LAPORAN KEMAJUAN

INL-FIBROGEN (Inhibiton of Liver Fibrosis Based on Regenerative Medicine Empowering

Peanut Hull): INOVASI TERAPI DEGRADASI FIBROSIS HEPAR BERBASIS

KEDOKTERAN REGENERATIF MENGGUNAKAN KULIT KACANG TANAH

(Arachis hypogea L)

1. Target luaran

Produk berupa artikel ilmiah dan paten tentang manfaat ekstrak kulit kacang tanah terhadap

regenerasi jaringan hepar melalui inhibisi degradasi hepar pada kondisi fibrosis hepar.

Tujuan Umum

Membuktikan efektivitas ekstrak kulit kacang tanah (Arachis hypogea L) dalam proses regenerasi

hepar pada mencit model fibrosis hepar.

Tujuan Khusus

1. Mengetahui pengaruh ekstrak kulit kacang tanah (Arachis hypogea L) terhadap perbaikan

struktur anatomi dan histologi hepar pada mencit model fibrosis hepar.

2. Mengetahui pengaruh ekstrak kulit kacang tanah (Arachis hypogea L) terhadap penurunan

deposisi kolagen hepar pada mencit model fibrosis hepar.

3. Mengetahui pengaruh ekstrak kulit kacang tanah (Arachis hypogea L) terhadap penurunan

ekspresi TGF-β1 pada hepar mencit model fibrosis hepar.

2. Metode

2.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan desain eksperimen murni (true experimental design) di

laboratorium secara in vivo menggunakan rancangan Randomized Post Test Only Controlled Group

Design. Induksi CCl4 mengacu pada dosis Sahreen et al (2011) sebesar 0.5 ml/ kg, dua kali

seminggu selama enam minggu. Dosis esktrak mengacu pada penelitan Domitrovic et al., (2009)

dengan pemberian ekstrak luteolin 10, 25, dan 50 mg/kg BB.

Cedera dan inflamasi sel hepar

TGF-β1

Penumpukan Kolagen tipe I

↑ Sel Fibroblas

↑ Hepatic Stellate Cell (HSC)

2 . 2 Kerangka Konsep Penelitian

2.3 Variabel Penelitian

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak kulit kacang tanah yang dibagi dalam kelompok:

1. Kelompok 1: kelompok kontrol negatif (mencit yang tidak diberikan CCl4 dan tanpa diberikan ekstrak kulit kacang tanah)

2. Kelompok 2: kelompok kontrol positif (mencit yang diberikan CCl4 tanpa diberikan ekstrak kulit kacang tanah)

3. Kelompok 3: mencit yang diberikan CCl4 dan ekstrak kulit kacang tanah konsentrasi I (15mg/Kg BB)4. Kelompok 4: mencit yang diberikan diberikan CCl4 dan ekstrak kulit kacang tanah konsentrasi II

(30mg/Kg BB)5. Kelompok 4: mencit yang diberikan diberikan CCl4 dan ekstrak kulit kacang tanah konsentrasi III (60

mg/Kg BB)- Variabel terikat dalam penelitian ini adalah: (a) Anatomi dan histopatologi hepar; (b) deposisi

kolagen hepar; (c) ekspresi TGF-β1, MMP-9.

2.4 Objek dan Sampel Sampel penelitian adalah model mencit BALB/c jantan berusia 6-7 minggu jantan sesuai

penelitian Jong In Yang dan rekannya (2009). Perhitungan besarnya pengulangan pada sampel

adalah sebagai berikut (Anshori,M., 2008):

(t-1) (r-1) ≥ 15

t : jumlah perlakuan, r : jumlah ulangan

Pada penelitian ini t = 5 sehingga jumlah pengulangan adalah:

(5-1) (r-1) ≥ 15

r-1 ≥ 15:4

r = 3.75 + 1 = 4.75

Dibesarkan menjadi 5 pengulangan.

2.5 Tempat Penelitian

Luteolin

Ekstrak Kulit Kacang Tanah (Arachis hypogea L)

↑MT I/II↓↑Regenerasi Hepar

↓ MMP-9

Fibrosis Hepar

Sirosis Hepar

Hepatic Carcinoma Hipertensi portal Gagal Hepar

Gambar 1. Kerangka Konsep Penelitian

Adaptasi hewan coba selama satu minggu

Memilih sampel mencit BALB/c jantan (6 minggu) dengan metode simple random sampling

25 mencit BALB/c jantan (6 minggu)

Diberikan CCl41ml/kg 2 kali semingguTanpa perlakuan apapunDiberikan CCl4+Ekstrak kulit kacang tanah (15 mg/Kg BB)Diberikan CCl4+Ekstrak kulit kacang tanah (30 mg/Kg BB)Diberikan CCl4+Ekstrak kulit kacang tanah (60 mg/Kg BB)

Kelompok kontrol positif (5 ekor)Kelompok kontrol negatif (5 ekor) Kelompok II (5 ekor)Kelompok III (5 ekor)Kelompok I (5 ekor)

Analisis dan Kesimpulan

Pengamatan Histopatologis (Pewarnaan Hematoxylin Eosin)Pengamatan Deposisi Kolagen hepar (Collagen Circulation Assay)Pengamatan ekspresi TGF-β1 dengan ELISA

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakologi, Laboratorium Biomedik, Laboratorium Biokimia dan Biomol, Laboratorium Patologi Anatomi dan Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang

2.6 Skema Alur Penelitian

Gambar 2. Skema Alur Penelitian

3. Kemajuan Pengerjaan Penelitian

3.1 Hasil Pemeriksaan Deposisi Kolagen Hepar dengan Pewarnaan Masson’s Trichrome

Penampang potongan pada kelompok kontrol (-) menunjukkan deposisi kolagen (jaringan

berwarna biru) yang sedikit. Pada kelompok kontrol (+) yang diberikan CCl4 saja, didapatkan

deposisi kolagen yang sedikit lebih banyak. Pada kelompok perlakuan I dengan dosis 15 ml/KgBB,

masih didapati adanya deposisi kolagen. Pada perlakuan II dengan dosis 30 ml/KgBB telah terjadi

penurunan deposisi kolagen yang bermakna. Pada kelompok III dengan dosis 60 ml/KgBB, hepar

nampak seperti pada kondisi normal.

3. 2 Hasil Pemeriksaan Histopatologi dengan Pewarnaan Hematoxylin Eosin

Penampang potongan pada kelompok kontrol (-) menunjukkan arsitektur hepar yang normal

pada semua area. Pada kelompok kontrol (+) yang diberikan CCl4 saja, nampak adanya hepatosit

yang telah mengalami ballooning degeneration/nekrosis, degenerasi yang mengandung inklusi

hyaline yang asidofilik yang ditunjukkan dengan panah panjang. Pada daerah ini juga menunjukkan

adanya infiltrasi sel mononuclear yang banyak dan microvesikuler steatosis. Selain itu pada

kelompok ini ditemukan kongesti aliran darah yang ditandai dengan pelebaran daerah sinusoidal

yang terisi dengan eritrosit. Pada kelompok perlakuan I dengan dosis 15 ml/KgBB, masih didapati

adanya hepatosit yang mengalami ballooning degeneration dengan inklusi hialin dan kongesti

aliran darah. Pada perlakuan II dengan dosis 30 ml/KgBB telah terjadi penurunan yang bermakna

dari lesi hepatosit walaupun masih ada dalam jumlah yang lebih kecil dan tidak dijumpai lagi

kongesti aliran darah. Pada kelompok III dengan dosis 60 ml/KgBB, histoarsitektur hepar nampak

seperti pada kondisi normal walaupun masih ada mikrovesikuler steatosis pada daerah perilobuler

maupun periportal.

3. 5 Hasil Pemeriksaan MMP-9

Hasil uji normalitas Kolmogorov-Smirnov data dari persentase area imunopositif MMP-9 di

atas diperoleh sebaran data normal (p>0,05). Selanjutnya, untuk uji homogenitas diperolah angka

signifikansi 0.185 artinya data telah memiliki varian yang homogen (p> 0.05). Setelah kedua syarat

terpenuhi, selanjutnya dilakukan uji one way anova dan didapatakan angka signifikansi 0.000 yang

berarti paling tidak ada dua kelompok yang memiliki perbedaan yang bermakna. Dari analisa post

hoc didapatkan perbedaan yang bermakna antara K(-) dengan K(+)dan P1, antara P1 dengan P2 dan

P3. Namun tidak didapatkan perbedaan yang bermakna antara prosentase akhir dari K(-) dengan P2

dam P3. Dengan demikian maka dapat disimpulkan bahwa pada dosis P2 maupun P3 sudah mampu

meningkatkan ekspresi MMP-9 pada hepar dengan kondisi fibrosis hepar. Dengan demikian pada

pemberian ekstrak kulit kacang tanah mampu meningkatkan ekspresi MMP-9 yang merupakan

indikator proses perbaikan struktur dan adanya proses regenerasi yang berjalan baik yang pada

kondisi fibrosis hepar.

3. 6 Hasil Pemeriksaan level TGF-β1

TGF-β1 memiliki peran utama dalam pembentukan jaringan fibrosa. Pada fibrosis hepar ini,

terjadi peningkatan level TGF-β1 yang pada awalnya merekrut sel-sel inflamasi dan fibroblast ke

area cedera dan menstimulasi sel-sel tersebut untuk memproduksi sitokin-sitokin dan matriks

ekstraseluler. Penampang potongan pada kelompok kontrol (-) menunjukkan level TGF-β1 yang

normal. Pada kelompok kontrol (+) yang diberikan CCl4 saja, didapatkan peningkatan level TGF-

β1. Pada kelompok perlakuan I dengan dosis 15 ml/KgBB, terjadi penurunan level TGF-β1. Pada

perlakuan II dengan dosis 30 ml/KgBB telah terjadi penurunan level TGF-β1 yang bermakna. Pada

kelompok III dengan dosis 60 ml/KgBB, level TGF-β1 nampak seperti pada kondisi normal.

4. Ketercapaian Target Luaran

TABEL KETERCAPAIAN ( 31 Juni 2013)

I. Persiapan SUDAH (%) BELUM (%) TARGET (%)1.1 Persiapan laboratorium farmakologi 3 0 31.2 Persiapan laboratorium biokimia 3 0 31.3 Persiapan laboratorium PA 3 0 31.4 Persiapan laboratorium fisiologi 3 0 31.5 Persiapan laboratorium biomedik 3 0 31.6 persiapan ethical clearance 3 0 3

1.7 Aklimatisasi tikus 2 0 21.8 Penyediaan kulit kacang tanah 4 0 4II. Pelaksanaan2.1 Ekstraksi Kulit Kacang Tanah 6 0 62.2 Induksi CCl4 pada mencit 6 0 62.3 Pemberian ransum pada sampel mencit 6 0 62.4 Pemberian ekstrak kulit kacang tanah pada sampel mencit 6 0 62.5 Pembedahan mencit 6 0 62.6 Pengecekan Histopatologi hepar 7 0 72.7 Pengecekan deposisi kolagen 7 0 72.8 Pengecekan TGF-β1 7 0 72.9 Pengecekan MMP-9 7 0 72.10 Pengecekan SGOT dan SGPT 7 0 7III. Pengumpulan Data dan Evaluasi Hasil3.1 Pengumpulan data 2 0 23.2 Analisa dan pengolahan data 0 9 93.3 Penarikan kesimpulan dan penyusunan laporan kegiatan 1 1 2TOTAL (JUMLAH CHECKLIST) 90 10 100PERSENTASE KETERCAPAIAN 90 %

5. Permasalahan dan penyelesaian

No Masalah Penyelesaian1. Administratif -

2. Teknis

• Diperlukan Kit TGF-β untuk pemeriksaan

serum yang mahal dan tidak tersedia

• Menggunakan TGF-β untuk jaringan dengan

metode immunohistokimia

3. Organisasi Pelaksana

• Jadwal perkuliahan yang cukup padat rata-

rata dari pukul 07.00 hingga 16.00 WIB

• Pembuatan jadwal kegiatan penelitian;

• Dilakukan pembagian tugas dan piket untuk

seluruh anggota sehingga bila ada waktu luang

dimanfaatkan untuk melanjutkan PKM

6. Peran Dosen Pembimbing

No. Hari, Tanggal Konsultasi dan Saran Dosen Pembimbing

1. Maret 2013 Bertemu Dosen dan menyampaikan rencana kerja dan berbagai persiapan

yang akan dilakukan dalam penelitian PKM . konsultasi mengenai pembelian

KIT dan mengenai biaya.

2. April 2013 Menyampaikan progress penelitian kepada Dosen Pembimbing mengenai

penyuntikan mencit dan perawatan mencit

Menyampaikan kendala-kendala penelitian

Feedback dari dosen untuk mengatasi masalah yang ada dalam penelitian

3. Mei 2013 Menyampaikan progress penelitian kepada Dosen sampai bulan Mei

mengenai penyondean mencit dan persiapan untuk pembedahan

Mempersiapkan Tahap Monitoring Evaluasi ersama Dosen

Dosen membantu menyelesaikan kendala-kendala yang ada dalam penelitian

4. Juni 2013 Bertemu dosen untuk melaporkan progress penelitian serta rencana-rencana

kelompok yang akan dilakukan selanjutnya seperti pembedahan dan

pewarnaan slide

Dosen membantu kelompok dalam menyelesaikan masalah-masalah yang

dihadapi kelompok seperti masalah keuangan

Membantu persiapan untuk monitoring evaluasi yang akan di adakan oleh

fakultas

7. Penggunaan Biaya

Bulan Februari 2013

Tanggal Keterangan Pemasukan Pengeluaran19/02/2013 Iuran kelompok Rp. 600.000,0019/02/2013 Fotocopy proposal Rp. 6500,0021/02/2013 Pembelian tikus Rp. 505.000,00

TOTAL Rp. 511.500,00SALDO Rp. 88.500,00

Bulan Maret 2013

Tanggal Keterangan Pemasukan PengeluaranSisa iuran kelompok Rp. 88.500,00Iuran kelompok Rp. 100.000,00

03/03/2013 Spuit dan jarum 1cc Rp. 38.000,0008/03/2013 Spuit Rp. 5.000,0014/03/3013 Alkohol 70% Rp. 13.500,0019/03/2013 Beli mencit Rp. 70.000,0025/03/2013 fotocopy ethic Rp. 17.000,00

TOTAL Rp. 143.500,00SALDO Rp. 44.900,00

Bulan April 2013

Tanggal Keterangan Pemasukan PengeluaranSisa iuran kelompok Rp. 44.900,00Iuran kelompok Rp. 650.000,00

12/04/2013 Spuit Rp. 5.000,0017/04/2013 Ekstrak kulit kacang Rp. 230.000,0017/04/3013 Vacoutainer Rp. 35.000,00

19/04/2013 Sarung Tangan Rp. 45.000,00

19/03/2013CCL4 dan ektrak kulit kacang Rp. 330.000,00

TOTAL Rp. 645.000,00SALDO Rp. 49.900,00

Bulan Mei 2013

Tanggal Keterangan Pemasukan PengeluaranSisa iuran kelompok Rp. 49.900,00

20/05/2013 Spuit Rp. 5.000,00TOTAL Rp. 5.000,00SALDO Rp. 44.900,00

Bulan Juni 2013

Tanggal Keterangan Pemasukan PengeluaranSisa iuran kelompok Rp. 44.900,00Talangan lab Rp. 8.500.000.00

16/06/2013 Kit MMP 9 Rp. 4.000.000,0019/06/2013 Pengecatan HE Rp. 1.000.000,0021/06/3013 Pengecatan MT Rp. 1.000.000,0026/06/2013 Pengecatan tgf beta Rp. 2.000.000,00

TOTAL Rp. 8.500.000,00SALDO Rp. 44.900,00

8. Peluang Paten

- Produk berupa obat yang mampu menginhibisi fibrosis hepar dari bahan alam yang

dianggap tidak berguna, yakni kulit kacang tanah.

- Adanya penelitian ini, limbah kulit kacang tanah yang selama ini dibuang dapat diolah

menjadi sesuatu yang bermanfaat.

- Penelitian ini membuka peluang usaha yang besar di bidang farmasi, selain itu membawa

manfaat khususnya bagi petani kacang tanah.

- Hasil penelitian ini berpotensi menjadi obat untuk terapi inhibisi degradasi fibrosis hepar

berbasis kedokteran regeneratif yang memanfaatkan bahan alam pertama di Indonesia.

- Hasil penelitian ini berpotensi untuk mendapatkan sertifikat paten produk dari HAKI dan

dipublikasikan dalam jurnal ilmiah tingkat nasional maupun internasional.

9. Dokumentasi Kegiatan

1) Persiapan Kandang Mencit

2) Pembuatan Ekstrak Kulit Kacang Tanah (Arachis hypogea L)

3) Pemberian ekstrak pada kelompok perlakuan

4) Induksi CCl4

5) Pembedahan dan pengambilan sampel

6) Pemeriksaan kadar SGPT/ALT dan SGOT/AST

7) Pewarnaan Masson’s Trichrome

8) Pewarnaan imunohistokimia MMP-9 dan pengecekan serum MMP-9

9) Pewarnaan imunohistokimia TGF-β1