PERCOBAAN V

Judul : Pemisahan Pigmen dari Tanaman

Tujuan : Pada akhir percobaan ini mahasiswa harus paham mengenai

1. Cara kerja dan teknik-teknik isolasi tumbuhan.

2. Pengenalan isolasi bahan alam yang bermolekul besar.

3. Analisa senyawa bahan alam (berwarna) dengan menggunakan

KLT dan kromatografi kolom

Hari/tanggal : Rabu / 7 Mei 2014

Tempat : Laboratorium Kimia PMIPA FKIP UNLAM Banjarmasin

I. DASAR TEORI

Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang,

umumnya berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi

cahaya matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya

berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri

(misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ

fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun.

Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen)

antara lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun

klorofil mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya

adalah non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut

non polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan

klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid

pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih polar

dibandingkan klorofil a. Adapun struktur dari kedua jenis klorofil ini adalah sebagai

berikut :

Gambar Struktur klorofil a

Gambar Struktur klorofil b

Karoten C40H56 adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari sistem ikatan

rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% betakaroten dan 10 %

alpha karoten. Meskipun secara keseluruhan molekul karoten adalah non polar,

akan tetapi mempunyai sifat dapat mengubah bidang polarisasi. Karoten juga ada

dua jenis yaitu a-karoten dan β-karoten, yang membedakan kedua struktur ini

adalah posisi ikatan rangkap pada cincin ujung. Adapun strukturnya adalah sebagai

berikut :

Gambar Struktur α-karoten

Gambar Struktur β-karoten

Xantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan

xantofil dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih

larut dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten.

Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil

memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah

sebagai berikut :

Gambar Struktur xantofil

Selain itu, di dalam daun juga mengandung antosianin yang berwarna merah,

biru atau ungu tergantung derajat keasamannya. Untuk mengekstraksi pigmen dari

daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan dengan mortar terhadap daun kering

sampai halus. Pelarut yang dapat mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan

urutan kepolaran yaitu petroleum eter, kloroform, etanol, dan metanol. Adapun

struktur umum dari antosianin adalah sebagai berikut :

Gambar Struktur umum antosianin

Adapun salah satu teknik pemisahan pigmen dari tanaman adalah dengan

menggunakan kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan teknik

kromatografi yang paling awal ditemukan dari mekanismenya, kromatografi kolom

merupakan terapan atau absobsi yang tidak boleh larut dalam fasa gerak, ukuran

partikel fasa diam harus seragam. Zat pengotor yang terdapat pada fasa diam dapat

menyebabkan absobsi tidak reversible sebagai fasa diam digunakan alumina, silika

gel, arang, bauksit, magnesium karbonat, kalsium karbonat, talk, pati, sekelator,

gula dan tanah diatom. Fasa gerak pada kromatografi kolom dapat berupa pelarut

tunggal atau campuran beberapa pelarut polar dan nonpolar. Umumnya senyawa

nonpolar dengan berat molekul lebih cepat meninggalkan fasa diam (Soebagio,

2000:81-82).

Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen pigmen warna

dari daun. Pada kromatografi kolom ini digunakan kolom dengan adsorben silika

gel karena kolom yang dibentuk dengan silica gel memiliki tekstur dan struktur

yang lebih kompak dan teratur. Silika gel dalam bentuk tetrahedral raksasa,

sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu

menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal.

Daun Sirih Merah

Tumbuhan sirih merah (Piper

porphyrophyllum N.E.Br.) digunakan

dalam berbagai jenis pengobatan di

Malaysia seperti pada pengobatan sakit

kepala dan sakit tulang, dada sesak, lepra,

sakit perut pada anak-anak, untuk wanita

setelah melahirkan, serta untuk penyakit kulit yg disebut ‘sopak’. Tumbuhan ini

ditemukan pada saat pengobatan gajah yang terluka akibat terkena tembakan

(Burkill, 1935).

Adapun kandungan dari daun sirih merah yang berhubungan dengan pigmen

warnanya adalah sebagai berikut:

1. Flavonoid

Flavonoid berfungsi sebagai pigmen pemberi warna pada bunga dan buah.

Flavonoid yang termasuk antosianidin adalah berwarna merah, biru, dan ungu.

Flavonoid juga terdapat pada daun, yaitu sebagai pelindung pada tumbuhan

untuk melawan pengaruh buruk radiasi ultraviolet.

2. Antosianin

Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan tersebar luas dalam

tumbuhan, digunakan sebagai pembentuk dasar pigmen merah, ungu dan biru pada

tanaman, terutama sebagai ewarna bunga dan buah-buahan. Antosianidin yang

paling umum adalah sianidin yang menyebabkan warna merah lembayung

3. Khalkon

Khalkon merupakan pigmen fenol kuning yang berwarna coklat kuat dengan sinar

ultraviolet bila dikromatografi kertas dan di uapi dengan ammonia maka warnanya

berubah atau tetap. Khalkon menunjukkan puncak yang lebar antara 365-390 nm

didaerah spektrum tampak.

II. ALAT DAN BAHAN

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini, antara lain :

1. Kolom konvensional :1 buah

2. Gelas ukur 10 ml : 4 buah

3. Gelas ukur 50 ml : 1 buah

4. Gelas kimia 100 ml : 2 buah

5. Gelas kimia 200 ml : 1 buah

6. Corong biasa : 1 buah

7. Batang pengaduk : 1 buah

8. Spatula : 1 buah

9. Tabung reaksi : 4 buah

10. Rak tabung reaksi : 1 buah

11. Pipet tetes : 4 buah

12. Lumpang dan alu : 1 buah

13. Statif dan klem : 1 buah

14. Rotatory evaporator : 1 buah

15. Gunting : 1 buah

16. Lampu UV : 1 buah

17. Erlenmeyer : 1 buah

18. Hair dryer : 1 buah

Bahan-bahan yang diperlukan dalam percobaan ini, antara lain :

1. Sampel daun sirih merah (Piper porphyrophyllum N.E.Br.)

2. Glass wool

3. Sebuk Al2O3 (alumina)

4. Kertas saring

5. Petroleum benzena

6. Kloroform

7. Metanol

8. Etanol

9. Plat KLT silika gel

10. Pipa kapiler

III. PROSEDUR KERJA

A. Ekstraksi Sampel

1. Melumatkan 10-15 lembar sampel daun dengan lumpang dan alu.

2. Menambahkan 20 mL etanol, mengaduk sampai merata.

3. Menyaring larutan sampel dengan kertas saring melalui corong.

4. Memekatkan larutan dengan menggunakan rotavapor sampai larutan tinggal

setengah mL.

B. Pembuatan Kromatografi Kolom

1. Menyiapkan kolom gelas 50 mL, tinggi 20 cm dan diameternya 1,5 cm.

yang bagian bawahnya telah dilengkapi dengan kran.

2. Memasukkan glass wool kedalam kolom gelas hingga setinggi 1 cm.

3. Melalui corong menuangkan etanol ke dalam kolom hingga setinggi 1 cm.

4. Membuat adonan dari 25 g alumina (Al2O3) dengan 25 mL etanol.

5. Memasukkan adonan tersebut ke dalam kolom hingga setinggi 10 cm sambil

mengetuk-ngetuk dengan kran dalam keadaan terbuka, serta secara sedikit

demi sedikit (jangan ada gelembung udara).

6. Mengelusi kembali kolom dengan pelarut hingga mencapai permukaan

alumina dalam kolom dan memasukkan glass wool.

C. Pemisahan Pigmen dari Tumbuhan

1. Membuka kran dan membiarkan pelarut (etanol) turun hingga mendekati

penyerap (adonan Al2O3).

2. Memasukkan larutan sampel daun setinggi 2 cm setelah permukaan pelarut

etanol turun mendekati penyerap (adonan Al2O3).

3. Segera mengelusikan kolom dengan pelarut secara bertahap sesuai dengan

kepolarannya yaitu petroleum benzena, kloroform, etanol dan metanol. Jika

permukaan sampel telah mendekati permukaan penyerap.

4. Menampung tetesan yang keluar dari kolom dengan beberapa tabung reaksi

yang bersih.

5. Menghentikan pemberian pelarut bila semua warna telah keluar dari kolom

kaca.

6. Melakukan proses KLT dengan larutan pengembang yang sesuai.

IV. HASIL PENGAMATAN

No. Perlakuan Hasil Pengamatan

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Menggerus 10 lembar daun sirih

merah dan menambahkan 20 mL

etanol

Menyaring dengan corong

Memekatkan filtrat dengan

rotavapor

Mengkromatografi kolom dengan

empat pelarut

Perbandingan eluen dalam KLT

Petroleum benzen : kloroform :

etanol : metanol ( 2 mL : 2 mL : 2

mL : 2 mL)

Melakukan KLT, menyinari dengan

lampu/sinar UV dan menghitung

nilai Rf

Rf 1 : pelarut petroleum benzen

Rf 2 : pelarut kloroform

Rf 3 : pelarut etanol

Rf 4 : pelarut metanol

Campuran

Filtrat : ekstrak daun sirih merah

Residu : ampas daun sirih merah

Ekstrak pekat

Petroleum benzen : larutan bening

Kloroform : larutan bening

Etanol : larutan bening

Metanol : larutan berbias hijau

kekuningan

Gelas jenuh akan eluen

Nilai Rf :

Rf 1 : -

Rf 2 : -

Rf 3 : 4,28

=0,525

Rf 4 : 4,48

=0,55

V. ANALISIS DATA

Pada percobaan ini dilakukan pemisahan pigmen dari sampel daun, yaitu daun

sirih merah menggunakan kromatografi kolom dengan beberapa pelarut yaitu

petroleum benzen, kloroform, metanol, dan etanol. Setelah itu menguji masing-

masing ekstrak pelarut dari masing-masing sampel daun dengan metode KLT untuk

menentukan jenis pigmen yang terkandung dalam daun tersebut.

A. Ekstraksi Sampel Daun

Pertama-tama melumatkan sampel daun dengan lumpang dan alu, lalu

mengekstraksinya dengan menggunakan pelarut etanol. Pelumatan ini bertujuan

menghaluskan daun sehingga senyawa yang terkandung di dalamnya mudah larut

dalam pelarut etanol, sebab semakin halus daun maka semakin luas permukaan

untuk terjadi kontak dengan pelarut maka semakin banyak zat yang dapat

terekstrak. Etanol efektif untuk mengekstrak pigmen tumbuhan karena sebagian

besar pigmen tumbuhan seperti klorofil, karoten, dan xantofil memiliki sifat

diantara polar dan non polar sehingga dapat larut dalam etanol yang merupakan

pelarut semipolar. Namun proses ekstraksi ini harus dilakukan dengan cepat

karena enzim klorofilasi yang terkandung dalam daun segar akan mengkatalisis

reaksi antara klorofil dengan etanol sehingga jumlah klorofil dalam daun akan

berkurang. Reaksinya adalah sebagai berikut.

Etanol + klorofil → fitol + etil klorofilida

Setelah itu dilakukan penyaringan agar diperoleh filtrat yang mengandung

pigmen tanaman, sedangkan residunya dibuang. Larutan hasil ekstrak dengan

etanol ini, selanjutnya dipekatkan hingga separuh volume mula-mula.

B. Penyiapan Kolom Kromatografi

Selanjutnya membuat kolom kromatografi, dimana langkah pertama yang

dilakukan adalah membuat adonan Al2O3 dengan pelarut etanol sehingga

terbentuk adonan alumina. Penggunaan etanol ini dikarenakan alumina

mengandung titik aktif Al-OH sehingga etanol yang juga mengandung gugus OH

akan dapat terikat kuat dengan alumina jadi adonan alumina yang merupakan fase

diam akan lebih homogen. Adonan alumina dimasukkan ke dalam kolom sambil

mengetuk-ngetuk kolomnya agar tidak terbentuk gelembung udara, kolom harus

bebas dari gelembung gas karena bila ada gelembung udara maka proses

pemisahan yang terjadi tidak akan sempurna sehingga akan terjadi penyebaran

noda ketika hasil kromatografi kolom di uji KLT.

Dalam hal ini alumina Al2O3 yang digunakan sebagai adsorben atau fase

diamnya, karena Al2O3 lazim digunakan untuk senyawa organik stabil. Selain itu,

sebelum dimasukkan alumina, bagian bawah kolom ditutupi dengan glass woll,

hal ini bertujuan untuk menahan fase diam (adsorben) alumina agar tidak turun

dari kolom karena glass woll merupakan gelas yang masih berpori sehingga dapat

menahan alumina, tetapi ekstrak daun masih bisa mengalir.

Saat mengisi kolom, kran dibuka agar pelarut etanol dapat keluar sehingga

diperoleh fase diam (alumina) yang padat. Setelah itu bagain atas kolom juga

diberi glass woll agar ekstrak daun yang akan dimasukkan ke dalam kolom dapat

tersaring. Selanjutnya memasukkan kembali etanol untuk mengelusi kolom dan

setelah selesai, kran kolom ditutup.

C. Pemisahan Pigmen Daun Sirih Merah

Setelah kolom kromatografi siap dipakai, ekstrak sampel daun di masukkan

ke dalam kolom. Lalu memasukkan pelarut ke dalam kolom dan membuka

krannya. Di sini terlihat bahwa pigmen dari sampel daun mulai bergerak turun dan

mulai menetes. Tetesan yang keluar dari kolom ini ditampung dalam tabung reaksi

dan mengganti tabung reaksinya ketika warna yang keluar dari kolom berubah.

Larutan berawarna ini adalah pigmen dari daun sampel. Adapun pelarut yang

digunakan adalah berdasarkan kepolaran yang paling kecil yaitu petroleum

benzen, kloroform, etanol dan metanol. Pelarut ini digunakan pada kromatografi

kolom secara berurutan.

Prinsip pemisahan dalam kolom tersebut adalah sebagai berikut. Kita

misalkan di dalam suatu ekstrak daun terdapat klorofil, ketika petroleum benzen

kita masukkan ke dalam kolom, klorofil dalam ekstrak daun akan larut di

dalamnya dengan kecepatan yang sama dengan fase geraknya (petroleum benzen)

dan keluar paling pertama, berarti klorofil tidak teradsorpsi dengan kuat pada

alumina. Ini dapat terjadi karena alumina adalah senyawa polar sedangkan klorofil

adalah senyawa yang tergolong non polar. Karoten yang merupakan senyawa

yang lebih polar daripada klorofil, akan keluar dari kolom lebih lambat

dibandingkan klorofil karena karoten akan teradsorbsi lebih kuat dari pada

klorofil. Untuk itulah digunakan pelarut berikutnya yang lebih polar dibandingkan

petroleum benzen yaitu kloroform agar karoten dapat keluar dari kolom dengan

lebih cepat namun dengan catatan klorofil sudah keluar seluruhnya. Begitu pula

seterusnya digunakan pelarut etanol dan metanol untuk mengeluarkan pigmen

yang lebih polar seperti xantofil.

Berdasarkan percobaan, dari proses kromatografi kolom dihasilkan empat

fraksi. Pada tabung dengan pelarut petroleum benzen didapatkan larutan bening.

Pada tabung dengan pelarut kloroform menghasilkan larutan bening. Tabung

dengan pelarut etanol menghasilkan larutan bening dan pada tabung dengan

pelarut metanol menghasilkan larutan yang berwarna bias hijau kekuningan.

Warna bias hijau kekuningan yang dihasilkan pada pelarut metanol menunjukkan

bahwa sampel daun sirih merah mengandung xantofil karena xantofil merupakan

senyawa yang berwarna kuning.

Pada pelarut petroleum benzen dan kloroform tidak menimbulkan larutan

hijau. Hal ini mungkin disebabkan oleh kesalahan penggunaan pelarut yang mana

pelarut yang seharusnya adalah pelarut petroleum eter sedangkan yang digunakan

pada percobaan adalah petroleum benzen. Sedangkan untuk pelarut kloroform

dikarenakan pigmen klorofil yang telah bercampur pada fraksi metanol. Xantofil

dapat larut ke dalam pelarut metanol dikarenakan xantofil bersifat polar sehingga

larut dalam pelarut polar.

Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa jenis pigmen dalam sampel

daun sirih merah untuk fraksi metanol adalah xantofil sedangkan fraksi yang

lainnya tidak mengandung pigmen.

Berdasarkan percobaan untuk uji KLT, nilai Rf untuk fraksi (metanol) yang

mengandung xantofil adalah 0,55. Adapun menurut literatur harga Rf standar

untuk fraksi (metanol) yang mengandung xantofil adalah 0,767.

Dalam hal ini berdasarkan uji KLT terdapat perbedaan harga Rf standar dan

hasil percobaan. Hal ini mungkin disebabkan pergantian tabung reaksi untuk

penampungan tidak dilakukan berdasarkan waktu tertentu atau sampai pelarut

tidak menetes lagi, melainkan berdasarkan warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan

kurang spesifik karena mata memiliki keterbatasan dalam menentukan warna jadi

kemungkinan ada fraksi yang tercampur.

VI. KESIMPULAN

1. Pada percobaan pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman

dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk

melarutkan pigmen sampel daun.

2. Pemisahan menggunakan kromatografi kolom yang fase diam berupa alumina

dan fase gerak yaitu petroleum benzen, kloroform, metanol dan etanol.

3. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju turun

masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan

adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa diam.

4. Berdasarkan percobaan, daun sirih merah mengandung xantofil (berdasarkan

uji KLT) dengan nilai Rf nya 0,55.

DAFTAR PUSTAKA

Anwar, Chairil, dkk. 1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Yogyakarta :

Depdikbud.

Gritter, J., dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : ITB.

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan

Elektroforesis Modern. Bandung : Remaja Rosdakarya.

Rilia Iriani dan Syahmani. 2012. Petunjuk Praktikum Kimia Organik. Banjarmasin :

FKIP UNLAM.

Robinson, Trevon. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : ITB.

Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. Malang : JICA.

Underwood, A.L., dkk. 2002. Analitik Kimia Kuantitatif. Edisi Keenam. Jakarta :

Erlangga.

LAMPIRAN

Perhitungan

Rumus harga Rf ¿jarak tempuhkomponen

jarak tempuh eluen

a. Etanol

Rf ¿4,28

=0,525

Jadi, harga Rf untuk pelarut etanol adalah sebesar 0,525

b. Metanol

Rf ¿4,48

=0,55

Jadi, harga Rf untuk pelarut metanol adalah sebesar 0,55

Pertanyaan

1. Mengapa tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam

kolom ?

2. Identifikasi pigmen apa saja yang keluar dari kolom secara berurutan dan

jelaskan mengapa terjadi demikian ?

3. Apakah teknik yang anda lakukan berhasil memisahkan pigmen seperti yang

diinginkan ?

Jawaban

1. Tidak boleh ada gelembung udara dalam timbunan penyerap di dalam kolom

karena dapat mengakibatkan distribusi yang tidak merata (ketidakhomogenan

penyerap), sehingga pemisahan menjadi kurang baik (tidak sempurna).

Akibatnya terjadi penyebaran noda ketika larutan hasil kromatografi kolom di

KLT.

2. Pigmen yang keluar pertama bersama petroleum benzen adalah klorofil. Hal ini

dikarenakan klorofil dan petroleum benzen bersifat nonpolar sehingga petroleum

benzen dapat melarutkan pigmen klorofil. Kemudian disusul dengan fraksi

kloroform dengan pigmen karoten, dimana karoten dan kloroform sama-sama

nonpolar tetapi sedikit polar dibandingkan dengan klorofil dan petroleum benzen.

Sedangkan fraksi yang muncul selanjutnya adalah fraksi etanol dan disusul fraksi

metanol yang membawa pigmen xantofil, fraksi ini muncul terakhir karena

pigmen ini lebih larut dalam alkohol.

3. Teknik yang telah dilakukan berhasil tetapi hanya 1 pigmen saja yang keluar

yakni pada pelarut etanol dan metanol, seharusnya melalui fraksi-fraksi tersebut

dimungkinkan ada 3 pigmen yang muncul yaitu karoten, xantofil dan klorofil.

Namun proses pemisahannya kurang sempurna, hal ini mungkin dikarenakan:

a. Tidak dilakukannya homogenasi alumina sebagai fase diam.

b. Penambahan tiap-tiap pelarut yang secara terus-menerus tanpa menunggu

tetesan untuk fraksi pelarut tertentu itu habis.

c. Pergantian tabung reaksi untuk penampungan tidak dilakukan berdasarkan

waktu tertentu atau sampai pelarut tidak menetes lagi, melainkan berdasarkan

warna. Fraksi pigmen yang dihasilkan kurang spesifik karena mata memiliki

keterbatasan dalam menentukan warna jadi kemungkinan ada fraksi yang

tercampur.