laporan akhir metode pemisahan sokletasi - identifikasi piperin

1

LAPORAN AKHIR

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI PIPERIN

KELOMPOK VI / GOLONGAN III

Luh Putu Kausala Mahamuni (1208505093)

Agus Ferbiana Putra (1208505094)

Agung Aryk Parta Febriyana (1208505095)

Putu Eka Masmitha Utami Dewi (1208505096)

I Gde Pasek Padmanaba (1208505097)

M. Averil Prima Putra Rashid (1208505098)

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2013

2

I. TUJUAN PERCOBAAN

Mahasiswa mampu menerapkan Sokhletasi, Rekristalisasi dan Identifikasi

piperin dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

II. DASAR TEORI

2.1 Tanaman Lada Hitam.

Tanaman Lada hitam dengan nama latin Piper nigrum L atau nama simplisia

Piperis nigri fructus merupakan tanaman yang diambil bagian buahnya yang

kemudian dikeringkan (Peter, 2000).

Adapun taksonomi dari Piper nigrum L adalah sebagai berikut :

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Subkelas : Monochlamydeae

Ordo : Piperales

Famili : Piperaceae

Genus : Piper

Spesies : Piper nigrum L

(Tjitrosoepomo, 2010)

Adapun kandungan dari Piper nigrum adalah 5%-9% piperin dan isomer

kavisin seperti damar 1%; 1,2%-3,5% minyak atsiri termasuk felandrena,

dipentena, sitrat dan seskuiterpena. Kandungan lainya adalah minyak lemak 6%-

8% dan kira-kira 50% pati (Stahl, 1985).

Gambar 1. Struktur kimia piperin (Anggrianti, 2008)

Piperin dengan rumus kimia C17H19NO3 yang terkandung dalam lada

merupakan senyawa yang tidak berwarna atau agak kekuning-kuningan,

mengkilap, berupa kristal prismatik, tidak berbau dan hampir hambar ketika

pertama kali diletakkan di mulut tetapi bila kontak lama menimbulkan sensasi

3

pedas yang tajam dan menusuk di lidah. Sifat kimia Piperin adalah hampir tidak

larut dalam air, larut dalam 30 bagian alkohol pada suhu 150C dan dalam 1 bagian

alkohol yang dipanaskan, piperin juga larut dalam kloroform, benzen, karbon

disulfida tetapi hampir tidak larut dalam petroleum eter. Piperin melebur pada

suhu 1280C-130

0C, bersifat netral terhadap lakmus. Piperin dapat dihidrolisis

dengan KOH-etanolik yang akan menghasilkan kalium piperinat dan piperidin

(Anggrianti, 2008 ; Septiatin, 2008).

2.2 Sokhletasi

Sokhletasi merupakan suatu metode pemisahan komponen dari tumbuhan

dengan menggunakan alat Sokhlet. Metode ini digunakan untuk komponen dari

simplisia yang relatif stabil dan tahan terhadap pemanasan. Prinsip dari Sokhletasi

adalah menyari simplisia secara terus-menerus dengan pelarut yang sama yang

telah termunikan tiap waktu sehingga penyarian lebih sempurna dengan memakai

pelarut yang relatif sedikit. Jika penyarian telah berakhir maka pelarutnya

diuapkan dan sisanya hanya zat tersari. Dalam metode ini digunakan pelarut yang

mudah menguap dan dapat melarutkan senyawa organik yang diinginkan tetapi

tidak melarutkan zat pengotor (Kusmardiyani, 1992).

Gambar 2. Alat Sokhletasi (Kusmardiyani, 1992)

Kelebihan metode Sokhletasi adalah sebagai berikut; Cairan pelarut yang

digunakan lebih sedikit dan secara langsung diperoleh hasil yang lebih pekat,

simplisia disari oleh pelarut yang selalu baru sehingga dapat menarik zat aktif

yang lebih banyak, penyarian dapat diteruskan sesuai keperluan tanpa menambah

4

volume pelarut. Sementara itu, kelemahannya adalah; Adanya pendidihan pelarut

terus menerus sehingga mempengaruhi kualitas pelarut dan metode ini tidak baik

untuk zat aktif yang tidak tahan panas (Harborne, 1987).

2.3 Rekristalisasi

Rekristalisasi merupakan salah suatu cara pemurnian zat padat dimana zat

tersebut dilarutkan dalam pelarut kemudian dikristalkan kembali. Prinsip

rekristalisasi adalah dua atau lebih senyawa memiliki kelarutan yang berbeda pada

pelarut yang sama. Hanya molekul-molekul yang sama yang mudah masuk dalam

struktur kisi-kisi kristal, sedangkan molekul lain atau pengotor akan tetap berada

pada larutan atau diluar kristalnya. Peristiwa rekristalisasi berhubungan dengan

derajat kejenuhan larutan. Endapat kristal akan terbentuk jika derajat lewat jenuh

larutan tinggi, dimana fase padatnya akan terpisah dari larutannya. Makin tinggi

derajat lewat jenuh, maka makin besar kemungkinan untuk membentuk kristal

(Sastrohamodjojo, 1996 ; Basset et al, 1994).

2.4 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Lipis (KLT) adalah prosedur pemisahan zat terlarut oleh

suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase

yaitu fase diam dan fase gerak, dimana zat penyerap atau fase diam merupakan

lapisan tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik atau logam

secara merata, umumnya digunakan lempeng kaca. Dalam KLT pemisahan

didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis

zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap serta jenis pelarut yang

digunakan (Depkes RI, 1995).

Pada identifikasi piperin pada Piperi nigrum dengan metode KLT terdapat

bercak berwarna biru pada plat KLT, dan setelah disemprot dengan anisaldehida-

asam sulfat LP dan dilihat di bawah sinar UV, terdapat bercak berwarna kuning

kehijauan dengan nilai hRf 27. Nilai Rf dan hRf dihitung dengan rumus berikut :

gerak faseditempuh yangJarak

solutditempuh yangJarak Rf

(Depkes RI, 1980)

hRf = Rf x 100

5

III. ALAT DAN BAHAN

3.1 Alat

1 Set Alat Sokhlet

Beaker Glass

Gelas Ukur

Pipet Tetes

Corong Kaca

Thermometer

Plat KLT

Sinar UV254 dan UV366

Cawan Porselen

Kertas Saring

Chamber

Water bath

3.2 Bahan

Etanol 96%

N-Hexana

Etil asetat

Serbuk Piperis nigri

KOH Alkoholis 10%

IV. PROSEDUR KERJA

4.1 Sokhletasi dan Pembuatan Ekstrak

Ditimbang 10 gram serbuk lada hitam (Piper nigrum L)

Dibungkus dengan kertas saring, kemudian dilakukan Sokhletasi

dengan 100 mL etanol 96%.

Dilakukan Sokhletasi selama kurang lebih 2 jam

(kurang lebih 6x sirkulasi)

Disaring larutan yang diperoleh.

Diuapkan diatas water bath menggunakan cawan porselen

(yang telah ditimbang sebelumnya) hingga didapatkan ekstrak kental.

Ditimbang ekstrak kental yang diperoleh.

6

4.2 Rekristalisasi

Ditambahkan 10 mL KOH-alkoholis 10% kedalam

ekstrak kental sedikit demi sedikit dalam kondisi panas.

Disaring kristal yang terbentuk dengan kertas saring

(yang sebelumnya telah ditimbang bobotnya).

Kertas saring didiamkan pada suhu kamar

di udara terbuka hingga kering.

Bobot kristal yang diperoleh ditimbang

4.3 Identifikasi Piperin dengan KLT

Dilarutkan kristal ke dalam 2 mL etanol 96%.

Dicuci plat KLT silika gel GF254 dengan metanol

dan diaktivasi pada suhu 1100 selama 30 menit.

10 L ditotolkan pada plat KLT silika gel GF254

Plat KLT dimasukkan ke dalam chamber yang telah

Dijenuhkan dengan fase gerak N-hexana : Etil asetat (70 : 30)

Dielusi plat KLT hingga 1 cm dari tepi atas plat.

Plat diangin-anginkan selama 10 menit

Diamati dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm

Ditandai dan dihitung Rf masing-masing spot atau noda yang ada.

7

V. HASIL

Setelah dilakukannya kegiatan praktikum selama kurang lebih tiga minggu

dimana prosesnya merupakan kegiatan ekstraksi dengan metode Sokhletasi,

pemurnian dengan metode Rekristalisasi dan identifikasi dengan Kromatografi

Lapis Tipis. Diperoleh hasil berupa data sebagai berikut :

5.1 Soklhletasi

5.1.1 Tabel Penimbangan

No Nama Bahan JumLah

1 Serbuk Piperis Nigri Fructus 10 gram

2 Etanol 96% 100 mL

3 Cawan Porselen Kosong 72,9 gram

4 Bobot Ekstrak Kental

5.1.2 Tabel Hasi

No Proses Ekstraksi Perubahan

Warna

Waktu

(Menit) Suhu

1 Keadaan Awal Bening 0 72oC

2 Sirkulasi I Hijau Terang 55 87oC

3 Sirkulasi II Hijau Terang 7 91oC

4 Sirkulasi III Hijau Pekat 21 91oC

5 Sirkulasi IV Hijau Pekat* 17 86oC

6 Sirkulasi V Hijau Pekat** 30 89oC

7 Sirkulasi IV Hijau Pekat*** 5 89oC

Keterangan : * = Semakin Pekat

5.2 Rekristalisasi



1 KOH 1 gram

2 Etanol 96 % 10 mL

3 KOH alkoholis 10 % 10 mL

8

4 Kertas Saring Kosong 0,44 gram

5 Botol Vial Kosong 9,80 gram

5.2.2 Tabel Hasil

No Proses Rekristalisasi Hasil

1 Pemekatan Ekstrak Ekstrak kental berwarna

hijau kehitaman.

2 Ekstrak ditambahkan KOH

Alkoholis 10 %

Larutan berwarna hijau

kehitaman.

3 Ekstrak pada kertas saring Terbentuk kerak berwarna

Hijau kecoklatan

4 Ekstrak pada Botol Vial Terbentuk banyak kristal

kecil pada Dinding Vial

5.3 Kromatografi Lapis Tipis



1 Eluen : N-Heksan (70) 7 mL

Etil Asetat (30) 3 mL

Volume Total Eluen 10 mL

2 Penotolan : Fraksi I 10 L

Fraksi II 10 L

5.3.2 Tabel Hasil

No Fraksi & Spot Warna & hRf

UV254 hRf UV366 hRf

1 Fraksi I

Spot 1 Coklat Tua 58 - -

2 Fraksi II

Spot 1 Coklat Tua 26 Biru Muda 38


9






VI. PERHITUNGAN

Setelah dilakukannya kegiatan praktikum selama kurang lebih tiga minggu

dimana prosesnya merupakan kegiatan ekstraksi dengan metode Sokhletasi,

pemurnian dengan metode Rekristalisasi dan identifikasi dengan Kromatografi

Lapis Tipis. Terdapat beberapa perhitungan sebagai berikut :

6.1 Rekristalisasi

Pada proses rekristalisasi, untuk menarik piperin digunakan larutan KOH

Alkoholis 10 %. Dimana akan terjadi proses hidrolisis dan dihasilkan Kristal

Kalium Piperinat dan Piperidin. Pembuatan larutan KOH Alkoholis 10 %

menurut Farmakope Indonesia edisi III menyebutkan, kalium hidroksida

etanol P, larutan kalium hidroksida P 10,0 % dalam etanol (95%)P.

Artinya : Larutan kalium hidroksida P 10 %, terdiri dari 10 gram KOH dalam

100 mL etanol 95%.

10 b v = % 95 Etanol mL 100

KOH gram 10

= % 95 Etanol mL 10

KOH gram 1

6.2 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

6.2.1 Perhitungan Eluen

Dihitung Volume pengukuran eluen yang hendak digunakan saat proses

penjenuhan Chamber dan pengelusian plat KLT, dimana fase gerak yang

digunakan adalah N-Heksana : Etil Asetat dengan perbandingan 70 : 30.

Volume total Eluen yang digunakan adalah 10 mL

10

Jadi pengekurun jumLah masing-masing komponen dari eluen tersebut

adalah sebagai berikut :

N-Heksana = 100

70 x 10 mL = 7 mL

Etil Asetat = 100

30 x 10 mL = 3 mL

6.2.2 Perhitungan Rf dan hRf

Dilakukan proses pengelusian pada plat KLT yang sebelumnya telah

ditotolkan fraksi sebanyak yang dibutuhkan. Diperoleh pemisahan fraksi pada

plat KLT dimana saat dilihat dibawah sinar UV254 dan UV366 diperoleh spot

dengan nilai Rf dan hRf dari hasil pengembahngan dengan jarak

pengembangan 8,6 cm, perhitungannya sebagai berikut :

a. Pada Sinar UV254 :

Rf = gerak faseditempuh yangJarak

solutditempuh yangJarak

dan hRf = 100Rfx

- Fraksi I :

Spot 1 = 58,0cm 6,8

cm 5 hRf = 0,56 x 100 = 56

- Fraksi II :

Spot 1 = 26,0cm 6,8

cm 2,2 hRf = 0,26 x 100 = 26

Spot 2 = 57,0cm 6,8

cm 9,4 hRf = 0,57 x 100 = 57

Spot 3 = 65,0cm 6,8

cm 6,5 hRf = 0,65 x 100 = 65

Spot 4 = 71,0cm 6,8

cm 1,6 hRf = 0,71 x 100 = 71

Spot 5 = 78,0cm 6,8

cm 7,6 hRf = 0,78 x 100 = 78

11

Spot 6 = 84,0cm 6,8

cm 2,7 hRf = 0,84 x 100 = 84

Spot 7 = 87,0cm 6,8

cm 5,7 hRf = 0,87 x 100 = 87

b. Pada Sinar UV366 :

Rf = gerak faseditempuh yangJarak

solutditempuh yangJarak

dan hRf = 100Rfx

- Fraksi I : Tidak ditemukan Spot

- Fraksi II :

Spot 1 = 38,0cm 6,8

cm 3,3 hRf = 0,38 x 100 = 38

Spot 2 = 50,0cm 6,8

cm 3,4 hRf = 0,50 x 100 = 50

Spot 3 = 70,0cm 6,8

cm 1,6 hRf = 0,70 x 100 = 70

Spot 4 = 87,0cm 6,8

cm 5,7 hRf = 0,87 x 100 = 87

VII. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini, praktikan menerapkan metode ekstraksi berupa

Sokhletasi, pemurnian dengn metode Kristalisasi, dan identifikasi dengan metode

Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Dengan metode tersebut diatas, praktikan

mengidentifikasi secara kualitatif kandungan dalam serbuk Piperis nigri Fructus.

Analisis kualitatif merupakan analisis yang bertujuan untuk mengidentifikasi

elemen, spesies, dan/atau senyawa-senyawa yang ada di dalam suatu sampel.

Dengan kata lain, analisis kualitatif berkaitan dengan cara mengetahui ada atau

tidaknya suatu analit yang dimaksud dalam suatu sampel. (Gandjar dan Rohman,

2007)

12

Pada proses awal dilakukan ekstraksi cara panas dengan metode sokhletasi,

senyawa piperin dipisahkan dari senyawa-senyawa lain yang terkandung dalam

serbuk Piperis nigri fructus. Pemilihan metode ekstraksi yang tepat tergantung

dari tekstur dan kandungan air dari bahan tumbuhan yang akan diekstraksi. Jenis

senyawa yang akan diisolasi pada proses ekstraksi juga merupakan syarat penting

yang perlu diperhatikan. Penggunaan metode sokhletasi ini, didasarkan atas sifat

fisikokimia dari serbuk Piperis nigri fruktus yang memiliki titik leleh 128C-

130C (Kusmardiyani, 1992 ; Peter, 2000).

Pada awalnya 10 gram serbuk Piperis nigri fruktus dibungkus dengan dua

lapis kertas saring yang sebelumnya sudah dipotong dengan ukuran yang sesuai

timbel atau extraction chamber (tinggi dan diameter tabung digunakan sebagai

acuan untuk memotong kertas saring). Untuk bahan/sampel yang memiliki bobot

jenis rendah dibuat agar bagian atas kertas saring yang membungkusnya

diusahakan lebih tinggi dari mulut tabung sifon, karena jika tidak demikian dapat

menyebabkan bahan padat yang tidak dikehendaki ikut tertarik ke dalam labu

penampung (Kusmardiyani, 1992). Dimana sampel dibungkus dengan kertas

saring yang bertujuan untuk menyaring dan mencegah senyawa-senyawa padat

yang tidak diinginkan terbawa dan masuk ke dalam labu penampung. Pelarut yang

digunakan untuk mengekstraksi serbuk Piperis nigri fructus adalah etanol 96%

sebanyak 100 mL. Etanol memiliki titik didih yang rendah yaitu 78,5C serta sifat

yang mudah menguap sehingga baik digunakan untuk cairan penyari (pelarut)

dalam proses sokhletasi (Myers, 2007). Selain itu faktor lain yang menentukan

pemilihan etanol sebagai cairan penyari adalah berdasarkan kelarutan dari

senyawa piperin, dimana piperin tidak larut dalam air dan larut dalam 30 bagian

alkohol pada suhu 15C dan dalam 1 bagian alkohol yang dipanaskan (Anggrianti,

2008).

Penentuan volume pelarut berdasarkan volume alat sokhletasi dimana pelarut

yang digunakan harus memiliki volume 1,5 kali volume alat sokhletasi untuk

mencegah habisnya pelarut akibat penguapan. Dalam proses sokhletasi harus

menggunakan pelarut murni agar didapatkan penguapan yang maksimal. Adanya

13

pelarut lain yang tercampur juga akan mempengaruhi sifat fisikokimia bahan

pelarut yang akan mempengaruhi mekanisme penarikan analit dari sampel.

Serbuk Piperis nigri fructus yang telah dibungkus dengan kertas saring

ditempatkan pada timbel/extraction chamber. Kemudian dipasang pada sebuah

labu alas bundar yang berisi pelarut dan batu didih, sedangkan bagian atasnya

dipasang kolom pendingin (kondensor). Batu didih berfungsi untuk menyerap

panas berlebih saat labu alas bundar dipanaskan di atas penangas air. Batu didih

akan menyerap panas melalui pori-porinya sehingga mencegah terjadinya

bumping (letupan gelembung pada permukaan pelarut). Pada saat pelarut (etanol

96%) dididihkan, uap pelarut akan melewati pipa vapor (pipa samping) dari alat

sokhlet dan mengalami pendinginan setelah sampai pada kondensor. Pelarut yang

telah terkondensasi menjadi titik-titik air akan jatuh dan menetes dalam

timbel/extraction chamber dan menyari Piperis nigri fructus. Kemudian pelarut

yang terus menetes lama kelamaan akan mengisi seluruh bagian timbel dan

sebagian ekstrak akan mengalir ke pipa sifon hingga mencapai bagian atas/mulut

pipa sifon. Selanjutnya seluruh bagian ektrak tersebut (pelarut dan piperin yang

terlarut) akan tertarik dan tertampung pada labu penampung/labu tempat

penguapan pelarut akibat adanya daya tekan hidrolik atau cairan yang ada pada

timbel. Proses ini terjadi secara berulang sehingga diperoleh hasil yang

dikehendaki (Kusmardiyani, 1992).

Proses sokhletasi setidaknya dilakukan sebanyak 6-8 kali sirkulasi.

Sedangkan suatu ekstraksi dikatakan sempurna apabila sirkulasi telah mencapai

20-25 kali atau saat dimana pelarut yang mengekstraksi sampel pada

timbel/extraction chamber sudah tidak berwarna (bening). Hal tersebut

menandakan bahwa seluruh piperin dan kandungan lainya (yang dapat terlarut

dalam etanol 96%) dalam sampel tersebut telah dipisahkan seluruhnya dengan

proses ekstraksi. Dalam praktikum kali ini dilakukan sokhletasi sebanyak 6 kali

sirkulasi dengan 100 mL etanol. Sirkulasi I terjadi setelah 55 menit dengan suhu

87o C, sirkulasi II berlangsung setelah 7 menit dengan suhu 91

o C, sirkulasi III

berlangsung setelah 21 menit dengan suhu 91o C, sirkulasi IV berlangsung setelah

14

17 menit dengan suhu 86o C, sirkulasi V berlangsung setelah 30 menit dengan

suhu 89o C, sirkulasi VI berlangsung setelah 5 menit dengan suhu 89

o C.

Sirkulasi I memerlukan waktu yang lebih lama dikarenakan pada sirkulasi

pertama dibutuhkan waktu lebih untuk membuat cairan penyari mendidih sebelum

akhirnya mengalami penguapan (evaporasi). Selain itu proses penjenuhan sampel

oleh uap pelarut dalam tabung sokhletasi memerlukan waktu yang lama.

Kecepatan sirkulasi juga dipengaruhi oleh pemanasan pelarut pada labu didih,

tebal lapisan pembungkus sampel yang hendak diekstraksi (semakin tipis, sirkuasi

semakin cepat), dan pendinginan oleh kondensor dimana semakin rendah suhu

kondensor semakin cepat uap mengalami kondensasi dan berubah menjadi

molekul air sehingga semakin cepat simplisia terbasahi dan semakin cepat pula

laju sirkulasi.

Setelah proses sirkulasi selesai alat sokhlet dibuka dan ekstrak yang telah

tertampung di dalam labu penampung disaring menggunakan kertas saring untuk

memastikan hasil sokhletasi bebas dari pengotor yang tak terlarut atau komponen-

komponen tak terlarut lainya. Selanjutnya ekstrak dipekatkan dengan cara

dipanaskan diatas heater dalam cawan porselen (yang sebelumnya telah ditimbang

terlebih dahulu). Proses pemekatan menggunakan suhu rendah atau suhu yang

berada di bawah titik leleh dari piperin dan di atas titik didih etanol. Dimana

digunakan suhu pemekatan 80oC. Suhu tersebut brada diatas titik didih etanol

sehingga etanol dapat menguap dan suhu tersebut berada dibawah titik didih

piperin. Dimana piperin memiliki titik leleh 128C-130C (Peter, 2000).

Setelah diperoleh ekstrak kental, dilakukan proses rekristalisasi terhadap

ekstrak Piperis nigri fructus. Proses ini dilakukan untuk memperoleh senyawa

piperin yang lebih murni dalam bentuk padatan kristal. Dimana proses

rekristalisasi terjadi akibat senyawa-senyawa yang terkandung dalam sampel

memiliki kelarutan yang berbeda pada pelarut yang sama (Bassetet al, 1994).

Prinsip dari proses rekristalisasi yaitu dua atau lebih senyawa memiliki kelarutan

yang berbeda pada pelarut yang sama, dimana pada suhu tinggi senyawa-senyawa

tersebut akan terlarut sempurna akan tetapi pada suhu rendah derajat lewat jenuh

dari pelarutnya akan meningkat sehingga senyawa yang rendah kelarutanya akan

15

telepas dan senyawa-senyawa yang sama akan masuk ke dalam struktur latik

kristalnya(kisi-kisi kristal), sedangkan pengotor (struktur yang berbeda dengan

latik kristal) akan tetap di dalam larutan atau berada di luar struktur kristalnya.

Dapat dikatakan bahwa peristiwa rekristalisasi berhubungan dengan derajat

kejenuhan larutan. Endapat kristal akan terbentuk jika derajat lewat jenuh larutan

tinggi, dimana fase padatnya akan terpisah dari larutannya. Makin tinggi derajat

lewat jenuh, maka makin besar kemungkinan untuk membentuk kristal

(Sastrohamodjojo, 1996 ; Basset et al, 1994).

Rekristalisasi dilakukan dengan penambahan KOH alkoholis 10%.

Penambahan larutan KOH dalam etanol 95% ini bertujuan untuk memperoleh

piperin dari ekstrak pekat. Dimana di dalam ekstrak tersebut terdapat komponen

lain ketika ditambahkan KOH alkoholis menyebabkan piperin yang ada dalam

ekstrak tersebut terhidrolisis menjadi kristal kalium piperinat yang berupa garam

hasil hidrolisis dan piperidin yang merupakan bentuk basa bebasnya. Jadi

penambahan larutan KOH alkoholis 10% ini bertujuan untuk mengisolasi

senyawa piperin sehingga diperoleh hasil yang lebih murni (Lisnawati, 2004).

Dalam keadaan panas, ekstrak kental ditambah dengan KOH alkoholis 10%

sedikit demi sedikit dan diaduk perlahan agar tidak terbentuk kristal-kristal kecil

yang dapat mengabsorpsi pengotor sehingga pengotor tidak masuk ke struktur

kristal. Ditambahkannya KOH alkoholis 10% dalam keadaan panas karena garam

hasil hidrolisisnya dapat larut dalam alkohol pada keadaan panas dan pengotor

tidak akan ikut terlarut. Setelah diaduk secara perlahan lalu disaring dengan kertas

saring yang sebelumnya telah ditimbang dan diteteskan dengan etanol 95% untuk

menghilangkan zat-zat pengotor yang terdapat di kertas saring. Kertas saring

didiamkan pada suhu kamar hingga kering. Campuran yang disaring juga

ditempatkan pada vial yang sebelumnya telah ditimbang. Kemudian didiamkan

beberapa waktu hingga terbentuk kristal.

Setelah kurang-lebih satu minggu, diperoleh hasil berupa kerak berwarna

hijau kecoklatan pada kertas saring dan kristal-kristal kecil dalam jumlah banyak

pada dinding botol vial. Setelah dihitung, pada kertas saring diperoleh kristal

dengan bobot 0,76 gram. Sedangkan pada botol vial diperoleh kristal berbentuk

16

jarum dengan bobot 1,88 gram. Setelah diperoleh kristal dengan bobot diatas.

Dilakukan tahapn identifikasi, dimana bertujuan untuk memastikan kemurnian

dari kristal yang diperoleh dan menetapkan apakah kristal tersebut merupakan

kristal hasil hidrolisis piperin atau bukan. Proses identifikasinya dilakukan dengan

menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

Kromatografi Lapis Lipis (KLT) adalah prosedur pemisahan zat terlarut oleh

suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase

yaitu fase diam dan fase gerak, dimana zat penyerap atau fase diam merupakan

lapisan tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik atau logam

secara merata, umumnya digunakan lempeng kaca. Dalam KLT pemisahan

didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis

zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap serta jenis pelarut yang

digunakan (Depkes RI, 1995). Digunakan metode Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) karena pada umumnya KLT lebih bermanfaat untuk tujuan identifikasi

karena mudah dan sederhana. Selain itu, keuntungan metode KLT yang lainnya,

antara lain : waktu pemisahannya lebih cepat, sensitif meskipun jumlah cuplikan

sedikit masih bisa dideteksi, daya resolusinya tinggi sehingga pemisahannya lebih

sempurna, banyak digunakan untuk tujuan analisis, identifikasi pemisahan

komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi atau dengan

radiasi menggunakan UV, dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending),

menurun (descending), atau dengan cara elusi dua dimensi, serta ketepatan

penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan

merupakan bercak yang tidak bergerak (Gandjar dan Rohman, 2007).

Kristal yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan etanol 96% sebanyak 2

mL, karena kristal yang didapat sangat sedikit. Digunakan etanol 96% karena

piperin larut dalam tiga puluh bagian etanol (Depkes RI, 1980). Selain itu

penggunaan etanol 96% adalah untuk melarutkan kembali kristal sehingga didapat

filtrat piperin yang murni. Fase diam yang digunakan berupa Silika gel GF254,

yang merupakan plat alumunium yang diberikan adsorben berupa silika gel yang

berisi pengikat (gypsum) yaitu kalsium sulfat dan ditambahkan bahan yang

berfluoresensi dengan panjang gelombang eksitasi senyawa berfosforisensi adalah

17

254 nm. Silika gel GF254 ini bersifat polar. Selain itu, digunakannya silika gel

GF254 ini juga karena silika gel merupakan fase diam yang umunya digunakan

untuk menjerap alkaloid. Dimana piperin merupakan senyawa alkaloid (Gandjar

dan Rohman, 2007).

Adapun cara pemotongan plat silika gel GF254 adalah; plat dialasi dengan

kertas, pemotongan plat harus dalam keadaan terbalik (bagian silika berada di

bagian bawah) untuk mencegah plat agar tidak rusak karena ditekan pada saat

pemotongan. Pemotongan harus lurus karena akan berpengaruh pada proses elusi

nantinya. Pada praktikum kali ini, plat dipotong dengan ukuran P x L adalah 10

cm x 3 cm. Kemudian setelah dipotong, plat silika gel GF254 dicuci terlebih

dahulu dengan metanol. Tujuan pencucian ialah untuk menghilangkan pengotor

pada plat KLT. Pemilihan metanol (CH3OH) sebagai larutuna untuk mencuci

karena memiliki sisi yang polar (OH) dan non polar (CH3) dimana dapat menarik

senyawa polar dan nonpolar sekaligus pada permukaan plat yang mungkin

mengkontaminasi saat proses penyimpana. Selin itu juga metanol memiliki sifat

yang mudah menguap sehingga dapat dihilangkan dengan mudah setelah proses

pencucian. Sebelum sampel ditotolkan, plat KLT diaktivasi pada suhu 110C

dalam waktu 30 menit dengan tujuan menjaga kelembaban plat sehingga struktur

dari silika gel pada plat stabil dan tetap (tidak terlepas dari plat atau retak).

Aktivasi plat selama 30 menit dengan suhu yang dijaga dilakukan agar tidak

terjadi pengelupasan plat akibat pemutusan gugus OH pada plat silika gel GF254

(SiOH). Selain itu pemanasan juga dilakukan untuk menghilangkan metanol sisa

pencucian. Silika gel adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon

dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada

permukaan gel silika, atom silikon berikatan dengan gugus -OH. Sehingga dapat

membentuk ikatan dengan air yang ada di udara. Kadar air pada plat KLT harus

20% 30%, karena apabila kadar air dalam plat kurang dari 20 % maka plat akan

retak dan rusak, sedangkan apabila kadar air dalam plat lebih dari 30% maka

dapat mengganggu proses pengelusian. Pemilihan suhu dan lama proses aktivasi

plat ini berdasarkan kondisi yang optimum untuk proses pengaktivasian plat

(Gritter et al, 1991).

18

Fase gerak yang digunakan dalam metode ini adalah N-heksana dan etil asetat

dengan perbandingan (70:30). Fungsi N-Heksana dan etil asetat adalah sebagai

campuran pelarut yang digunakan untuk membawa analit saat proses elusi.

Pemilihan fase gerak ini didasarkan pada sifat kepolaran fase gerak yang sama

dengan piperin yaitu bersifat cenderung nonpolar yang dapat diketahui dari

struktur senyawa piperin yang tidak mengandung gugus -OH, sehingga fase gerak

akan dapat mengelusi analit dengan optimal sesuai dengan prinsip like dissolve

like. N-heksana merupakan senyawa benzene yang bersifat non polar, sedangkan

etil asetat merupakan senyawa yang sedikit polar. Dimana untuk pemisahan

dengan menggunakan fase diam polar, penambahan pelarut yang bersifat sedikit

polar ke dalam pelarut non polar akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.

Hasil pemisahan yang baik sangat ditentukan oleh pemilihan fase gerak dimana

fase gerak daya elusinya harus dapat ditentukan dari harga Rf yang terletak antara

0,2 0,8 (Gandjar dan Rohman, 2007).

Penotolan plat dengan larutan piperin hasil pelarutan kristal akan optimal

dengan penotolan yang sekecil dan sesempit mungkin, karena jika terlalu banyak

akan menurunkan resolusi. Dilakukan penotolan dua fraksi sampel. Fraksi I

merupakan sampel dari kerak hasil saringan pada kertas saring sedangkan fraksi II

merupakan hasil pelarutan kreistal pada botol vial. Setiap kali penotolan

dilakukan pengeringan antar totolan agar bercak tidak menyebar. Pada kegiatan

dengan metode KLT ini penotolan dilakukan menggunakan pipa kapiler 2L

hingga didapat satu titik penotolan memiliki 10L filtrat. Semakin kecil ukuran

rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam maka

semakin baik kinerja KLT dalam hal efesiensinya dan resolusinya (Gandjar dan

Rohman, 2007).

Kemudian plat dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan

menggunakan fase gerak dengan kertas saring. Kertas saring yang digunakan

harus memiliki tinggi yang sama dengan chamber agar proses penjenuhannya

sempurna. Fungsi penjenuhan ini adalah untuk mengoptimalkan proses

pengembangan fase gerak dengan pemerataan penguapan sehingga udara di dalam

chamber tetap jenuh. Penggunaan kertas saring dalam penjenuhan adalah untuk

19

memperluas bidang penjenuhan dan sebagai indikator bahwa chamber telah jenuh

ketika fase gerak telah mencapai ujung atas kertas saring. Selain itu, kertas saring

digunakan karena dapat mempercepat proses penjenuhan. Chamber ditutup

dengan rapat agar dengan volume fase gerak yang sedikit tetapi dapat mengelusi

sampai ketinggian jarak pengelusian yang diinginkan atau ditentukan (Gandjar

dan Rohman, 2007).

Setelah pengelusian selesai, plat diangin-anginkan selama 10 menit yang

bertujuan menghilangkan fase gerak pada plat agar tidak mengganggu proses

pengamatan di bawah sinar UV, karena plat yang basah akan menyebabkan

pemadaman di bawah sinar UV. Kemudian hasil elusi diamati pada sinar UV254

dan UV366. Berdasarkan pustaka, piperin ketika diamati di bawah sinar UV254 nm

akan memberikan harga hRf 27. Sedangkan pada UV dengan panjang gelombang

366 nm akan menunjukkan warna biru dengan harga hRf 30-33 dan 35-38

(Depkes RI, 1980).

Pengamatan yang dilakukan pada plat KLT silika gel GF 254 di bawah sinar

UV dengan panjang gelombang 254 nm, didapatkan satu spot pada Fraksi I

dengan harga Rf: 0,58 dan harga hRf 58. Tujuh spot untuk fraksi II dengan harga

Rf 0,26-0,87 dan harga hRf dari 26-87. Dengan menggunakan plat KLT silika gel

GF254, plat mengalami fluoresensi berwarna hijau untuk memperkuat pemunculan

warna spot sehingga spot yang terlihat pada plat berwarna gelap (coklat tua) atau

terjadi pemadaman fluoresensi (bercak) pada spot (Stahl, 1985).

Sedangkan pengamatan yang dilakukan di bawah sinar UV dengan panjang

gelombang 366 nm diperoleh harga Rf 0,38; 0,5; 0,7; 0,87 dan hRf 38, 50, 70, 87.

Dari pengamatan, nilai hRf yang dihasilkan pada pengamatan mendekati dengan

pustaka yang memberikan harga hRf 35-38. Selain itu, terjadinya fluoresensi biru

muda pada spot yang ada memperkuat hasil mengenai adanya senyawa piperin

pada serbuk simplisia Piperis nigris fructus. Adanya perbedaan hasil hRf pada

spot lainya dengan hasil pada pustaka disebabkan oleh beberapa hal, yaitu kondisi

praktikum yang tidak sama, dimana suhu ruangan atau kelembaban laboratorium

yang digunakan saat praktikum berbeda dengan suhu dan kelembapan pada

literatur; besar kecilnya bercak penotolan; kemungkinan masih adanya pengotor

20

baik pada filtrat yang diuji ataupun pada plat KLT yang digunakan akibat kurang

optimalnya proses pencucian dan pengaktivasian; selain itu eluen yang digunakan

berbeda, pada pustaka eluen yang digunakan adalah etil asetat dan P-benzen

sedangkan praktikan menggunakan eluen N-Heksana dan etil asetat P (Depkes RI,

1980).

VIII. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil pengamatan pemisahan dan identifikasi piperin dari Piperis

nigri Fructus, didapat beberapa kesimpulan sebagai berikut :

8.1 Metode Sokhletasi dapat diterapkan pada simplisia yang tahan terhadap

pemanasan, dimana menggunakan pelarut yang relatif sedikit dan sesuai

secara berkesinambungan untuk memperoleh senyawa dalam bentuk ekstrak

kentalnya yang berwarna hijau kecoklatan. Dalam hal ini piperin merupakan

senyawa yang tahan terhadap pemanasan dengan titik leleh 128C-130C.

8.2 Rekristalisasi digunakan untuk memurnikan senyawa piperin sehingga

memperoleh kristal kalium piperinat dan piperidin dengan prinsip kelarutan

yang berbeda pada pelarut yang sama serta kesamaan struktur yang membuat

piperin dapat menyatu membentuk kisi-kisi kristal.

8.3 Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) diterapkan sebagai uji identifikasi

senyawa piperin dengan parameter yang digunakan adalah harga Rf.

Identifikasi senyawa piperin pada serbuk simplisia Piperis nigri Fructus

memberikan hasil yang positif dengan adanya bercak fluoresensi biru pada

UV366. Namun pada praktikum kali ini harga hRf tidak sesuai dengan harga

hRf yang terdapat pada pustaka. Faktor-faktor yang mungkin mempengaruhi

diantaranya suhu ruangan atau kelembaban laboratorium yang digunakan saat

praktikum berbeda, besar kecilnya bercak penotolan, kemungkinan masih

adanya pengotor baik pada filtrat yang diuji ataupun pada plat KLT yang

digunakan akibat kurang optimalnya proses pencucian dan pengaktivasian,

selain itu eluen yang digunakan berbeda.

21

DAFTAR PUSTAKA

Anggrianti, Padmi. 2008. Uji Sitotoksik Esktrak etanol 70% Buah Kemukus

(Pipercubeba L) terhadap sel Hela. Surakarta : Fakulats Farmasi

UNMUH.

Basset, J, R.C. Denny, G.H. Jeffery, J. Mendham. 1994. Buku Ajar Vogel Kimia

Analisis Kuantitatif Anorganik,. Jakarta : Buku Kedokteran EGC.

Depkes RI. . 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta : Direktorat Jendral

Pengawasan Obat dan Makanan. Hal. 1004.

Depkes RI. 1980. Materia Medika Indonesia Jilid IV.Jakarta : Direktorat jendral

Pengawasan Obat dan Makanan

Gritter, R. J., dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : Penerbit ITB.

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. Terbitan ke-2. Bandung : Penerjemah, Padmawinata, K.

Penerbit ITB.

Kusmardiyani, Siti & Asari Nawawi. 1992. Petunjuk Laboratorium Kimia Bahan

Alam. Jakarta : Pusat Antar Universitas Bidang Ilmu Hayati.

Lisnawati.2004. Isolasi dan Karakterisasi Piperin dan Lada Hitam.Banjarmasin :

FKIP UNLAM.

Myers, Richard L. 2007. The 100 Most Important chemical Compound. USA:

Greenwood Press.

Peter, K.V. 2000. Handbook of Herb Spices. Volume 1. England: Woodhead

Publishing Limited.

Sastrohamodjojo, Hardjono. 1996. Sumber Bahan Alam. Yogyakarta : Universitas

Gadjah Mada Press.

22

Septiatin, Eatin. 2008. Apotek Hidup dari Rempah-rempah, Tanaman Hias dan

Tanaman Liar. Bandung : CV. Yarama Widya.

Stahl, Egon. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Bandung

: Intitut Teknologi Bandung.

Tjitrosoepomo, Gembong. 2010. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta).

Yogyakarta : Universitas Gadjah Mada Press.

23

LAMPIRAN

Proses Sokhletasi (kiri); Penyaringan Ekstrak (tengah); Pemerasan Ampas (kanan)

Kerak Kristal (kiri); Berat Kristal Pada Vial (tengah); Kristal Kecil Vial (kanan)

24

Gambar Spot pada Plat KLT dalam Sinar UV254 (kiri) & UV366 (kanan)

Spot pada Sinar UV254 (kiri) ; Plat KLT GF254 (tengah) ; Spot pada UV366 (kanan)

laporan akhir metode pemisahan sokletasi - identifikasi piperin

Documents