teori kinetika kematian mikroba dan teknik sterilisasi media secara batch
DESCRIPTION
m;alxTRANSCRIPT
I. PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Sterilisasi dapat didefinisikan sebagai suatu usaha mengeliminasi semua
kehidupan mikroba yang ada pada bahan/produk yang dikehendaki. Proses sterilisasi
yang kurang steril hanya akan menghasilkan steril sebagian (partial sterility) yang
berarti masih terdapat mikroba yang dapat tumbuh dan berkembang setelah proses
sterilisasi dilakukan.
Proses sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakab proses fisik atau dengan
menggunakan bahan kimia (Suriawiria, 1986). Bahan kimia yang dapat digunakan
untuk mematikan mikroba antara lain larutan NaCL 9%, KNO3 10%, HgCl2 0,1%, HCl
1,1%.
Proses fisik untuk sterilisasi dilakukan dengan metode pemanasan dan tanpa
pemanasan. Metode dengan menggunakan pemanasan meliputi pemanasan kering (dry
heat) dan pemanasan basah dengan menggunakan uap air (moist heat). Metode
sterilisasi tanpa menggunakan panas meliputi radiasi (UV, X-Ray), Sonicasi, dan
Filtrasi.
I.2 Tujuan Percobaan
a. Menguasai teknik sterilisasi media dengan menggunakan panas pada proses batch
dan continous.
b. Memahami pengaruh temperature terhadap kematian mikroba.
c. Menentukan nilai konstanta laju kematian mikroba (Kd), Decimal reduction time
atau destruction value (D), dan konstanta Arhenius (Ed) pada proses sterilisasi.
II. LANDASAN TEORIII.1 Sterilisasi
Sterilisasi merupakan salah satu faktor utama dalam fermentasi. Kita tentu
mengharapkan tidak terjadi kontaminasi di mana mikroorganisme yang tidak diinginkan
tumbuh dan mengganggu proses fermentasi. Teknik sterilisasi berbeda-beda tergantung
pada jenis material. Bagian pertama akan menjelaskan secara singkat dan sederhana
bagaiman sterilisasi cairan dan padatan.
a. Sterilisasi cairan
Cairan yang disterilisasi umumnya adalah media fermentasi yang mengandung
gula, garam fosfat, ammonium, trace metals, vitamin, dan lain-lain. Secara umum ada
dua cara sterilisasi cairan yaitu dengan panas dan disaring (filtrasi). Sterilasi dengan
panas dilakukan di dalam autoclave, di mana steam tekanan tinggi diinjeksikan ke
dalam chamber untuk mencapai temperatur 121 oC dan tekanan tinggi (sekitar 15 psig).
Durasinya bervariasi, namun umumnya diinginkan cairan dipertahankan pada 121 oC
selama minimal 15 menit. Jika termasuk waktu untuk heating dan cooling steps, total
waktu berkisar 1-2 jam tergantung volume cairan yang disterilisasi. Terkadang
temperatur bisa diset pada 134 oC (untuk medis).
Laboratory autoclave
Untuk skala industri, cairan disterilisasi dengan panas menggunakan beberapa
pilihan teknik. Gambar di bawah menjelaskan salah satu bagan proses sterilisasi cairan
media di industri. Banyak jenis proses baik secara batch atau continuous yang
diterapkan di industri, misalnya direct steam, indirect heating, indirect steam, dan
lainnya.
Sterilisasi medium di industri bioproses.
Sumber: Doran, M.P (1995), Bioprocess
Engineering Principles, chapter 13,
Academic Press
Cairan dapat disterilisasi juga dengan disaring menggunakan membrane filter
berpori 0.22 atau 0.45 micro meter. Metode ini cocok untuk volume cairan yang kecil
(1-2 liter) dan bahan kimia yang bisa rusak karena panas misalnya gula dan protein.
b. Sterilisasi padatan
Padatan yang umum disterilkan adalah glassware, biosafety cabinet, dan beberapa
jenis tabung dan kontainer. Pada glassware dan plastik tahan panas umumnya dilakukan
dengan autoclave mirip seperti sterilisasi cairan namun ditambah proses
pengeringan. Biosafety cabinet disterilkan dengan bantuan radiasi UV dan disemprot
ethanol 70 %. Udara dalam cabinet disaring dengan filter (detilnya akan dibahas di
bagian ke-2 tentang sterilisasi gas).
II.2 Jenis-Jenis SterilisasiMeski saat ini mikroba telah banyak dimanfaatkan untuk memenuhi kebutuhan
manusia, namun seringkali keberadaan mikroba masih dianggap mengganggu, terutama
mikroba pathogen. Oleh karenanya, diperlukan upaya untuk mengurangi jumlah
mikroba hingga menghilangkannya sama sekali. Untuk tujuan tersebut, dapat dilakukan
dengan beberapa cara, antara lain:
Desinfeksi
Desinfeksi merupakan tindakan pengurangan sebagian besar mikroorganisme dari
benda mati. Pada proses desinfeksi ini, tidak semua mikroba dapat dihilangkan.
Pasteurisasi
Pasteurisasi merupakan upaya untuk menghindari gangguan mikroba tanpa
mematikan sporanya. Pasteurisasi dapat dilakukan dengan cara: Pemanasan pada
suhu 62oC selama 30 menit, pemanasan 71–74oC selama 20 detik, atau pemanasan
85–87oC selama 5 detik.
Sterilisasi
Sterilisasi merupakan upaya untuk meminimalisasi gangguan mikroorganisme
dengan cara menghilangkan “seluruhnya” (bakteri, jamur, parasit, virus, termasuk
bakteri endospora). Sterilisasi menjadi hal yang sangat penting dalam berbagai
proses bioteknologi, salah stunya dalam proses fermentasi. Meskipun proses
fermentasi melibatkan mikroorganisme, namun seringkali kehadiran
mikroorganisme lain (kontaminan) tetap mengganggu. Hal ini karena:
1. Medium akan menumbuhkan semua mikroba yang ada (mikroba target dan
kontaminan) sehingga produk yang dihasilkan menjadi sangat beragam. Tentu
saja hal ini sangat merugikan karena selain mengurangi produktivitas juga
menyulitkan dalam proses isolasi.
2. Jika proses fermentasi dilanjutkan dalam keadaan banyak kontaminan, maka
kemungkinan produk yang dihasilkan oleh kontaminan menjadi lebih dominan
dan mendesak produk mikroba target hingga dapat menghilangkannya.
3. Kontaminasi pada produk akhir dapat menurunkan kualitas produk, bahkan
mungkin dapat membahayakan manusia.
4. Kontaminan dapat merusak produk yang diinginkan.
5. Kontaminasi dari suatu fermentasi bakteri dengan “phage” dapat me-lisis kultur.
Untuk menghindari hal–hal tersebut di atas, langkah antisipasi yang dapat
dilakukan antara lain dengan :
a. Penggunaan inokulum murni dalam fermentasi.
b. Sterilisasi medium: merupakan proses yang bertujuan untuk menghilangkan
semua jenis makhluk hidup yang ada dalam media, dilakukan sebelum
inokulasi kultur.
c. Sterilisasi ruang fermenter: Penghilangan semua bentuk makhluq hidup dari
ruang fermentor, termasuk udara secara kontinyu.
d. Sterilisasi semua bahan yang digunakan dalam keseluruhan proses fermentasi
e. Penjagaan kondisi aseptis selama fermentasi.
Fermentasi dapat dilakukan baik secara fisika, kimia, maupun radiasi.
Sterilisasi secara fisika dapat dilakukan dengan membunuh mikroba atau sekadar
mencegah mikroba masuk kesistem kita. Sterilisasi fisik dengan membunuh
mikroba dapat dilakukan dengan penggunaan panas, freezing (pembekuan),
penggunaan garam berkonsentrasi tinggi, dll. Sementara sterilisasi fisik tanpa
membunuh mikroba dapat dilakukan dengan filtrasi. Filtrasi merupakan upaya
untuk meminimalisasi kontaminasi mikroorganisme dengan cara menyaring sesuatu
dengan filter berukuran tertentu sehingga sebagian mikroba tidak dapat
melewatinya. Cara ini tidak membunuh mikroba yang ada, hanya meminimalisasi
agar mikroba tidak terbawa.
Namun, dalam proses fermentasi, cara sterilisasi fisik yang paling mungkin
dilakukan adalah dengan filtrasi dan penggunaan panas, baik panas basah maupun
panas kering. Sterilisasi panas basah seringkali digunakan untuk sterilisasi media
dan bahan–bahan lainnya sementara panas kering untuk sterilisasi alat–alat. Faktor–
faktor yang mempengaruhi sterilisasi panas antara lain :
Jenis dan jumlah kontaminan yang hendak dihilangkan
Morfologi mikroorganisme
Komposisi media fermentasi
pH
Ukuran partikel tersuspensi
Temperatur yang digunakan
Durasi proses sterilisasi
Keberadaan air
Sterilisasi panas dapat dilakukan secara batch maupun continue.
a. Sterilisasi Batch
Sterilisasi sistem batch dapat dilakukan dengan cara menginjeksikan uap panas
ke dalam mantel fermentor ayau coil yang terdapat pada bagian dalam
fermentor. Cara ini disebut metode tidak langsung. Atau dengan cara
menghilangkan uap panas langsung ke dalam larutan medium (metode
langsung). Metode langsung membutuhkan uap panas murni, yaitu bebas dari
bahan kimia tambahan seperti senyawa antikarat yang panyak digunakan dalam
proses produksi uap. Di samping itu, metode langsung akan mengakibatkan
bertambahnya volume cairan media dalam fermentor karena adanya kondensasi
uap yang digunakan.
II.3 Kinetika Kematian MikrobaProses panas secara komersial umumnya didesain untuk menginaktifkan
mikroorganisme yang ada pada makanan yang dapat mengancam kesehatan manusia
dan mengurangi jumlah mikroorganisme pembusuk ke tingkat yang rendah, sehingga
peluang terjadinya kebusukan sangat rendah. Dalam desain proses termal, ada dua hal
yang harus diketahui, yaitu karakteristirk ketahanan panas mikroba dan profil pindah
panas dari medium pemanas ke dalam bahan pada titik terdinginnya. Karakteristik
ketahanan panas dinyatakan dengan nilai D dan nilai Z. Untuk mencapai level
pengurangan jumlah mikroba yang diinginkan, amaka ditentukan siklus logaritma
pengurangan mikroba. Kemudian dihitung nilai sterilitasnya pada suhu tertentu (Fo).
Nilai Fo ini ditentukan sebelum proses termal berlangsung. Nilai Fo dapat dihitung
pada suhu standar atau pada suhu tertentu, dimana untuk menghitungnya perlu
diketahui nilai D dan nilai Z (Kusnandar, 2008).
Nilai D menyatakan ketahahanan panas mikroba atau sensitifitas mikroba oleh
suhu pemanasan. Nilai D didefinisikan sebagai waktu dalam menit pada suhu tertentu
yang diperlukan untuk menurunkan jumlah spora atau sel vegetatif tertentu sebesar
90% atau satu logaritmik. Setiap mikroba memiliki nilai D pada suhu tertentu. Semakin
besar nilai D suatu mikroba pada suatu suhu tertentu, maka semakin tinggi ketahahan
panas mikroba tersebut pada suhu yang tertentu. Nilai D umumnya dinyatakan pada
suhu standar. Untuk bakteri mesofilik atau termofilik umumnya menggunakan suhu
standar 121oC, sedangkan untuk sel vegetatif, khamir, atau kapang umumnya
menggunakan suhu yang lebih rendah (80-100°C). Nilai D pada suhu standar ini sering
dituliskan dengan nilai Do (Anonim, 2009).
Faktor-faktor yang mempengaruhi efektifitas proses thermal pencapaian
kecukupan proses panas sangat dipengaruhi oleh banyak faktor. Oleh karena itu, faktor-
faktor yang mempengaruhi proses termal harus dikontrol dengan baik dan
dikendalikan. Berdasarkan persyaratan pendaftaran ke FDA, terdapat faktor-faktor
kritis yang dapat mempengaruhi proses pemanasan dan sterilisasi, yang dapat berbeda
antara satu produk dengan produk lainnya. Di antara faktor-faktor kritis yang perlu
diidentifikasi pengaruhnya adalah: (a) karakteristik bahan yang dikalengkan (pH
keseimbangan, metode pengasaman, konsistensi/viskositas dari bahan, bentu/ukuran
bahan, aktivitas air, persen padatan, rasio padatan/ cairan, perubahan formula, ukuran
partikel, jenis pengental, jenis pengawet yang ditambahkan, dan sebagainya), kemasan
(jenis dan dimensi, metode pengisian bahan ke dalam kemasan), (b) proses dalam retort
(jenis retort, jenis media pemanas, posisi wadah dalam retort, tumpukan wadah,
pengaturan kaleng, kemungkinan terjadinya nesting (Anonim c, 2008).
Bacillus cereus merupakan bakteri gram-positif, aerobik, batang pembentuk
spora, kadang-kadang memperlihatkan reaksi gram-negatif. Bacillus cereus merupakan
bakteri fakultatif anaerob dengan ukuran sel-sel vegetatif dalam bentuk rantai.
Beberapa galur bersifat psikotropik, dan galur lainnya bersifat mesofilik dan termofilik.
Beberapa tidak dapat tumbuh pada makanan dingin yang disimpan panas pada suhu di
atas 60ºC (Anonim, 2009).
Escherichia coli atau biasa disingkat E. coli adalah salah satu jenis spesies utama
bakteri gram negatif. Bakteri ini umumnya hidup pada rentang 20-40°C, optimum pada
37°C. Pada umumnya, bakteri ini hidup pada tinja, dan dapat menyebabkan masalah
kesehatan pada manusia, seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. E.
coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan sebagai
vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E.
coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya
(Anonim, 2009).
Pseudomonas aeruginosa merupakan patogen utama bagi manusia. Bakteri ini
terogolong baketri mesofilik. Bakteri ini kadang-kadang mengkoloni pada manusia dan
menimbulkan infeksi apabila fungsi pertahanan inang abnormal. Oleh karena itu,
Pseudomonas aeruginosa disebut patogen oportunistik, yaitu memanfaatkan kerusakan
pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu infeksi. Bakteri ini dapat juga
tinggal pada manusia yang normal dan berlaku sebagai saprofit pada usus normal dan
pada pasien rumah sakit yang menderita kanker, fibrosis kistik dan luka bakar. Bakteri
ini adalah jenis bakteri gram negatif aerob obligat, berkapsul, mempunya flagella polar
sehingga bakteri ini bersifat motil, berukuran sekitar 0,5-1,0 µm. Bakteri ini tidak
menghasilkan spora dan tidak dapat memfermentasikan karbohidrat (Anonim, 2010).
Jenis dan spesies mikroba berpengaruh terhadap perlakuan panas pada proses
sterilisasi. Tabel 2.1 menunjukan ketahanan relative beberapa jenis mikroba terhadap
panas yang tinggi. Mikroba yang membentuk spora lebih tahan terhadap pemanasan
basah yang paling tinggi jika dibandingkan dengan beberapa jenis mikroba yang lain.
Siklus sterilisasi dapat dirancang berdasarkan pemusnahan spora bakteri, sehingga
mikroba jenis lain aka mati secar bersamaan. Suhu yang semakin tinggi pada proses
sterilisasi maka waktu yang dibutuhkan untuk mematikan spora akan semakin
berkurang.
Table 2.1 Ketahanan Relative Berbagai Mikroba Terhadap Panas Batch
Jenis Mikroba Ketahanan Relatif Terhadap Panas
Bakteri vegetative dan khamir 1
Virus dan bakteriofage 1-5
Spora kapang 2-10
Spora bakteri 3 x 106
Sumber : J.H (ed), 1988, Chemical Engineers’ Hand Book
Table 2.2 Pengaruh Suhu Dan Waktu Sterilisasi Terhadap Kematian Spora
Suhu Sterilisasi (oC)
Waktu yang Diperlukan untuk Mematikan Spora (menit)
116 30
118 18
121 12
125 8
132 2
138 0,8Sumber : J.H (ed), 1988, Chemical Engineers’ Hand Book
Pengaruh waktu sterilisasi terhadap jumlah spora yang bertahan menunjukan
karakteristik yang berbeda-beda. Karakteristik mikroba atau termofilik pada awal
proses sterilisasi mengalami peningkatan populasi spora kemudian dengan
bertambahnya waktu sterilisasi spora yang hidup semakin berkurang. Panas yang
diberikan pada awal proses justru akan meningkatkan populasi mikroba termofil dan
setelah temperature pemanasan mencapai temperature yang mengakibbatkan kematian
mikroba (lethal temperature), maka secara perlahan jumlah mikroba yang hidup
berkurang.
Bailey & Ollis, (1986) menyatakan bahwa kematian jumlah mikroba oleh
pemanasan dapat mengikuti persamaan linear orde -1 :
Persamaannya : −dN
dt=kd N …….(2.1)
N = jumlah mikroba
T = waktu pemanasan
Kd = konstanta laju kematian mikroba
Integrasi persamaan 2.1
NtN 0
=e−kt…….(2.2)
N0 = jumlah mikroba sebelum pemanasan pada t = 0
Nt = jumlah mikroba setelah pemanasan periode t
Logaritma normal persamaan 2.2 memberikan korelasi linear terhadap waktu,
lnNtN0
=−k d t …….(2.3)
N0 sering disebut level kontaminasi (jumlah mikroba sebelum pemanasan
kontaminasi mikroba sebelum disterilisasi ) dan Nt adalah level sterilisasi.
Grafik ln(Nt/No) terhadap waktu pada berbagai temperatur sterilisasi untuk
spora dari Bacillus stearothermophilus dan sel vegetatif E.coli.. Grafik tersebut
menunjukkan tipe laju kematian.
Dalam proses sterilisasi dikenal istilah decimal reduction time atau destruction
value (D) yang didefinisikan sebagai waktu yang dibutuhkan dalam menit pada suhu
tertentu untuk mengurangi jumlah sel vegetative atau spora sehingga mikroba yang
bertahan berkurang menjadi 1/10, sehingga persamaan 2.2 dapat dituliskan :
NtN 0
=e−kD…….(2.4)
D= ln10k
…….(2.5)
Nilai konstanta laju kematian mikroba (kd) bergantung pada temperatur,
mengikuti persamaan Arhenius:
kd=kd 0e−Ed
RT …….(2.6)
ln k d= ln kd 0−EdR
1T
…….(2.7)
Apabila nilai ln kd dialurkan terhadap 1/T maka akan diperoleh sebuah garis
lurus gradient – Ed/R.
III. Prosedur Percobaan
3.1. Bahan yang digunakan
- Larutan GYEA 700 mL
- Fermipan
- Methylen Blue
- Alkohol
- Es batu
3.2. Alat yang digunakan
- Beker glass 1000 mL 1 buah
- water bath
- Hot plate
- Tabung reaksi steril
- Termometer
- Mikroskop
- kaca preparat + cover glass
- Coil tembaga
- Pembakar Spirtus
- Pompa peristaltik
- Pipet tetes
- Pipet ukur 10 mL
3.3. Langkah Kegiatan Sterilisasi Continuous
a. Kalibrasi Laju Alir
1. Menyusun rangkaian alat untuk sterilisasi continious
2. Melakukan kalibrasi skala pompa peristaltik terhadap nilai laju alir
media
3. Atur skala pompa pada nilai 60%
4. Menyalakan pompa peristaltik
5. Menampung cairan yang dipompa dalam gelas ukur 100 mL dalam
waktu 1 menit
6. Mengulangi langkah 3-5 untuk skala pompa 70%, 80% dan 90%
B. Penentuan Volume Pipet Coil
1. Mengukur diameter coil menggunakan jangka sorong
2. Mengukur panjang coil yang terendam dalam air panas
3. Menghitung volume coil yang terendam
C. Proses Sterilisasi Continuous
1. Memenaskan water bath pada temperatur 460C
2. Mengatur laju alir biakan dalam media cair pada laju 60 %, media
dalam aliran keluar ditampung dalam tabung reaksi steril setelah
melampaui waktu tinggaldalam pipa, jumlah sel hidup dan mati yang
keluar
3. Mengulangi proses sterilisasi pada temperatur 520C dan 580C dan
pada laju 70%, 80% dan 90%
3.4 Langkah Percobaan Sterilisasi Batch
a. Sterilisasi Batch
1. Memindahkan biakan dalam media cair ke dalam 13 tabung reaksi
masing-masing 10 mL dengan menggunakan pipet steril
2. Memanaskan media dalam tabung reaksi di dalam water bath selama 5
menit pada temperatur 500C kemudian memasukan ke dalam beker yang
berisi es batu
3. Menenteskan mikroba pada kaca preparat sampel dari tabung langkah 2,
menambahkan methylen blue dan mengamati jumlah sel yang hidup dan
yang mati
4. Mengulangi langkah 2-3 untuk waktu pemanasan 10 menit, 15 menit dan
20 menit
5. Mengulangi langkah 2-3 untuk temperatur pemanasan
IV. Tabel Data Pengamatan
Kinematika Kematiam Mikroba Dan Teknik Sterilisasi Media Seacara Batch
IV.1 Sterilisasi Batrch
Temperatur Penangas (T2) = 500C
No t-detik ∑XH (sel hidup) ∑ Xm (sel mati) ∑Xtot ( sel total)
1 300
2 600
3 900
4 1200
Temperatur Penangas (T2) = 0C
No t-detik ∑XH (sel hidup) ∑ Xm (sel mati) ∑Xtot ( sel total)
1 300
2 600
3 900
4 1200
Temperatur Penangas (T3) = 0C
No t-detik ∑XH (sel hidup) ∑ Xm (sel mati) ∑Xtot ( sel total)
1 300
2 600
3 900
4 1200
Kinematika Kematian Mikroba dan Teknik Sterilisasi Media Secara Continuous
IV.2 Penentuan Volume coil
Diameter Coil :
Panjang Coil :
Volume Coil :
IV.3 Kalibrasi Laju Alir
%Skala Pompa Volume (mL) Waktu (detik)
60% 60 detik
70% 60 detik
80% 60 detik
90% 60 detik
IV.4 Sterilisasi Continuous
Temperatur Penangas (T1) = 460C
No % skala ∑XH (sel hidup) ∑ Xm (sel mati) ∑Xtot ( sel total)
1 60%
2 70%
3 80%
4 90% 186 70 256
Temperatur Penangas (T2) = 520C
No % skala ∑XH (sel hidup) ∑ Xm (sel mati) ∑Xtot ( sel total)
1 60% 152 77 229
2 70% 144 80 224
3 80% 237 101 338
4 90% 123 63 186
Temperatur Penangas (T3) = 580C
No % skala ∑XH (sel hidup) ∑ Xm (sel mati) ∑Xtot ( sel total)
1 60% 299 47 342
2 70% 237 56 293
3 80% 157 23 180
4 90% 135 30 165
V. Pengolahan Data