LAPORAN PRATIKUM

KIMIA BAHAN ALAM II

ISOLASI SENYAWA METABOLIT

BATANG PULAI ( ALSTONIA SCHOLARIS )

Oleh :

KELOMPOK 3B (GENAP)

SANDRY EKA SAPUTRI

NOVITA DEWI

RIZKA PRATIWI

SHOFIATUL

TITIS SULASTI NINGSIH

SARI KURNIA SISKA

YENLY FEBRISYAH

RATIH KUSUMA

Pembimbing:

Dosen : Dr. Emrizal,Msi.,Apt

Asisten :

LABORATURIUM KIMIA BAHAN ALAM

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU

PEKANBARU JANUARI 2014

1

BAB I

PENDAHULUAN

Pulai (Alstonia sp) banyak manfaatnya untuk pengobatan. Terutama dari kulit dan

daunnya. Hal ini disebabkan karena banyak kandungan kimia dari kulit dan daun Pulai yang

antara lain Kulit kayunya mengandung alkaloida ditanin, ekitamin (ditamin), ekitanin,

ekitamidin, alstonin, ekiserin, ekitin, ekitein, porfirin dan triperpen. Daun mengandung

pikrinin. Bunga Pulai mengandung asam ursolat dan lupeol.

Dasar hal inilah pulai mulai diteliti lagi untuk didapatkan senyawa-senyawa yang

bermanfaat untuk dasar yang senyawa secara farkologis, efek terapi dan toksisitasnya.

Langkah awal pertama sebelum melakukan idetifikasi senyawa metabolit sekunder

pada tumbuhan yang akan diteliti yang ada didalamnya, secara umum hal pertama yang harus

dilakukan adalah menentukan golongan senyawa metabolit sekunder, kemudian baru

menentukan jenis senyawanya.golongan metabolit sekunder biasanya dapat ditentukan

dengan uji pendahuluan seperti uji warna, penentuan kelarutan, harga Rf atau berdasarkan ciri

spektrum UV-nya.

Identifikasi senyawa batang Pulai berlaku dengan cara mulai mengekstrak dengan

mengunakan pelarut yang universal yaitu metanol atau etanol, dilakukan pemisahan in vacuo

dan fraksinasi sesuai dengan kepolarannya dengan pelarut yang sesuai, melakukan

Kromotografi Lapis Tipis (KLT) pada fraksi tersebut setelah didapat dilakukan fraksinasi dan

mecari fraksinasi kolom yang terpilih dan terakhir melakukan pemurnian senyawa isolasi.

2

BAB II

PELAKSANAAN KERJA

2.1. Tujuan Pratikum

Tujuan dari proses ekstraksi ini adalah untuk mengetahui prinsip-prinsip ekstraksi dan

sekaligus untuk mengekstrak kandungan senyawa kimia yang terdapat dalam sampel

tumbuhan.

Mengeteahui prinsip-prinsip pemisahan dengan penurunan tekanan dan sekaligus

mengentalkan ekstrak cair sampel hasil proses ekstraksi

Memahami prinsip-prinsip dalam pelaksanaan proses fraksinasi ekstrak kental yang

betujuan untuk menyederhanankan komponen-komponen senywa kimia yang terdapat

dalam ekstrak berdasarkan tingkat kepolaran pelarut

Mengetahui pemakaian kromatografi lapisan tipis untuk pemisahan komponen –

komponen dalam senyawa atau campuran.

Mencari harga Rf dari beberapa komponen pada sistem fasa diam dan fasa gerak.

Untuk mengetahui fasa gerak (eluen) yang cocok dan bagus untuk memisahkan

komponen – komponen dalam suatu senyawa atau campuran.

Memisahkan dan mengidentifikasi senywa kimia dari fraksi yang memberikan pola

KLT yang baik pada percobaan sebelumnya dengan kromotografi kolom

Memahami dan mendeteksi hasil pemisahan dari teknik kromotografi kolom yang

berdasarkan pada perbedaan kepolaran pelarut

Memahami bagaiman cara pemurnian senyawa kimia dari bahan alam, terutama

setelah dilakukan pemisahan secara kromotografi kolom

2.2. Tinjauan Pustaka

A. Pulai (Alstonia sp)

Pulai (Alstonia sp) memiliki sekitar 40 – 60 species yang tersebar di daratan tropika

dan sub tropika Afrika, Amerika Tengah, Asia Bagian Selatan, Polynesia dan New South

Wales, Quensland dan Australia Bagian Utara, serta beberapa species di daratan Malaisyia.

Klasifikasi dari Pulai (Alstonia sp) adalah sebagai berikut :

3

Divisio : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Ordo : Gentianales

Family : Apocynaceae

Genus : Alstonia

Dari banyaknya jenis Pulai (Alstonia sp) yang berjumlah sekitar 40 – 60 tersebut

diantaranya A. macrophylla, A. angustiloba, A. angustifolia, A. spatulata, A. elliptica, A.

oblongifolia, A. pneumatophora, A. scholaris, A. costaca dan lain-lain. Namun demikian

hanya akan dijelaskan beberapa jenis saja karena keterbatasan data dan literatur yang

diperoleh. Jenis atau species yang akan dijelaskan adalah Alstonia pneumatophora, Alstonia

spatulata, dan Alstonia scholaris.

Alstonia pneumatophora Back. Ex don Berger

Nama daerah dari Alstonia pneumatophora secara umum adalah Pulai Putih. Tumbuhan

ini tersebar biasanya di hutan rawa gambut, dengan kondisi tanah berpasir dekat dengan

pantai, hutan rawa, serta dekat dengan sungai besar.Untuk daerah di wilayah Sumatera

biasanya disebut dengan Basung. Pulai dari jenis ini penyebarannya banyak dijumpai di

Sumatera, Sulawesi, dan Kalimantan.

Manfaat/Kegunaan Kayu komersial yang disebut dengan kayu pulai ini cocok untuk : Ukiran,

pembuatan peti, kayu lapis. Sedangkan getahnya bisa digunakan sebagai obat penyakit kulit

dan kulitnya sendiri mengandung alkaloid untuk obat.

Alstonia spatulata Blume

Jenis dari tumbuhan ini memiliki nama padanan Alstonia cuneata Wallich ex G. Don.,

Alstonia cochinchinensis Piere ex Pitard. Secara umum nama daerah dari jenis ini adalah

Lame Bodas. Sedangkan kalau di Sumatera namanya biasa disebut dengan Pulai Gabus. Pulai

jenis ini tumbuh di daerah rawa atau tergenang air, di tepi aliran sungai, pada gley humus

atau aluvial yang kaya pasir. Umumnya tumbuh dibawah 300 m dpl. Sering ditemukan pada

hutan sekunder atau vegetasi semak belukar. Penyebarannya di Sumatera, Bangka, Jawa

Barat, dan Kalimantan.

4

Manfaat/Kegunaan dari kayu jenis Alstonia spatulata ini sama dengan jenis Alstonia

pneumatophora yaitu untuk peti, papan tulis, kayu lapis, ukiran, pensil, dan perkakas rumah

tangga.

Alstonia scholaris (L.) R. Br.

Memiliki nama sinonim dengan Echites scholaris L., Echites pala Ham.,

Tabernaemontana alternitifolia Burn. Toleran terhadap berbagai macam tanah dan habitat,

dijumpai sebagai tanaman kecil yang tumbuh di atas karang atau bagian tajuk dari hutan

primer dan sekunder. Banyak dijumpai di dataran rendah/pesisir dengan curah hujan tahunan

1000-3800 mm. Juga dijumpai pada ketinggian diatas 1000 m dpl. Salah satu sifat adalah

dapat tumbuh di atas tanah dangkal. Tidak tumbuhya tanaman ini pada sebaran alami yang

suhunya kurang dari 8ºC, yang menunjukkan jenis ini tidak tahan udara dingin. Nama

daerahnya secara umum adalah Pulai Gading. Tersebar luas di Asia Pasifik mulai India dan

Sri Lanka sampai daratan Asia Tenggara dan China Selatan, seluruh Malaysia hingga

Australia Utara dan Kepulauan Solomon. Di Indonesia sendiri tersebar luas terutama

Sumatera, Kalimantan dan Jawa Barat.

Manfaat/Kegunaan Kayunya tidak awet, hanya memungkinkan untuk konstuksi ringan di

dalam ruangan, atau untuk industri pulp dan kertas, serta digunakan terutama untuk papan

tulis sekolah, sehingga dinamakan scholaris.

Selain itu, sebenarnya pohon Pulai ini banyak manfaatnya untuk pengobatan. Terutama

dari kulit dan daunnya. Hal ini disebabkan karena banyak kandungan kimia dari kulit dan

daun Pulai yang antara lain :

Kulit kayu : mengandung alkaloida ditanin, ekitamin (ditamin), ekitanin, ekitamidin,

alstonin, ekiserin, ekitin, ekitein, porfirin dan triperpen.Daun : mengandung pikrinin. Sedang-

kan bunga Pulai mengandung asam ursolat dan lupeol.Kulit kayu dapat untuk mengatasi :

Demam, malaria, limpa membesar, batuk berdahak, diare, disentri, kurang nafsu makan, perut

kembung, sakit perut, kolik, kencing manis, tenakan darah tinggi, wasir, anemia, gangguan

haid, rematik akut. Daun dapat untuk mengatasi : Borok, bisul, perempuan setelah melahirkan

(nifas), beri-beri dan payudara bengkak karena bendungan ASI.

5

B. Ekstraksi Bahan Alam

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat aktif dari bagian tanaman obat. Adapun tujuan dari

ekstraksi yaitu untuk menarik komponen kimia yang terdapat dalam simplisia.

Tujuan ekstraksi adalah untuk menarik semua komponen kimia yang terdapat dalam

simplisia. Ekstraksi ini didasarkan pada perpindahanmassakomponen zat padat ke dalam

pelarut dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka, kemudian berdifusi masuk

ke dalam pelarut.

Secara umum, terdapat empat situasi dalam menentukan tujuan ekstraksi:

a. Senyawa kimia telah diketahui identitasnya untuk diekstraksi dari organisme. Dalam

kasus ini, prosedur yang telah dipublikasikan dapat diikuti dan dibuat modifikasi yang

sesuai untuk mengembangkan proses atau menyesuaikan dengan kebutuhan pemakai.

b. Bahan diperiksa untuk menemukan kelompok senyawa kimia tertentu, misalnya

alkaloid, flavanoid atau saponin, meskipun struktur kimia sebetulnya dari senyawa ini

bahkan keberadaannya belum diketahui. Dalam situasi seperti ini, metode umum yang

dapat digunakan untuk senyawa kimia yang diminati dapat diperoleh dari pustaka. Hal

ini diikuti dengan uji kimia atau kromatografik yang sesuai untuk kelompok senyawa

kimia tertentu.

c. Organisme (tanaman atau hewan) digunakan dalam pengobatan tradisional, dan

biasanya dibuat dengan cara, misalnya Tradisional Chinese medicine (TCM) seringkali

membutuhkan herba yang dididihkan dalam air dan dekok dalam air untuk diberikan

sebagai obat. Proses ini harus ditiru sedekat mungkin jika ekstrak akan melalui kajian

ilmiah biologi atau kimia lebih lanjut, khususnya jika tujuannya untuk memvalidasi

penggunaan obat tradisional.

d. Sifat senyawa yang akan diisolasi belum ditentukan sebelumnya dengan cara apapun.

Situasi ini (utamanya dalam program skrining) dapat timbul jika tujuannya adalah

untuk menguji organisme, baik yang dipilih secara acak atau didasarkan pada

penggunaan tradisional untuk mengetahui adanya senyawa dengan aktivitas biologi

khusus.

6

Proses pengekstraksian komponen kimia dalam sel tanaman yaitu pelarut organik akan

menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif

akan larut dalam pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar sel

dan proses ini akan berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat

aktif di dalam dan di luar sel.

Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu zat berdasarkan

perbedaan kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang

berbeda, biasanya air dan yang lainnya pelarut organik.

Proses ekstraksi dapat berlangsung pada:

Ekstraksi parfum, untuk mendapatkan komponen dari bahan yang

wangi.

Ekstraksi cair-cair atau dikenal juga dengan nama ekstraksi solven.

Ekstraksi jenis ini merupakan proses yang umum digunakan dalam

skala laboratorium maupun skala industri.

Leaching, adalah proses pemisahan kimia yang bertujuan untuk

memisahkan suatu senyawa kimia dari matriks padatan ke dalam

cairan.

Penyiapan bahan yang akan diekstrak dan plarut Selektivitas Pelarat

hanya boleh melarutkan ekstrak yang diinginkan, bukan komponen-

komponen lain dari bahan ekstraksi. Dalam praktik,terutama pada

ekstraksi bahan-bahan alami, sering juga bahan lain (misalnya lemak,

resin) ikut dibebaskan bersama-sama dengan ekstrak yang diinginkan.

Dalam hal itu larutan ekstrak tercemar yang diperoleh harus dibersihkan,

yaitu misalnya diekstraksi lagi dengan menggunakan pelarut kedua.

Kelarutan Pelarut sedapat mungkin memiliki kemampuan melarutkan

ekstrak yang besar (kebutuhan pelarut lebih sedikit). Kemampuan tidak

saling bercampur Pada ekstraksi cair-cair, pelarut tidak boleh (atau hanya

secara terbatas) larut dalam bahan ekstraksi. Kerapatan Terutama pada

ekstraksi cair-cair, sedapat mungkin terdapat perbedaan kerapatan yang

besar antara pelarut dan bahan ekstraksi. Hal ini dimaksudkan agar kedua

fase dapat dengan mudah dipisahkan kembali setelah pencampuran

7

(pemisahan dengan gaya berat). Bila beda kerapatannya kecil, seringkali

pemisahan harus dilakukan dengan menggunakan gaya sentrifugal

(misalnya dalam ekstraktor sentrifugal). Reaktivitas Pada umumnya

pelarut tidak boleh menyebabkan perubahan secara kimia pada

komponenkornponen bahan ekstarksi. Sebaliknya, dalam hal-hal tertentu

diperlukan adanya reaksi kimia (misalnya pembentukan garam) untuk

mendapatkan selektivitas yang tinggi. Seringkali Ekstraksi juga disertai

dengan reaksi kimia. Dalam hal ini bahan yang akan dipisahkan mutlak

harus berada dalam bentuk larutan. Titik didih Karena ekstrak dan pelarut

biasanya harus dipisahkan dengan cara penguapan, destilasi atau

rektifikasi, maka titik didit kedua bahan itu tidak boleh terlalu dekat, dan

keduanya tidak membentuk ascotrop.Ditinjau dari segi ekonomi, akan

menguntungkan jika pada proses ekstraksi titik didih pelarut tidak terlalu

tinggi (seperti juga halnya dengan panas penguapan yang rendah).

Syarat pelarut yang digunakan :

Selektif

Stabil secara fisik dan kimia

Ekonomis

Keamanan

Ramah lingkungan

Cairan pelarut dalam pembuatan ekstrak adalah pelarut yang optimal

untuk senyawa kandungan berkhasiat atau yang aktif, dengan demikian

senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa

kandungan lainnya. Ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa

kandungan yang diinginkan.

Metode Ekstraksi

a) Maserasi

Maserasi merupakan cara penyarian sederhana yang dilakukan dengan cara merendam

serbuk simplisia dalam cairan penyari selama beberapa hari pada temperatur kamar dan

terlindung dari cahaya.

8

Metode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung komonen

kimia yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, tiraks dan lilin.

Keuntungan dari metode ini adalah peralatannya sederhana. Sedang kerugiannya

antara lain waktu yang diperlukan untuk mengekstraksi sampel cukup lama, cairan penyari

yang digunakan lebih banyak, tidak dapat digunakan untuk bahan-bahan yang mempunyai

tekstur keras seperti benzoin, tiraks dan lilin.

Metode maserasi dapat dilakukan dengan modifikasi sebagai berikut :

• Modifikasi maserasi melingkar

• Modifikasi maserasi digesti

• Modifikasi Maserasi Melingkar Bertingkat

• Modifikasi remaserasi

• Modifikasi dengan mesin pengaduk

Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam

cairan penyari yang sesuai selama tiga hari pada temperatur kamar terlindung dari cahaya,

cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena

adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang

konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan

konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut berulang sampai terjadi

keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selama proses

maserasi dilakukan pengadukan dan penggantian cairan penyari setiap hari. Endapan yang

diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan.

b) Prinsip Perkolasi

Perkolasi adalah cara penyarian dengan mengalirkan penyari melalui serbuk simplisia

yang telah dibasahi.Keuntungan metode ini adalah tidak memerlukan langkah tambahan

yaitu sampel padat (marc) telah terpisah dari ekstrak. Kerugiannya adalah kontak antara

sampel padat tidak merata atau terbatas dibandingkan dengan metode refluks, dan pelarut

menjadi dingin selama proses perkolasi sehingga tidak melarutkan komponen secara

efisien.

9

Penyarian zat aktif yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia dimaserasi selama 3

jam, kemudian simplisia dipindahkan ke dalam bejana silinder yang bagian bawahnya

diberi sekat berpori, cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui simplisia tersebut,

cairan penyari akan melarutkan zat aktif dalam sel-sel simplisia yang dilalui sampai

keadan jenuh. Gerakan ke bawah disebabkan oleh karena gravitasi, kohesi, dan berat

cairan di atas dikurangi gaya kapiler yang menahan gerakan ke bawah. Perkolat yang

diperoleh dikumpulkan, lalu dipekatkan.

c) Prinsip Soxhletasi

Sokletasi adalah suatu metode / proses pemisahan suatu komponen yang terdapat

dalam zat padat dengan cara penyaringan berulang-ulang dengan menggunakan pelarut

tertentu, sehingga semua komponen yang diinginkan akan terisolasi.

Pengambilan suatu senyawa organik dari suatu bahan alam padat disebut ekstraksi.

Jika senyawa organik yang terdapat dalam bahan padat tersebut dalam jumlah kecil, maka

teknik isolasi yang digunakan tidak dapat secara maserasi, melainkan dengan teknik lain

dimana pelarut yang digunakan harus selalu dalam keadaan panas sehingga diharapkan

dapat mengisolasi senyawa organik itu lebih efesien. Isolasi semacam itu disebut sokletasi.

Adapun prinsip sokletasi ini adalah penyaringan yang berulang ulang sehingga hasil

yang didapat sempurna dan pelarut yang digunakan relatif sedikit. Bila penyaringan ini

telah selesai, maka pelarutnya diuapkan kembali dan sisanya adalah zat yang tersari.

Metode sokletasi menggunakan suatu pelarut yang mudah menguap dan dapat melarutkan

senyawa organik yang terdapat pada bahan tersebut, tapi tidak melarutkan zat padat yang

tidak diinginkan.

Metoda sokletasi seakan merupakan penggabungan antara metoda maserasi dan

perkolasi. Jika pada metoda pemisahan minyak astiri ( distilasi uap ), tidak dapat

digunakan dengan baik karena persentase senyawa yang akan digunakan atau yang akan

diisolasi cukup kecil atau tidak didapatkan pelarut yang diinginkan untuk maserasi

ataupun perkolasi ini, maka cara yang terbaik yang didapatkan untuk pemisahan ini adalah

sokletasi.

10

Sokletasi digunakan pada pelarut organik tertentu. Dengan cara pemanasan, sehingga

uap yang timbul setelah dingin secara kontunyu akan membasahi sampel, secara teratur

pelarut tersebut dimasukkan kembali kedalam labu dengan membawa senyawa kimia yang

akan diisolasi tersebut. Pelarut yang telah membawa senyawa kimia pada labu distilasi

yang diuapkan dengan rotary evaporator sehingga pelarut tersebut dapat diangkat lagi bila

suatu campuran organik berbentuk cair atau padat ditemui pada suatu zat padat, maka

dapat diekstrak dengan menggunakan pelarut yang diinginkan. Syarat syarat pelarut yang

digunakan dalam proses sokletasi :

1. Pelarut yang mudah menguap

Contoh : heksan, eter, petroleum eter, metil klorida dan alkohol

2. Titik didih pelarut rendah.

3. Pelarut tidak melarutkan senyawa yang diinginkan.

4. Pelarut terbaik untuk bahan yang akan diekstraksi.

5. Pelarut tersebut akan terpisah dengan cepat setelah pengocokan.

6. Sifat sesuai dengan senyawa yang akan diisolasi, polar atau nonpolar.

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan secara berurutan pelarut – pelarut organik

dengan kepolaran yang semakin menigkat. Dimulai dengan pelarut heksana, eter,

petroleum eter, atau kloroform untuk memisahkan senyawa – senyawa trepenoid dan lipid

– lipid, kemudian dilanjutkan dengan alkohol dan etil asetat untuk memisahkan senyawa –

senyawa yang lebih polar. Walaupun demikian, cara ini seringkali tidak. menghasilkan

pemisahan yang sempurna dari senyawa – senyawa yang diekstraksi.

Cara menghentikan sokletasi adalah dengan menghentikan pemanasan yang sedang

berlangsung. Sebagai catatan, sampel yang digunakan dalam sokletasi harus dihindarkan

dari sinar matahari langsung. Jika sampai terkena sinar matahari, senyawa dalam sampel

akan berfotosintesis hingga terjadi penguraian atau dekomposisi. Hal ini akan

menimbulkan senyawa baru yang disebut senyawa artefak, hingga dikatakan sampel tidak

alami lagi.

Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia ditempatkan

dalam klonsong yang telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa, cairan penyari

dipanaskan dalam labu alas bulat sehingga menguap dan dikondensasikan oleh kondensor

bola menjadi molekul-molekul cairan penyari yang jatuh ke dalam klonsong menyari zat

11

aktif di dalam simplisia dan jika cairan penyari telah mencapai permukaan sifon, seluruh

cairan akan turun kembali ke labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi.

Ekstraksi sempurna ditandai bila cairan di sifon tidak berwarna, tidak tampak noda jika di

KLT, atau sirkulasi telah mencapai 20-25 kali. Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan

dipekatkan.

Dibanding dengan metode destilasi, metoda sokletasi ini lebih efisien karena pelarut

organik dapat menarik senyawa organik dalam bahan alam secara berulang kali, waktu yang

digunakan lebih efisien dan pelarut lebih sedikit dibandingkan dengan metoda maserasi atau

perkolasi.Sokletasi dihentikan apabila :

Pelarut yang digunakan tidak berwarna lagi.

Sampel yang diletakkan diatas kaca arloji tidak menimbulkan bercak lagi.

Hasil sokletasi di uji dengan pelarut tidak mengalami perubahan yang spesifik.

Keunggulan dan Kelemahan Sokletasi

Sampel diekstraksi dengan sempurna karena dilakukan berulang ulang.

Jumlah pelarut yang digunakan sedikit.

Proses sokletasi berlangsung cepat.

Jumlah sampel yang diperlukan sedikit.

Pelarut organik dapat mengambil senyawa organik berulang kali.

Kelemahan sokletasi

12

Tidak baik dipakai untuk mengekstraksi bahan bahan tumbuhan yang mudah rusak

atau senyawa senyawa yang tidak tahan panas karena akan terjadi penguraian.

Harus dilakukan identifikasi setelah penyarian, dengan menggunakan pereaksi meyer,

Na, wagner, dan reagen reagen lainnya.

Pelarut yang digunakan mempunyai titik didih rendah, sehingga mudah menguap

(Anonim, 2011).

d) Prinsip Refluks

Penarikan komponen kimia yang dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke dalam

labu alas bulat bersama-sama dengan cairan penyari lalu dipanaskan, uap-uap cairan

penyari terkondensasi pada kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan penyari yang

akan turun kembali menuju labu alas bulat, akan menyari kembali sampel yang berada

pada labu alas bulat, demikian seterusnya berlangsung secara berkesinambungan sampai

penyarian sempurna, penggantian pelarut dilakukan sebanyak 3 kali setiap 3-4 jam. Filtrat

yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan.

Keuntungan dari metode ini adalah digunakan untuk mengekstraksi sampel-sampel

yang mempunyai tekstur kasar dan tahan pemanasan langsung. Kerugiannya adalah

membutuhkan volume total pelarut yang besar dan sejumlah manipulasi dari operator.

e) Prinsip Destilasi Uap Air

Penyarian minyak menguap dengan cara simplisia dan air ditempatkan dalam labu

berbeda. Air dipanaskan dan akan menguap, uap air akan masuk ke dalam labu sampel

sambil mengekstraksi minyak menguap yang terdapat dalam simplisia, uap air dan minyak

menguap yang telah terekstraksi menuju kondensor dan akan terkondensasi, lalu akan

melewati pipa alonga, campuran air dan minyak menguap akan masuk ke dalam corong

pisah, dan akan memisah antara air dan minyak atsiri.

Destilasi uap adalah metode yang popular untuk ekstraksi minyak-minyak menguap

(esensial) dari sampel tanaman. Metode destilasi uap air diperuntukkan untuk menyari

simplisia yang mengandung minyak menguap atau mengandung komponen kimia yang

mempunyai titik didih tinggi pada tekanan udara normal.

f) Prinsip Rotavapor

13

Proses pemisahan ekstrak dari cairan penyarinya dengan pemanasan yang

dipercepatoleh putaran dari labu alas bulat, cairan penyari dapat menguap 5-10º C di

bawah titik didih pelarutnya disebabkan oleh karena adanya penurunan tekanan. Dengan

bantuan pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap naik ke kondensor dan

mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut murni yang ditampung

dalam labu alas bulat penampung.

g) Prinsip Ekstraksi Cair-Cair

Ekstraksi cair-cair (corong pisah) merupakan pemisahan komponen kimia di antara 2

fase pelarut yang tidak saling bercampur di mana sebagian komponen larut pada fase

pertama dan sebagian larut pada fase kedua, lalu kedua fase yang mengandung zat

terdispersi dikocok, lalu didiamkan sampai terjadi pemisahan sempurna dan terbentuk dua

lapisan fase cair, dan komponen kimia akan terpisah ke dalam kedua fase tersebut sesuai

dengan tingkat kepolarannya dengan perbandingan konsentrasi yang tetap.

h) Prinsip Kromatografi Lapis Tipis

Pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi, yang ditentukan

oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen), komponen kimia bergerak naik

mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben terhadap komponen-komponen kimia

tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda

berdasarkan tingkat kepolarannya, hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan.

i) Prinsip Penampakan Noda

a. Pada UV 254 nm

Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak

berwarna gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya

interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng.

14

Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh

komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat

energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan

energi.

b. Pada UV 366 nm

Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap.

Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara

sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda

tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan

oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke

tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil

melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang

karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.

c. Pereaksi Semprot H2SO4 10%

Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H2SO4 10% adalah berdasarkan

kemampuan asam sulfat yang bersifat reduktor dalam merusak gugus kromofor dari

zat aktif simplisia sehingga panjang gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih

panjang (UV menjadi VIS) sehingga noda menjadi tampak oleh mata.

C. Proses Pemisahan in vacuo

Beberapa teknik pemekatan ekstrak cair ini ada beberapa cara namun mempunyai

prinsip yang sama yaitu dengan pemisahan antara pelarut dengan senyawa yang telah ditarik

kedalamnya. Teknik yang paling umum digunakan adalah teknik penguapan. Namun,

umumnya pelarut yang digunakan mempunyai titik didih yang cukup tinggi sehingga ada

kemungkinan rusaknya senyawa-senyawa yang termolabil disebabkan oleh adanya panas.

Untuk menghindari hal ini terjadi, maka penguapan dilakukan dengan teknik vakum yang

dapat menurunkan titik ddih pelarut beberapa derajat dibawah titik ddh normalnya.

Proses pemisahan ekstrak dari cairan penyarinya dengan pemanasan yang dipercepat dapat

dilakukan dengan cara menurunkan tekanan udara didalam alat penguapan atau oleh putaran

15

dari labu alas bulat. Teknik ini dapat mengakibatkan cairan penyari dapat menguap 5-10 c

dibawah titik didih normal pelarutnyadisebabkan oleh karena adanya penurunan tekanan. Hal

ini sesuai dengan hukum kekekalan gas yaitu PV=n RT. Dalam hal ini tekanan berbanding

lurus dengan suhu. Dengan bantuan pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap naik

ke kondensor dan mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut murn yang

ditampung dalam labu alas bulat penampung.

Teknik pemisahan dengan penurunan tekanan ini dapat dilakukan dengan dua cara yaitu

dengan menggunakan destilasi vakum atau dengan menggunakan alat rotary evaporator

(rotavor).

Evaporasi secara umum dapat didefinisikan dalam dua kondisi, yaitu: (1) evaporasiyang

berarti proses penguapan yang terjadi secara alami (2) evaporasi yang dimaknaidengan proses

penguapan yang timbul akibat diberikan uap panas (steam) dalamsuatu peralatan. Evaporasi

dapat diartikan sebagai proses penguapan daripada liquid(cairan) dengan penambahan panas

atau dapat juga didefinisikan sebagai evaporasiadalah peristiwa menguapnya pelarut dari

campuran yang terdiri atas zat terlarutyang tidak mudah menguap dan pelarut yang mudah

menguap. Dalam kebanyakanproses evaporasi, pelarutnya adalah air. Tujuan dari evaporasi

adalah memekatkankonsentrasi larutan sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi yang

lebihtinggi. . Panas dapat disuplai dengan berbagai cara, diantaranya secara alami

danpenambahan steam. Evaporasi diadasarkan pada proses pendidihan secara intensifyaitu

(1) pemberian panas ke dalam cairan, (2) pembentukan gelembung-gelembung(bubbles)

akibat uap, (3) pemisahan uap dari cairan, dan (4) mengkondensasikanuapnya. Evaporasi atau

penguapan juga dapat didefinisikan sebagai perpindahankalor ke dalam zat cair mendidih.

Evaporasi dilaksanakan dengan cara menguapkansebagian dari pelarut pada titik didihnya,

sehingga diperoleh larutan zat cair pekatyang konsentrasinya lebih tinggi. Uap yang terbentuk

pada evaporasi biasanya hanyaterdiri dari satu komponen, dan jika uapnya berupa campuran

umumnya tidakdiadakan usaha untuk memisahkan komponenkomponennya.Dalam evaporasi

zatcair pekat merupakan produk yang dipentingkan, sedangkan uapnya

biasanyadikondensasikan dan dibuang.Disinilah letak perbedaan antara evaporasi dan

distilasi.Perlu diperhatikan, bahwa penguapan dapat terjadi karena adanyapemanasan

menggunakan hot plate yang dibantu dengan penurunan tekanan padalabu alas bulat

“sampel” yang dipercepat dengan pemutaran pada labu alas bulat“sampel”. Dengan bantuan

pompa vakum yang mengalirkan air dingin (es) dari suatuwadah kedalam kondensor dan

dikeluarkan lagi oleh kondensor kepada wadahnyalagi dan dimasukkan lagi dan seterusnya,

16

karena proses ini berjalan secara kontinyu.sehingga ketika uap dari pelarut mengenai dinding-

dinding kondensor, maka pelarutini akan mengalami yang proses yg dinamakan proses

kondensasi, yaitu proses yangmengalami perubahan fasa dari fasa gas ke fasa cair. Adapun

demikian, prosespenguapan ini dilakukan hingga diperoleh pelarut yang sudah tidak menetes

lagipada labu alas bulat penampung dan juga bisa dilihat dengan semakin kentalnya zatyang

ada pada labu alas bulat sampel dan terbentuk gelembung-gelembung pecahpada permukaan

zatnya

Faktor-faktor yang mempengaruhi proses evaporasi :

1. Temperatur steam, disesuaikan dengan bahan yang akan dievaporasi karenabahan yang

tidak tahan suhu yang tinggi tentunya akan membentuk kerak padakolom evaporator

sehingga akan mempengaruhi perpindahan panas dari steam kebahan tersebut.

2. Tekanan operasi, mempengaruhi proses penguapan pelarut disampingtemperatur.

3. Laju alir umpan, bila laju alir umpan terlalu kecil proses kurang effisien dan jugabila

terlalu besar,sehingga untuk suatu proses laju alir umpan diusahakan adalah lajuyang dapat

menghasilkan proses yang optimal.

4. Sifat fisik dan kimia umpan.

5. Luas permukaan kontak antara umpan dan media pemanas (panjang dan jumlah

tube).

6. Laju alir steam

7. Laju air pendingin (kondenser).

Salah satu alat yang sering digunakan dari berbagai evaporator yaitu Rotaryevaporator

diamana alat ini merupakan alat yang biasa digunakan di laboratoriumkimia untuk

mengefisienkan dan mempercepat pemisahan pelarut dari suatu larutan.

Alat ini menggunakan prinsip vakum destilasi, sehingga tekanan akan menurun danpelarut

akan menguap dibawah titik didihnya alat ini bekerja seperti alat destilasi.Pemanasan pada

alat ini menggunakan penangas air yang dibantu dengan rotavaporakan memutar labu yang

berisi sampel oleh rotavapor sehingga pemanasan akanlebih merata. Selain itu, penurunan

tekanan diberikan ketika labu yang berisi sampeldiputar menyebabkan penguapan lebih

17

cepat.Dengan adanya pemutaran labu makapenguapan pun menjadi lebih cepat terjadi.

Pompa vakum digunakan untukmenguapkan larutan agar naik ke kondensor yang selanjutnya

akan diubah kembalike dalam bentuk cair.

Labu disimpan dalam labu alas bulat dengan volume 2/3 bagian dari volume labualas bulat

yang digunakan setelah itu waterbath dipanaskan dan mengusahakansuhu yang digunakan

dalam pemanasan disesuaikan dengan suhu pelarut yangdigunakan.Setelah suhu tercapai,

labu alas bulat dipasang dengan kuat pada ujungrotor yang menghubungkan dengan

kondensor.Aliran air pendingin dan pompavakum dijalankan, kemudian tombol rotar diputar

dengan kecepatan yang diinginkan.

Cara Penyimpanan

Rotary evaporator biasanya disimpan di laboratorium instrumen.Sebaiknya rotaryevaporator

disimpan di meja atau tempat yang permanen untuk menghindari adanyaguncangan yang

dapat merusak alat.Selain itu, rotary evaporator lebih baik disimpandi tempat yang tidak

terlalu panas atau tidak terlalu lembap.

Cara Perawatan

Perawatan rotary evaporator terdapat bermacam-macam.Perawatan pada pendinginyaitu air

yg digunakan air aquabides untuk mencegah kerusakan pendingin akibatterjadinya perkaratan

pada bagian dalam alat.Aquabides tersebut juga harus digantisecara berkala, misalnya jika

sering digunakan diganti setiap 2 minggu sekali.

Perawatan pada alat gelas sama seperti peralatan gelas yang lain, yaitu disimpandalam

keadaan yang bersih dan kering disimpan di tempat yang memiliki temperature ruangan.

Penangas air dirawat dengan cara mengganti air secara berkala, misalnyajika sering

digunakan dua kali dlam seminggu. Selain itu, ada baiknya setiap alatyang memiliki saklar

tersendiri. Penangas air untuk saklar penangas air, pendinginuntuk saklar pendingin, begitu

juga seterusnya.

B. Bagian-bagian alat beserta fungsinya

Adapun bagian-bagian dari alat yang digunakan dalam proses rotaryevaporator yaitu sebagai

berikut

a. Water bath

18

Water bath merupakan alat yang berfungsi untuk memanaskan sampel dengan suhuyang

dapat diatur sesuai kebutuhan. Dalam water bath terdapat bagian-bagian Yaitutampilan alat

yang berfungsi untuk

1. Yaitu Layar penampil suhu

2. Tombol Up/Down untuk menaik turunkan suhu

3. Tombol untuk mengatur suhu

Dalam hal ini juga ada hot plate yaitu alat yang digunakan untuk memanaskan

waterbeath.

b. Kondensor

Kondensor merupakan alat yang digunakan untuk mendinginkan uap pelarut yangtelah

menguap. Dalam hal ini kondensor yang digunakan berbentuk spiral agar uappelarut dapat

dikondensasikan dan proses kondensasi berjalan dengan lancar. Didalam kondensor juga

terdapat selang-selang kecil yang berfungsi sebagai tempatmengalir keluar uap gas yang tidak

dapat terkondensasikan atau sering disebut gasliar/gas buang.

Kondensor juga memiliki lubang yang berfungsi sebagai tempat keluar masuknya airdari

mesin pendingin seperti terlihat pada gambar d ibawah ini

c. Mesin pendingin

Mesin pendingin berfungsi sebagai alat yang digunakan untuk mendinginkan airyang akan

dipompakan ke kondensor. Di atas alat ini terdapat dua selang yangberfungsi sebagai tempat

masuk dan keluarnya air dari mesin pendingin kekondensor seperti terlihat pada gambar di

bawah ini

d. Pompa vakum

Pompa vakum yaitu alat yang digunakan untuk mengatur tekanan dalam labu,sehingga

mempermudah penguapan sampel.

C. Cara pengoperasian alat evaporator

Cara menggunakan alat ini harus sesuai dengan prosedur yang ada dimana langkahyang

pertama yaitu :

19

1. Menghidupkan alat, semua kabel disambungkan ke dalam saklar masing-masing.Pertama

pendingin dihidupkan dengan menekan tombol On/Off untuk power danOn/Off untuk vakum,

ditunggu beberapa saat hingga temperatur menunjukkantemperatur standar yaitu 25 C.

Temperatur kemudian diatur dengan cara menekantombol set kemudian mengatur suhu sesuai

dengan yang diinginkan denganmenekan tombol Up/Down.

2. Setelah suhu diatur, pasanglah labu sampel pada rotor penggerak dan labudestilat. Untuk

memudahkan dalam melepas labu dioleskan vaselin pada bagianpenghubung kedua benda,

digunakan juga klip untuk memperkuat sambungan.Penangas air dinyalakan dengan menekan

tombol On/Off dan suhu diatur denganmenekan tombol set dan Up/Down untuk mengatur

suhunya sesuai dengan yangdiinginkan. Rotavapor dinyalakan dengan menekan tombol

On/Off dan kecepatanberputarnya diatur sesuai keinginan dengan memutar knop

pemutar.Kemudian,pompa vakum dinyalakan.Begitu pula untuk cara mematikan alat ini

langkah-langkah yang dilakukan yaituharus berurutan sesuai prosedur.

1. matikan pompa vakum dengan menekan tombol On/Off. Setelah itu, matikanpenangas air

dengan perlahan-lahan menurunkan suhu penangas air secarabertahap.

2. matikan rotavapor dengan menurunkan kecepatannya hingga rotor berhentiberputar.

3. matikan pendingin dengan mengenbalikan suhu pendingin kembali ke suhustandar

kemudian matikan dengan menekan tombol On/Off untuk power dan On/Offuntuk pompa.

Biarkan semua sampel yang telah dipisahkan turun ke dalam labudestilat.Kemudian labu

destilat dan labu yang berisi sampel dilepaskan darisambungan dengan kondensor.

D. Fraksinasi

Fraksinasi adalah proses pemisahan suatu kuantitas tertentu dari campuran (padat,

cair, terlarut, suspensi atau isotop) dibagi dalam beberapa jumlah kecil (fraksi) komposisi

perubahan menurut kelandaian. Pembagian atau pemisahan ini didasarkan pada bobot dari

tiap fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada paling dasar sedang fraksi yang lebih ringan

akan berada diatas. Fraksinasi bertingkat biasanya menggunakan pelarut organik seperti eter,

aseton, benzena, etanol, diklorometana, atau campuran pelarut tersebut. Asam lemak, asam

20

resin, lilin, tanin, dan zat warna adalah bahan yang penting dan dapat diekstraksi dengan

pelarut organik (Adijuwana dan Nur 1989).

Fraksinasi bertingkat umumnya diawali dengan pelarut yang kurang polar dan

dilanjutkan dengan pelarut yang lebih polar. Tingkat polaritas pelarut dapat ditentukan dari

nilai konstanta dielektrik pelarut. Empat tahapan fraksinasi bertingkat dengan menggunakan 

empat macam pelarut yaitu:

1. Fraksinasi n-heksan

2. Fraksinasi etil asetat

3. Fraksinasi butanol

4. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS EKSTRAK & FRAKSI

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan

perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya

akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan

menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen

campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan

komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. ( Imam Haqiqi,

Sohibul,2008 )

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa

menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi

juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun

cuplikannya.

KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik

seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.

KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang

diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi

senyawa murni skala kecil. ( Anggraeni, Megawati,2009 )

Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi. Pemilihan

teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan

dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi

21

cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase

diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-

komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. ( Anggraeni, Megawati,2009 )

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau

alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel

silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis

seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra

violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini

biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau

pemisahan dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning.

a) Kromatogram

Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan warna yang

merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.

Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis :

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes

pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada

garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan

menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk /

tinta ikut naik ke atas.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan pada sebuah gelas

kimia bertutup berisa pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan

bahwa batas pelarut berada dibawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk

menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia

terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia

biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh

dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda

dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak dari

perbedaan bercak warna.

22

b) Perhitungan nilai Rf

Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh

dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul.

Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh

oleh bercak warna masing-masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas

kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses

penguapan.

Pengukuran berlangsung sebagai berikut :

Nilai Rf untuk setiap warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh

dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul.

Pengukuran ini didasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang

ditempuh oleh bercak warna masing-masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas

kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses

penguapan.Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut :

Rf =Jarak yang ditempuholeh komponen

Jarak yangditempuh oleh pelarut

c) Mengidentifikasi senyawa-senyawa

Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawanya.Caranya: Setetes

campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil

yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping

tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam

pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M

dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5.

E. KROMATOGRAFI KOLOM

23

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan

distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase

diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi

penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik

ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography).

Fasa diam:

Berupa adsorben yang tidak boleh larut Dalam fasa gerak, ukuran partikel fasa diam

harus seragam.

Contoh: alumunium, silicagel, arang, bauksit, magnesium karbonat, talk, pati, dan selulosa.

Fasagerak:

Dapat berupa pelarut tunggal atau Campuran beberapa pelarut dengan komposisi

tertentu. Pelarut dapat merupakan pelarut polar dan Pelarut nonpolar.

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan

menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut.

Keempat teknik kromatografi itu adalah :

Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (KGC)

dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan dan

keatsirian senyawa yang akan dipisah. KKt dapat digunakan terutama bagi kandungan

tumbuhan yang mudah larut dalam air (karbohidrat, asam amino dan senyawa fenolat), KLT

merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang larut lipid (lipid, steroid,

karotenoid, kinon sederhana dan klorofil), KGC penggunannya terutama untuk senyawa atsiri

(asam lemak, mono- dan seskuiterpen, hidrokarbon dan senyawa belerang), cara lain yaitu

KCKT, dapat memisahkan kandungan yang keatsiriannya kecil. KCKT adalah suatu metode

yang menggabungkan keefisienan kolom dan kecepatan analisis.

Pada bagian selanjutnya akan dibahas mengenai beberapa metode isolasi serta

penggunaan kromatografi kolom baik kolom konvensional maupun kolom vakum.

KROMATOGRAFI KOLOM

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak

digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam

jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering

24

digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua

macam :

1. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapas

kemudian ditambahkan cairan pengelusi.

2. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi

yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom

secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka.

Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan

mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang

terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik.

Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom

sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta

cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.

Kromatografi Kolom Isap :

Suction Colomn

Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak, berdasarkan absorpsi dan partisi,

dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu pompa vakum agar eluen

dapat turun mengelusi komponen kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi

Rapid-Sigel

Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan absorpsi dan partisi, dimana

kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun

mengelusi komponen kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi.

Press Colomn

Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerak dengan

cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara yang ditekan

mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan peruraian produk dari ekstrak dan

berubah saat pemisahan kromatografi.

Keterbatasan kromatografi kolom-terbuka klasik ialah sebagai berikut :

a. Pemisahan lambat

b. Penjerapan linarut yang tidak bolak-balik

c. Tidak dapat dipakai jika partikel terlalu kecil.

Kombinasi antara kromatografi kolom kering dan kromatografi cair vakum memiliki

kelebihan dimana laju pengelusian lebih tinggi dan memperpendek waktu kontak linarut

25

dengan penjerap. Untuk kolom gaya tarik bumi yang memakai penjerap berukuran 60-230

mesh (63-250 μm), umumnya laju aliran sekitar 10-20 mL/cm2 penampang kolom/jam.

Untuk partikel yang lebih kecil dari 200 mesh

diperlukan semacam pemompaan atau sistem bertekanan. Kemudian laju dapat ditingkatkan

sampai 2 mL atau lebih setiap menitnya, atau sampai batas sistem tekanan.

Kromatografi Vakum Cair mempunyai keuntungan yang utama dibandingkan dengan

kolom konvensional yaitu :

1. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan kolom

konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan

alir fase gerak lebih lambat (10-100μl/menit)

2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung

dengan spectrometer massa

3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas missal sampel klinis

Kerugian KCV (Kromatogravi Vakum Cair) :

1. Membutuhkan waktu yang cukup lama

2. Sampel yang dapat digunakan terbatas

F. Pemurnian senyawa hasil isolasi

Senyawa bahan alam sendiri adalah hasil metabolisme suatu organisme hidup (tumbuhan, hewan, sel) berupa metabolit primer dan sekunder.Sejauh ini telah diketahui bahwa tumbuhan memproduksi senyawa metabolit sekunder lebih banyak dibandingkan hewan. Senyawa-senyawa metabolit sekunder yang telah berhasil diisolasioleh manusia selanjutnya didayagunakan sebagai bahan obat.

Menurut Hanum (2010).Pemurnian adalah memisahkan komponen yang dicari dengan komponen-komponen lain yang dapat mengganggu identifikasi kualitatif dan penentuan kuantitatifnya. Dan Identifikasi senyawa merupakan pengidentifikasian senyawa metabolit sekunder yang diperoleh dengan melakukan uji pereaksi. Beberapa pereaksi diantaranya Lieberman-Buchard, pereaksi Dragendorff, Wagner dan Mayer dan beberapa pereaksi lainnya dengan uji positif berupa warna yang berbeda tergantung pengidentifikasian golongan suatu senyawa.

26

Isolasi adalah cara pemisahan komponen-komponen kimia yang terdapat dalam suatu bahan alam. Isolasi didalam penelitian biasanya banyak dilakukan di laboratorium kimia dengan mengambil beberapa komponen kimianya.

Beberapa tahapan isolasi diantaranya :

Ekstraksi yakni proses penarikan suatu zat terlarut dari pelarut di dalam air atau suatu pelarut lain yang tidak dapat bercampur dengan air.Teknik ekstraksi sangat berguna untuk pemisahan secara cepat dan bersih baik untuk zat organik maupun zat anorganik (Soebagio, 2002).

Fraksinasi adalah proses pemisahan suatu zat dari campuran zat tersebut, pemisahan dilakukan teknik yang bermacam macam seperti kromatografi ( KLT, KCKT, KCV, KK, KGC) dan ekstraksi cair-cair.

Teknik rekristalisasi yang berdasarkan pada perbedaan kelarutan dalam keadaan panas atau dingin dalam suatu pelarut.

Tahap awalnya rekristalisasi. Rekristalisasi adalah pemurnian suatu zat padat dari campuran atau pengotornya dengan cara mengkristalkan kembali zat tersebut setelah dilarutkan dalam pelarut yang cocok. Prinsip rekristalisasi adalah perbedaan kelarutan antara zat yang akan dimurnikan dengan kelarutan zat pencampur atau pencemarnya. Larutan yang terjadi dipisahkan satu sama lain, kemudian larutan zat yang diinginkan dikristalkan dengan cara menjenuhkannya.

Proses kristalisasi adalah kebalikan dari proses pelarutan. Mula-mula molekul zat terlarut membentuk agrerat dengan molekul pelarut, lalu terjadi kisi-kisi diantara molekul zat terlarut yang terus tumbuh membentuk Kristal yang lebih besar diantara molekul pelarutnya, sambil melepaskan sejumlah energy. Kristalisasi dari zat akan menghasilkan Kristal yang identik dan teratur bentuknya sesuai dengan sifat Kristal senyawanya. Dan pembentukan Kristal ini akan mencapai optimum bila berada dalam kesetimbangan.

Untuk merekristalisasi suatu senyawa kita harus memilih pelarut yang cocok dengan senyawa tersebut. Setelah senyawa tersebut dilarutkan kedalam pelarut yang sesuai kemudian dipanaskan sampai semua senyawanya larut sempurna. Apabila pada temperatur kamar, senyawa tersebut telah larut sempurna di dalam pelarut, maka tidak perlu lagi dilakukan pemanasan. Pemanasan hanya dilakukan apabila senyawa tersebut belum atau tidak larut sempurna pada keadaan suhu kamar. Salah satu faktor penentu keberhasilan proses kristalisasi dan rekristalisasi adalah pemilihan zat pelarut.

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam memilih pelarut yang sesuai adalah sebagai berikut:

1. Pelarut tidak hanya bereaksi dengan zat yang akan dilarutkan.2. Pelarut hanya dapat melarutkan zat yang akan dimurnikan dan tidak melarutkan

zat pencemarnya.3. Titik didh pelarut harus rendah, hal ini akan mempermudah pengeringan Kristal

yang terbentuk.

27

4. Titik didih harus lebih rendah dari titik leleh zat yang akan dimurnikan agar zat tersebut tidak terurai.

Ukuran kristal yang terbentuk selama pengendapan, tergantung pada dua faktor penting yaitu laju pembentukan inti (nukleasi) dan laju pertumbuhan kristal. Jika laju pembentukan inti tinggi, banyak sekali kristal akan terbentuk, tetapi tak satupun dari ini akan tumbuh menjadi terlalu besar, jadi terbentuk endapan yang terdiri dari partikel-partikel kecil. Laju pembentukan inti tergantung pada derajat lewat jenuh dari larutan. Makin tinggi derajat lewat jenuh, makin besarlah kemungkinan untuk membentuk inti baru, jadi makin besarlah laju pembentukan inti. Laju pertumbuhan kristal merupakan faktor lain yang mempengaruhi ukuran kristal yang terbentuk selama pengendapan berlangsung. Jika laju ini tinggi, kristal-kristal yang besar akan terbentuk yang dipengaruhi oleh derajat lewat jenuh (Svehla, 1979).

Kristal dapat digolongkan berdasarkan sifat ikatan antara atom-atom, ion-ion atau molekul-molekul yang menyusunnya. Penggolongan ini akan lebih mendasar menggunakan jumlah dan jenis unsure semestinya. Bila hasil rotasi, pantulan atau inverse suatu benda dapat dengan tepat disuspensi pada benda asalnya, maka struktur itu dikatakan mengandung unsure seperti simetri tertentu sumbu rotasi, bidang pantulan (cermin),atau titik pusat .operasi simetri ini dapat diterapkan pada bentuk-bentuk geometris, pada siatu benda fisis atau stuktur molekul.

Tahap – Tahap rekristalisasi adalah :

Pelarut : melarutkan zat pengotor pada Kristal. Penyaringan : memisahkan zat pengotor dari larutan Kristal yang murni. Pemanasan : menguapkan dan menghilangkan pelarut dari Kristal. Pendinginan : mengkristalkan kembali Kristal yang lebih murni.

Sublimasi merupakan cara yang digunakan untuk pemurnian senyawa – senyawa organic yang berbentuk padatan. pemanasan yang dilakukan tehadap senyawa organic akan menyebabkan terjadinya perubahan sebagai berikut: apabila zat tersebut pada suhu kamar berada dalam keadaan padat, pada tekanan tertentu zat tersebut akan meleleh kemudian mendidih. Disini terjadi perubahan fase dari padat ke cair lalu kefase gas. Apabila zat tersebut pada suhu kamar berada dalam keadaan cair. Pada tekanan dan temperature tertentu (pada titik didihnya) akan berubah menjadi fase gas. Apabila zat tersebut pada suhu kamar berada dalam keadaan padat, pada tekanan dan temperature tertentu akan lansung berubah menjadi fase gas tanpa melalui fase cair terlebih dahulu. Zat padat sebagai hasil reaksi biasanya bercampur dengan zat padat lain. Oleh karena itu, untuk mendapatkan zat-zat padat yang kita inginkan perlu dimurnikan terlebih dahulu. Prinsip proses ini adalah perbedaan kelarutan zat pengotornya. (Underwood,2002:169).

28

2.3. Bahan dan Alat

2.3. a. Proses Ekstraksi Bahan Alam

Alat :

Seperangkat alat maserasi Alat potong/ pisau/glinder Gelas ukur 500 ml Corong

Bahan :

sampel pulai 250 gram metanol

2.3. b. Proses Pemisahan In Vacao

Alat :

seperangkat alat rotari evaporator timbangan analitis erlemeyer/ beker gelas

Bahan :

ekstrak cair hasil maserasi

2.3.c. Proses Fraksinasi Bahan Alam

Alat :

corong pisah (separating funnel) rotari evaporator

Bahan :

aquades pelarut n-heksana pelarut etil asetat

29

2.3.d. Kromotografi Lapis Tipis Ekstrak dan Fraksi

Alat :

Chamber (wadah untuk KLT) Plat KLT Pipet mikro kapiler Spatel Gelas ukur 10 ml Kertas saring

Bahan :

Ekstrak kental 2 fraksi sebelumnya Pelarut n-heksana Pelarut eti asetat

2.3.e. Kromotografi Kolom Fraksi Terpilih

Alat :

Pipet tetes dalam saptel Beker gelas Gelas ukur Kolom kromotografi Kapas Corong Timbangan analitik Vial penampung

Bahan: n-heksana eti asetat silika gel

2.3.f. Kromotografi Lapis Tipis Fraksi Senyawa

Alat :

30

pipet tetes chamber gelas ukur 10 ml plat KLT pipet mikro kapiler kertas saring

bahan : n-heksana eti asetat metanol kloroform

2.4. Prosedur Kerja

2.4. a. Proses Ekstraksi Bahan Alam

1) Sampel dihaluskan dengan blender dan timbang sebanyak 250 mg

2) Kemudian sampel dimasukan kedalam botol gelap untuk melakukan metode maserasi

dan masukan etanol kedalam botol sebanyak lebih kurang 800ml

3) Rendam sampel selama beberapa hari lakukan pengadukan

2.4.b. Proses Pemisahan In Vacao

1) Menyiapkan ekstrak cair hasil maserasi

2) Timbang beker kosong yang akan diletakan ekstrak kenatal nantinya

3) Esltrak cair hasil maserasi dirotari sampai terbentuk ekstrak kentalnya

4) Tuangkan ekstrak kental dalam wadah yang sudah ditimbang tadi, setelah itu hitung

berat ekstrak yang digunakan

2.4.c. Proses Fraksinasi Bahan Alam

1) Ekstrak kental yang didapat dari pratikum seblumnya dihomogenkan dengan aquades

sampai semua larut dengan sempurna

31

2) Ekstrak berair ini kemudian dipindahkan kedalam corong pisah dan letakan dalam

statif yang tegak

3) Tambahkan n-heksana pada corong psah sebanyak 50 ml, kocok corong pisah sambil

dikeluarkan gas atau udara yang terbentuk dengan membuka katub corong

4) Letakan corong pisah kedalam statif, biarkan sebentar sampai terbentuk dua lapisan

yaitu lapisan non polar dan lapisan air. Pisahkan lapisan tersebut masukan dalam vial

penampung.

5) Tambahkan Etil asetat, lakukan hal yang sama seperti percobaan 3 dan 4 agar didapan

lapisan untuk semipolar

6) Kemudian ekstrak cair nonpolar dan semipolar tersebut dipekatkan dengan rotari

evaporator, setalah itu diletakan pada wadah yang sudah ditimbang sebelumnya dan

beri label

7) Hitung berat fraksi kental yang didapat

2.4.d.Kromotogarfi Lapis Tipis Ekstrak dan Fraksi

1) Siapkan chamber dan almunium voil

2) Buatlah perbandingan eluen tunggal atau dengan perbandingan terntentu sebanyak 5

ml dan masukan kedalam chamber hingga jenuh

3) Persiapkan larutan masing-masing sampel dengan mengencerkan sedikit ekstrak

kenatal kedalam vial dengan pelarut yang sesuai

4) Persiapkan plat KLT sesuai dengan ukuran.Tandai titik tepat totolan sampel

5) Totolkan sampel beberapa kali pada titik penotolan sehingga kosentrasinya cukup

6) Plat yang sudah ditotolkan sampel beberap kali dimasukan kedalam camber yang

telah diberi kertas saring dan berisi eluen. Kemudian lakukan elusi sampai pelarut

naik pada garis tep bagian atas plat

7) Lihat noda pada plat KLT dibawah lampu UV, tandai dengan pensil noda yang

dihasilkan

8) Hitung nilai Rf setiap noda yang tampak, baik secara visual maupun dibawah lampu

uv

9) Percobaan dilakukan untuk kedua sampel ekstrak (heksan dan etil asetat). Lakukan

juga pada plat yang sama sekaligus untuk 2 sampel.

32

2.4.e. Kromotografi Kolom Fraksi Terpilih

1) Timbang sampel 1 gram, preabsobsi dengan silika gel gerus sampai menjadi serbuk

2) Siapkan kolom kromotografi, tutup lubang dasar kolom dengan kapas untuk menahan

supaya silika gel tidak turun sewaktu katup kolom dibuka

3) Timbang silika gel dengan jumalah 20-50 kali berat sampel yang dipisahkan

4) Setelah itu buat bubur silika dengan campuran pelarut n-heksana, aduk sampai

homogen

5) Tuang dalam kolom dengan bantuan batang pengaduk kaca atau corong kecil.biarkan

pelarut yang digunakan menetes kebawah secara berulang dan sambil diaduk dan

diketukto-ketok

6) Setelah permukaan silika dalam kolom rata, masukan sampel yang sudah

dipreabsorbsi dengan hati-hati, boleh menggunakan corong atau diambl sedikit demi

sedikit. Permuakaan silika tidak boleh dibiarkan kering

7) Setelah itu elusi kolom tersebut, dimulai dari pelarut nonpolar sampai perut yang

bersifat polar

8) Tampung tetesan dalam vial-vial kecil sekitar 2/3 bagian vial, kemudian biarkan

menguap dalam vial tersebut

9) Perhatikan pemisahan warna yang terjadi pada kolom dan amati juga warna yang

terdapat dalam vial-vial tersebut

2.4.f. Kromotografi Lapis Tipis Fraksi Senyawa

1) Persiapkan Camber dan tutupnya. Jenuhkan sekeliling dengan eluen yang sesuai dan

letakan kertas saring di bagian dinding camber.

2) Buat eluen tunggal atau perbandingan tertentu sebanyak 10 ml dan masukan kedalam

chamberm biarkan camber menjadi jenuh

3) Perkirakan berapa vial dari hasil percobaan sebelumnya. Jika pelarut pada vial

tersebut telah kering, maka encerkan dengan pelarut yang sesuai (jangan terlalu

banyak pelarutnya)

33

4) Persiapkan plat KLT sesuai dengan ukuran dan jumlah totolan yang akan diletakkan

pada plat KLT. Buat garis tepi bawah dan tepi atas pada plat KLT,tandai tempat

totolan sampel

5) Totolan sampel beberapa kali pada titik penotolan sehingga konsentrasi yang cukup

didapat, dimasukan kedalam camber. Kemudian lakukan sampai pelarut naik pada

garis tepi bagian atas plat

6) Lihat noda yang terdapat pada plat KLT secara visual dan dibawah lampu UV.

Tandai dengan pensil noda yang dihasilkan

7) Percobaan ini dilakukan untuk semua vial yang telah dihasilkan. Jika terlalu banyak,

maka penotolan boleh dilakukan terhadap vial dengan jarak tertentu.

8) Lakukan gabungan tiap vial berdasarkan pola KLT yang didapat sehingga nanti akan

menghasilkan beberapa fraksi lagi

9) Jika ada vial adanya pembentukan kristal pada dinding, lakukan pros rekristalisasi

2.5. Hasil dan Pembahasan

2.6. Kesimpulan dan Saran

a) Kesimpulan

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa:

Ekstraksi senyawa bahan alam dapat dilakukan dengan cara maserasi

dilanjutkan dengan evaporasi.

Hasil ekstrak cair maserasi sebesar 700 mL dan ekstrak kental evaporator

sebesar gram sehingga kadar ekstrak kental yang diperoleh dari 250 gram

Teknik kromatografi kolom berdasarkan terapan atau adsorpsi jenis fasa yang

digunakan, dimana fasa diam berupa adsorben yang tidak boleh larut dalam

fasa gerak dengan menggunakan kolom dengan penambahan fasa gerak,

ditampung, dipisahkan, dan diidentifikasi. Sedangkan teknik kromatografi

lapis tipis berdasarkan cepat rambat suatu noda dengan lapisan tipis.

Prinsip dasar dari kromatografi yaitu memisahkan suatu zat berdasarkan atas

distribusi sampel di antara dua fasa yaitu fasa gerak (eluent) dan fasa diam

(silika).

34

b) Saran

o Adapun saran dari percobaan ini, sebaiknya untuk praktikum selanjutnya

digunakan pelarut etanol (C2H5OH) agar dapat diketahui perbandingan daya

kelarutan dari kedua pelarut tersebut.

o Praktikan seharusnya lebih berhati-hati, cermat, dan tidak ceroboh dalam

melaksanakan percobaan agar mendapat hasil yang baik dan menghindari

kesalahan.

35

DAFTAR PUSTAKA

Bresnick, Stephen D. High Yield Organic Chemistry, terj. Hadian Kotong. Intisari Kimia

Organik. Jakarta: Hipokrates. 1996

Day, R.A dan A.L. Underwood, Emory University, terj. Aloysius Hadyana

Pudjaatmaka.Analisis Kimia Kuantitatif . Jakarta: Erlangga. 1986

Evaporasi. http: //Wikipedia. org. 24 Desember 2012

Ilyas,  Asriani dan Wahyuni. Penuntun Praktikum kimia Organik. Makassar: UIN Alauddin,

2012.

Khopkar, S.M, Basic Concepts of Analytical Chemistry, terj. A.

Saptorahardjo. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press. 1990

Metanol. http: //Wikipedia. org. 24 Desember 2012.

Nohong dan Hadijah Sabarwati. Isolasi Metabolit Sekunder dari Kulit Batang Kembang

Sepatu. Jurnal Kimia Indonesia. 2006, . http://www.040716/JKI/amar makruf (24 Desemeber

2012)

Sitorus, Marham. Kimia Organik Umum. Yogyakarta: Graha Ilmu. 2010

http://qiqi-marizha.blogspot.com/2012/05/makalah-alkaloid.html

http://tihamahsiti.blogspot.com/2012/11/laporan-rekristalisasi.html

http://www.penalaran-unm.org/index.php?option=com_content&view=article&id=550:isolasi-senyawa-bahan-alam-dalam-penelitian&catid=1:penelitian&Itemid=202

Emrizal. 2002. Kimia Bahan Alam. Penerbit PT Gramedia pustaka utama, Jakarta.

Suryohudoyo P, 2000. Ilmu kedokteran molekuler. Ed I, Jakarta: Perpustakaan Nasional, hlm

48-58.

36

http://ogysogay.blogspot.com/2011/04/maserasi-laporan-kimiabahanalam.html

http://wiwindaistiarsih.blogspot.com/2011/12/laporan-kimia-bahan-alam.html

http://Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas.html

Denikrisna. 2010. Kromatografi. denikrisna. wordpress.com/category/bakul/ kromatografi/.

Diakses pada 25 April 2012.

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: ITB Bandung .

Ismiarni. 2010. Kromatografi (Dasar). alamlearning.blogspot.com/search/label/

chromatography. Diakses pada 25 April 2012.

Khopkar, S.M. 2010. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia.

Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. Malang: Universitas Negeri Malang.

Tim Dosen Kimia Organik. 2012. Penuntun Kimia Organik I. Makassar: Laboratorium

FMIPA UNM.

37

BAB III

PENUTUP

38