dikarenakan sistem kekebalan mikroba itu sudah mati sehingga metilen blue dengan mudahnya akan masuk ke dalam sel mikroba tersebut.Dari kedua teknik sterilisasi diatas didapat nilai D. Nilai D atau decimal reduction time merupakan jumlah waktu pada suatu suhu tertentu yang diperlukan untuk membunuh 90% populasi mikrobia yang ada. Bila dilihat dari kedua teknik sterilisasi diatas, nilai D semakin kecil seiring dengan semakin besarnya suhu. Hal ini menandakan semakin tinggi suhu maka akan semakin cepat membunuh mikroba tersebut.

2. Pembahasan Oleh Teguh TaufiqurohimPada praktikum ini dilakukan percobaan sterilisasi media secara batch dan kontinu. Dari sterilisasi tersebut dilihat kinetika kematian mikroba pada media dengan melihat mikroba yang mati dan mikroba yang hidup sehingga dapat mengetahui jumlah dari mikroba (No). Dari teknik sterilisasi yang dilakukan (batch dan kontinu) terdapat perbedaan dilihat dari kinetika kematian mikroba dengan jumlah komposisi mikroba yang sama. Mikroba yang digunakan adalah Saccharomyces cerevisiae.1. Sterilisasi Secara BatchSterilisasi secara batch dilakukan dengan mensterilisasi media pada suhu dan pada waktu tertentu. Sterilisasi dilakukan sekali pada suatu water bath dengan suhu 52 oC, 60 oC, dan 70 oC. Waktu yang digunakan pada setiap suhu adalah selisih setiap 20 detik. Kemudian setelah sterilisasi pada suhu dan waktu tertentu dilakukan, media tersebut dimasukkan ke dalam es. Hal ini bertujuan untuk menghentikan proses sterilisasi tersebut.Setelah proses sterilisasi dilakukan, diambil sampel pada setiap media dengan suhu dan waktu tertentu, kemudian diamati mikroba yang hidup dan mikroba yang mati dengan menggunakan mikroskop. Pada media tersebut ditambahkan juga methyl blue yang bertujuan untuk membedakan mikroba yang mati dengan yang hidup. Methyl blue akan masuk kedalam tubuh sel yang telah mati sehingga sel yang mati akan berwarna biru, sedangkan mikroba yang hidup akan tidak berwarna. Dengan menghitung jumlah mikroba yang mati dengan mikroba yang hidup, dapat diketahui jumlah mikroba dari suatu media (No). Idealnya jumlah mikroba dari suatu media pada setiap kondisi adalah sama, terlepas dari jumlah mikroba yang mati dan yang hidup.Dari data yang diperoleh, dapat dibuat kurva antara ln (Nt/No) terhadap waktu (t) untuk menentukan nilai Kd dari setiap variasi suhu. Kd adalah nilai konstanta kematian mikroba pada suhu tertentu. Dari nilai Kd yang diperoleh dapat ditentukan juga nilai decimal reduction time (D). Nilai D adalah waktu yang dibutuhkan dalam menit pada suhu tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10. Dari nilai Kd juga dapat diperoleh nilai dari Ed (Konstanta Arhenius) dengan membuat kurva antara ln Kd terhadap 1/T.Dari data yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi suhu sterilisasi maka semakin banyak mikroba yang mati dan semakin tinggi nilai konstanta kinetika kematian mikroba (Kd). Selain itu semakin lama waktu sterilisasi juga maka semakin banyak mikroba yang mati.2. Sterilisasi Secara KontinuSterilisasi secara kontinu dilakukan dengan mensterilisasi media pada suhu dan pada laju alir tertentu. Sterilisasi dilakukan dengan melewatkan media pada suatu water bath dengan menggunakan coil tembaga dengan suhu 47 oC, 59 oC, dan 70 oC. Laju alir yang digunakan pada setiap suhu adalah 40, 50, 60, dan 70 rpm pada pompa peristaltik. Pompa peristaltik tersebut dikalibrasi sehingga mendapat satuan mL/detik. Kemudian setelah sterilisasi pada suhu dan laju alir tertentu dilakukan, media tersebut dimasukkan ke dalam es. Hal ini bertujuan untuk menghentikan proses sterilisasi tersebut.Setelah proses sterilisasi dilakukan, diambil sampel pada setiap media dengan suhu dan laju alir tertentu, kemudian diamati mikroba yang hidup dan mikroba yang mati dengan menggunakan mikroskop. Pada media tersebut ditambahkan juga methyl blue yang bertujuan untuk membedakan mikroba yang mati dengan yang hidup. Methyl blue akan masuk kedalam tubuh sel yang telah mati sehingga sel yang mati akan berwarna biru, sedangkan mikroba yang hidup akan tidak berwarna. Dengan menghitung jumlah mikroba yang mati dengan mikroba yang hidup, dapat diketahui jumlah mikroba dari suatu media (No). Idealnya jumlah mikroba dari suatu media pada setiap kondisi adalah sama, terlepas dari jumlah mikroba yang mati dan yang hidup.Dari data yang diperoleh, dapat dibuat kurva antara ln (Nt/No) terhadap waktu (t) untuk menentukan nilai Kd dari setiap variasi suhu. Kd adalah nilai konstanta kematian mikroba pada suhu tertentu. Dari nilai Kd yang diperoleh dapat ditentukan juga nilai decimal reduction time (D). Nilai D adalah waktu yang dibutuhkan dalam menit pada suhu tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora sehingga mikroba yang bertahan berkurang menjadi 1/10. Dari nilai Kd juga dapat diperoleh nilai dari Ed (Konstanta Arhenius) dengan membuat kurva antara ln Kd terhadap 1/T.Dari data yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi suhu sterilisasi maka semakin banyak mikroba yang mati dan semakin tinggi nilai konstanta kinetika kematian mikroba (Kd). Selain itu semakin besar laju alir pada saat sterilisasi, maka semakin sedikit mikroba yang mati.

3. Pembahasan Oleh Ugi Muhammad ApriyantoSterilisasi yang dilakukan pada praktikum ini terdiri dari dua metode, yaitu metode sterilisasi secara batch dan metode sterilisasi secara kontinyu. Kedua metode ini sering digunakan untuk proses sterilisasi.Pada proses sterilisasi, praktikan menggunakan larutan sukrosa 15% dalam 500 mL air (sebelumnya disterilisasi dengan autoklaf) dengan biakan Saccharomyces cerevisiae (yang sebelumnya diinkubasikan dalam shake incubator selama 24 jam). Proses sterilisasi ini berjalan ditandai dengan adanya laju kematian mikroba tersebut. Dari proses sterilisasi baik secara batch dan kontinyu, nantinya akan didapatkan nilai konstanta laju kematian mikroba (kd), desimal reduction time atau destruction value (D), dan konstanta Arhenius (Ed). a. Sterilisasi secara batchProses sterilisasi secara batch hanya menggunakan temperatur saat pemanasan ketika sterilisasi. Nilai temperatur yang semakin tinggi akan membuat mikroba yang mati menjadi semakin banyak. Hal tersebut dikarenakan ketahanan mikroba Saccharomyces cerevisiae terhadap panas akan semakin lemah seiring bertambahnya suhu. Ini dibuktikan dengan data pengamatan jumlah mikroba yang mati untuk setiap kenaikan suhu (suhu 52oC, 60 oC, dan 70oC) dengan variasi waktu untuk tiap-tiap suhu yang digunakan adalah 20, 40, 60, 80, dan 100 detik.Untuk dapat menghitung jumlah mikroba pada mikroskop, praktikan memasukkan sampel dari tiap tabung reaksi pada kaca preparat. Satu tetes sampel ditambahkan dengan satu tetes air garam steril dan methylene blue. Air garam steril berfungsi untuk memerangkap mikroba sedangkan methylene blue digunakan untuk mewarnai mikroba sehingga dapat diketahui mana yang hidup dan yang mati. Mikroba yang mati ditandai dengan masuknya methylene blue pada tubuh mikroba, sehingga terlihat berwarna biru atau ungu. Hal ini disebabkan karena tidak adanya aktivitas metabolisme pada mikroba, sehingga memungkinkan masuknya komponen dari luar tubuh mikroba melalui membran tubuhnya yang mati. Sedangkan mikroba yang hidup adalah mikroba yang tidak berwarna, dimana methylene blue tidak masuk pada tubuh mikroba tersebut. Dengan menghubungkan nilai ln (Nt/N0) terhadap waktu, dapat diperoleh konstanta laju kematian mikroba (kd) sebesar 0,004 untuk suhu 52oC, 0,006 untuk suhu 60oC, 0,009 untuk suhu 70oC. Nilai konstanta ini merupakan besarnya tingkat kematian mikroba setelah dilakukan proses sterilisasi. Kurva yang diperoleh untuk menentukan nilai konstanta kematian mikroba memiliki linieritas mendekati 1, kecuali untuk kurva pada suhu 52 oC yaitu 0,556 terjadi penyimpangan. Hal ini disebabkan adanya kemungkinan kesalahan pada perhitungan mikroba yang hidup dan yang mati, sehingga mempengaruhi hasil plot antara antara ln (Nt/No) terhadap waktu Dari sini, didapatkan nilai desimal reduction time atau destruction value (D) sebesar 575,6 untuk suhu 52oC, 383.76 untuk suhu 60oC, dan 255.84 untuk suhu 70oC. Konstanta Arhenius yang didapat pada percobaan adalah sebesar 41752,908.b. Sterilisasi secara kontinyuPada praktikum ini, praktikan menggunakan seperangkat coil yang disambungkan dengan alat pemompa dan media biakan Saccharomyces cerevisiae. Lalu keluaran dari coil (sekitar 2 mL) ditampung pada tabung reaksi untuk setiap laju alir (skala pompa 40, 50, 60, dan 70 rpm) pada tiap rentang suhu 47, 59, dan 70oC Proses sterilisasi secara kontinyu ini sangat dipengaruhi oleh temperatur dan variasi laju alir, sehingga akan mempengaruhi kinetika kematian mikroba untuk Saccharomyces cerevisiae. Pada awal percobaan, praktikan melakukan kalibrasi laju alir secara duplo. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa volume keluaran coil tembaga akan konstan pada laju alir tertentu. Selain itu, praktikan melakukan pengukuran pada diameter dan panjang coil untuk mendapatkan waktu tinggal atau waktu sterilisasi untuk proses ini. Didapat panjang coil sebesar 650,18 mm dan diameter sebesar 2,3 mm, sehingga didapat volume coil sebesar 1,35 mL. Setelah mendapatkan volume keluaran (Saccharomyces cerevisiae pada media biakan sekitar masing-masing 2 mL) pada tabung reaksi, dilakukan perhitungan jumlah mikroba dilakukan dengan menggunakan mikroskop. Yaitu memipet satu tetes sampel dari tiap tabung reaksi pada kaca preparat, lalu ditambahkan satu tetes methylene blue dan air garam steril. Sehingga didapat jumlah mikroba yang hidup dan yang mati.Dengan menghubungkan nilai ln (Nt/N0) terhadap waktu sterilisasi, dapat diperoleh konstanta laju kematian mikroba (kd) sebesar 1.019 untuk suhu 47oC, 1.411 untuk suhu 59oC, 1.647 untuk suhu 70oC. Nilai konstanta ini merupakan besarnya tingkat kematian mikroba setelah dilakukan proses sterilisasi. Kurva yang diperoleh untuk menentukan nilai konstanta kematian mikroba memiliki linieritas mendekati 1. Sehingga tingkat keakuratannya cukup bagus. Dari sini, didapatkan nilai desimal reduction time atau destruction value (D) 2.26 untuk suhu 47oC, 1.63 untuk suhu 59oC, dan 1.39 untuk suhu 70oC. Konstanta Arhenius yang didapat berdasarkan hasil perhitungan adalah sebesar 19138,828.

4. Pembahasan Oleh Wina Puspita AsihPada percobaan kali ini praktikan melakukan dua kali percobaan kinetika kematian mikroba dan teknik sterilisasi media secara kontinyu dan batch.A. Sterilisasi media secara KontinyuMerupakan percobaan pertama praktikan yang dilakukan untuk media biakan Saccharomyces cerevisiae. Media yang digunakan yaitu sukrosa. Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh laju alir dan juga suhu terhadap kematian mikroorganisme. Selain itu untuk menentukan nilai konstanta (kd), Decimal reduction time (D), dan konstanta Arhenius (Ed) pada proses sterilisasi kontinyu oleh sebab itu dilakukan pada variasi laju alir yang diatur % skala pompa dan temperature. Variasi % skala pompa yang digunakan pada setiap pergantian temperature yaitu 40%, 50%, 60%, 70% dan variasi temperature yang digunakan yaitu 50oC, 60oC, 70oC. Dari percobaan tersebut akan diperoleh data jumlah sel yang hidup dan mati dengan mengambil sampel dari setiap tabung reksi yang ditambahkan satu tetes air garam steril dan satu tetes methylen blue yang dilakukan pada mikroskop. Jumlah sel hidup akan terlihat bening sementara pada jumlah sel mati akan terlihat warna biru. itu sebabnya digunakan methylen blue agar terlihat sel mati dan sel hidupnya. Untuk mengetahui konstanta kematian mikroba (kd) pada setiap temperatur dapat diperoleh dari slope antara ln (Nt/No) terhadap . merupakan waktu tinggal media yang diperlukan untuk proses sterilisasi. Decimal reduction time (D) untuk setiap temperature dapat diperoleh dengan pembagian (ln 10)/kd. Nilai Ed dapat diperoleh dari perkalian konstanta gas ideal (R) dengan data slope atau kemiringan kurva ln kd terhadap 1/T.diperoleh data sbb :Temperatur oC

475970

Kd1.0191.4111.647

D2.261.631.39

Ed19138,828 kj/kgmol K

Semakin lama proses sterilisasi dan semakin tinggi temperature sterilisasi maka semakin efektif proses sterilisasi tersebut. Tapi hal ini juga masih bergantung pada karakteristik dari mikroba yang akan dieliminiasi. Karena setiap mikroba memiliki temperature kematian (lethal temperatur) yang berbeda.B. Sterilisasi media secara BatchPada percobaan secara batch ini akan menentukan hal yang sama dengan sterilisasi secara kontinyu. Hanya saja perbedaanya terletak pada proses berlangsungnya percobaan. Kekurangan untuk sterilisasi media secra batch ini terletak pada ketidakakurasian dan ketidak presisian data yang didapat dikarenakan karena ukuran mikroba yang sangat kecil sehingga mempersulit perhitungan.Data yang diperoleh pada percobaan ini adalah :Temperatur oC

526070

Kd0.0040.0060.009

D575.64383.76255.84

Ed41752,908 kj/kgmol K

Semakin lama proses sterilisasi dan semakin tinggi temperature sterilisasi maka semakin efektif proses sterilisasi tersebut. Tapi hal ini juga masih tergantung pada karakteristik dari mikroba yang akan dieliminiasi. Setiap mikroba memiliki temperature kematian (lethal temperatur) yang berbeda.

5. Pembahasan Oleh Wina Septianawati

H. KESIMPULAN

I. DAFTAR PUSTAKA