Laporan Praktikum Genetika MolekulerNama: Abdullah Adzkiy RobbaniTanggal: 18 Februari 2014NIM:34110077Asisten:Kel/Lab: 11/ Bio 5Liyana Salsabila G34100010Ina Agustina G34100038Eka Maulani G34100043Bustomi G34100055Dwika Armyanto G34100111

IDENTIFIKASI EUKARIOT SECARA MOLEKULER

Pendahuluan Latar BelakangSemua sifat yang dimiliki oleh organisme ditentukan oleh gen-gen yang dimilikinya. Gen merupakan bagian-bagian dari urutan asam nukleat yang terdapat pada DNA. Terdapat dua kategori gen, yaitu gen struktural dan gen regulator. Gen-gen struktural mengkode urutan asam amino dalam protein, seperti enzim, yang menentukan kemampuan biokimia dari organisme pada reaksi katabolisme dan anabolisme, atau berperan sebagai komponen tetap pada struktur sel. Gen-gen regulator berfungsi mengontrol tingkat ekspresi gen struktural, mengatur laju produksi protein produknya dan berhubungan dengan respon terhadap signal intra dan ekstraselular (Gaffar 2007).DNA dan RNA berperan sebagai materi genetik pada sel prokariot dan eukariot, virus, dan plasmid, masing-masing mempunyai pengaturan dan lokasi yang berbeda. Pada prokariot, DNA tidak terpisah dari komponen sel lain. Pada eukariot DNA berlokasi dalam nucleus, terpisah dari komponen sel lain oleh selaput inti. DNA eukariot berikatan dengan protein, membentuk kompleks yang disebut kromatin. Sebelum mitosis (pembelahan sel), DNA mengalami replikasi, menghasilkan dua kromosom identik yang disebut sister kromatid (Gaffar 2007).DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, urasil = U). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3, gugus fosfat pada posisi karbon 5 dan basa pada posisi karbon 1 molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5fosfat dengan gugus 3hidroksil (Gaffar 2007).Struktur DNA mirip dengan struktur RNA. Perbedaan diantara keduanya terdapat pada jenis gula dan basa pada monomernya serta jumlah untai penyusunnya. Pada DNA, tidak terdapat gugus hidroksil pada posisi karbon 2 dari molekul gula (2-deoksiribosa) sementara pada RNA molekul gulanya adalah ribosa. Basa nitrogen yang terdapat pada DNA adalah adenin, guanin, sitosin dan timin, sedangkan pada RNA jenis basanya adalah adenin, sitosin, guanin dan urasil. RNA merupakan polinukleotida yang membentuk satu utas sedangkan DNA merupakan polinukleotida membentuk 2 utas (heliks ganda) (Gaffar 2007). TujuanMengisolasi DNA genom eukariot dan mengidentifikasinya secara molekular menggunakan daerah ITS, gen penyandi 18S rRNA.

Metode(1) HewanGerus daging ayam dengan menggunakan nitrogen cairTambahkan buffer 300 L, inkubasi pada suhu 65C selama 15 menitBolak-balik 8x, inkubasi pada es selama 10 menitTambahkan 15 L NaCl, bolak-balik 8x, inkubasi pada es selama 5 menitSentrifugasi 14000 rpm selama 10 menit, ambil supernatan 500 LTambahkan 4 L RNAse 1mg/mL, inkubasi pada 37C selama 15 menitTambahkan 350 L isopropanol, bolak-balik 8xSentrifugasi 14000 rpm selama 20 menit, ambil peletnyaTambahkan 500 L ETOH 70%Sentrifugasi 14000 rpm selama 5 menit, masukkan dalam oven 37CTambahkan 20 L ddH2O(2) DaunAmbil 1 g daunTambahkan Nitrogen cair dan digerusTambahkan 600 L CTAB+PVP 5%, inkubasi pada suhu 65CTambahkan 600 L C:I, bolak-balik 8xSentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit, ambil supernatanTambahkan 1x volume PCI, bolak-balik 8xSentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit, ambil supernatanTambahkan 0,1x volumen Na-asetat dan 2x volume etanol absolutOvernight di freezer(3) CendawanHaluskan miselium dengan nitrogen cairTambahkan 600 L CTAB+PVP 1%, inkubasi pada suhu 65C selama 30 menit, bolak-balik per 10 menitTambahkan C:I, bolak-balikSentrifugasi 10000 rpm pada suhu 20C selama 10 menit, ambil supernatanTambahkan 1x volume PCI, bolak-balik 8xSentrifugasi 10000 rpm pada suhu 20C selama 10 menit, ambil supernatanTambahkan 1x volume Na-asetat dan 2x volumeInkubasi overnight

HasilDNA kelompok 11

Gambar 1 Hasil elektroforesis DNA eukariot. Keterangan: sumur 1-2: marker, sumur 3-6: sampel daging, sumur 7-10: sampel daun bayam, sumur 11-13: sampel cendawan.DNA kelompok 11

Gambar 1 Hasil PCR DNA eukariotTabel 1 Data rasio kemurnian DNADNA KelompokAbsorbansiRasio 260/ 280

260 280

11,3420,9141,468

20,4700,2871,638

30,6740,4681,440

40,1480,1021,451

52,1541,3551,590

60,4770,2651,800

70,7720,4371,767

80,8610,5141,675

90,5650,3211,760

100,3370,2791,208

110,1180,0761,553

Contoh perhitungan kemurnian DNA:Kemurnian DNA kelompok 11 = OD260 = 0,118 = 1,553 OD280 0,076PembahasanVariasi urutan basa DNA daerah ITS (Internal Transcribed Spacer) umum digunakan sebagai karakter molekuler untuk mengetahui hubungan filogenetik atau kekerabatan pada eukariot. Daerah ITS sering digunakan para ahli untuk analisis filogenetik molekuler pada eukariot dalam rangka memahami keanekaragaman dan menjawab beberapa masalah filogenetika. Hal ini disebabkan daerah ITS memiliki karakteristik unggul, yaitu berukuran kecil (kurang lebih 700 bp) dan memiliki salinan yang banyak di dalam genom inti. Karakteristik ini menyebabkan daerah ITS mudah untuk diisolasi, diamplifikasi, dan dianalisis (Hidayat et al. 2008), serta memiliki derajat konservasi pada setiap komponennya (Darmono 1996).Salah satu cara untuk melihat keanekaragaman jenis dapat dilakukan melalui analisis sekuen gen 16S-rRNA bagi organisme prokariot atau 18S-rRNA bagi organisme eukariot. Perbandingan sekuen rRNA merupakan alat yang baik untuk mendeduksi hubungan filogeni dan evolusi di antara organisme bacteria, archaebacteria, dan eukariot (Yuwono 2005). Ribosomal RNA (rRNA) adalah RNA yang akan digunakan untuk membangun ribosom sebagai mesin sintesis protein. Ada 4 jenis rRNA pada organisme eukariot, salah satunya ialah 18S rRNA. 18S rRNA bersama dengan 30 molekul protein yang berbeda digunakan untuk membuat subunit kecil dari ribosom. Subunit 18S rRNA adalah daerah yang tidak mudah berubah atau bermutasi dan mengalami proses evolusionari yang lambat sehingga dapat digunakan untuk membedakan organisme pada tingkat spesies (Hillis dan Dixon 1991).Pada praktikum kali ini digunakan berbagai larutan yang berfungsi untuk mendukung isolasi DNA genom eukariot. Beberapa larutan tersebut antara lain: buffer lisis, proteinase K, isopropanol, dan RNAse. Buffer lisis dan proteinase K berfungsi untuk melisiskan atau menghancurkan sel dengan cara melarutkan fosfolipid dan komponen protein sehingga membran sel mengalami kerusakan. Isopropanol berfungsi untuk mengendapkan DNA. Adapun RNAse berfungsi untuk mendenaturasi RNA. Akan tetapi, tersedianya larutan-larutan tersebut tidak bersifat mutlak harus ada. Sebagai contoh, pada saat isolasi DNA hewan (terutama pada daging), umumnya tidak menggunakan RNAse karena sudah digunakan proteinase K pada bahan daging (Brown et al. 1991).Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Proses migrasi DNA dalam gel ini disebut elektroforesis. Alat yang digunakan dalam metode ini disebut alat elektroforesis (Lisdiyanti 1997). Sedangkan spektrofotometri dalam kegiatan biologi molekuler digunakan untuk mengetahui nilai kemurnian suatu DNA. Alat yang digunakan dalam metode spektrofotometri adalah spektrofotometer. Prinsip kerja spektrofotometer yaitu dengan menembakkan cahaya pada suatu panjang gelombang tertentu sehingga didapatkan nilai absorbansinya. Hasil absorbansi pada dua panjang gelombang dibandingkan sehingga didapatkan rasionya. Apabila rasio kedua panjang gelombang tersebut memiliki nilai lebih dari 1,8 maka dapat dikatakan bahwa DNA yang dianalisis tersebut murni (Gaffar 2007).Teknik PCR bertujuan untuk menggandakan sekuen DNA yang telah ditandai oleh primer. Proses penggandaan tersebut melalui tiga fase yaitu denaturasi, annealing, dan ekstensi (elongasi). Denaturasi adalah proses pemisahan utas DNA. Pada tahap ini, ikatan hidrogen yang menyatukan kedua utas akan terlepas menjadi masing-masing utas tunggal. Annealing adalah proses dimana primer forward dan primer reverse mencari pasangannya masing-masing. Suhu pada saat annealing umumnya antara 40 hingga 55 derajat celcius. Sedangkan ekstensi atau biasa disebut juga elongasi adalah peristiwa DNA kembali dipanaskan hingga 72 derajat celcius agar taq polimerase dapat bekerja menggandakan sekuen DNA dan melakukan proses pemanjangan DNA (Muladno 2002).Hasil percobaan menunjukkan adanya pita-pita DNA pada semua kelompok tetapi pita-pita DNA tersebut tampak terdapat smear (pengotor). Menurut Gaffar (2007), pita DNA yang bersih tanpa latar belakang mengindikasikan tingkat kemurnian DNA yang baik. Kontaminasi pada DNA oleh organel lainnya dapat dilihat dengan munculnya latar belakang yang smear di sepanjang jalur pergerakan pita genom DNA. Hal ini sesuai dengan hasil percobaan yaitu nilai kemurnian DNA pada setiap kelompok yang didapatkan setelah dilakukan spektrofotometri menunjukkan nilai yang kurang dari 1,8. Nilai kemurnian 1,8 hanya diperoleh pada DNA kelompok 6, artinya hasil isolasi DNA eukariot semua kelompok tidak murni kecuali kelompok 6 didapatkan hasil yang murni. Sedangkan pada hasil PCR DNA eukariot menunjukkan beberapa kelompok terlihat pita DNA tetapi beberapa kelompok lainnya tidak menunjukkan adanya pita DNA. Tidak munculnya pita DNA ini diperkirakan disebabkan kesalahan praktikan dalam melakukan prosedur, atau disebabkan karena primer tidak menempel pada DNA.

SimpulanSalah satu cara untuk melihat keanekaragaman jenis eukariot dapat dilakukan melalui analisis sekuen gen 18S rRNA. Subunit 18S rRNA dapat digunakan untuk membedakan organisme pada tingkat spesies karena 18S rRNA merupakan daerah yang tidak mudah berubah dan mengalami proses evolusionari yang lambat. Daerah ITS sering digunakan para ahli untuk analisis filogenetik molekuler pada eukariot karena daerah ITS memiliki karakteristik unggul, yaitu berukuran kecil dan memiliki salinan yang banyak di dalam genom inti. Hasil percobaan menunjukkan adanya hubungan antara hasil elektroforesis dengan hasil spektrofotometri, yaitu apabila hasil elektroforesis terdapat smear maka umumnya nilai kemurnian DNA yang didapat dari hasil spektrofotometri tidak mencapai 1,8.

Daftar PustakaBrown TA et al. 1991. Pengantar Cloning Gen. Yogyakarta (ID): Yayasan Essentia Medica.Darmono TW. 1996. Analisis keanekaragaman genetik tanaman dengan teknik molekuler. Hayati: 7-11.Gaffar S. 2007. Bioteknologi Molekular. Bandung (ID): Universitas Padjadjaran.Hidayat T et al. 2008. Analisis filogenetik molekuler pada Phyllanthus niruri (Euphorbiaceae) menggunakan urutan basa DNA daerah Internal Transcribed Spacer (ITS). J Matematika & Sains 13(1): 6-21.Hillis DM, Dixon MT. 1991. Ribosomal DNA: Molecular evolution and phylogenetic inference. Quarterly Review of Biology 66: 411-453.Lisdiyanti. 1997.Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Bogor (ID): Warta Biotek.Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor (ID): Pustaka Wirausaha Muda.Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta (ID): Erlangga.